有机废水低温菌的筛选及模拟污水处理研究 83页

'国内图书分类号：缸9’国际图书分类号：西南交通大学研究生学位论文有机废水低温菌的筛选及模拟污水处理研究年级：三Q二二级姓名：韭适申请学位：亟±专业：生塑丝堂皇公王生物堂指导教师：荭世基数援二。一四年五月 ClassifiedIndex：Q8’U．D．C：SouthwestJiaotongUniversityMasterDegreeThesisJ～●一一●ScreeningollowtemperatureresistantbacteriaandthestudyofdisposalinmimicwastewatertreatmentGrade：2011Candidate：ZhangyuanAcademicDegreeAppliedfor：MasterSpeciality：BiochemistryandMolecularBiologySupervisor：CanquanMao，professorMay,2014 西南交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1．保密口，在年解密后适用本授权书；2．不保密囤，使用本授权书。(请在以上方框内打“√”)言羹_文嚣芋?I．毪也日期：油，华．●．07U指导老师签名：日期：≯，够’j’·Ⅻ 西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下：1、通过冬季低温4-8。C环境下，经富集筛选出能在4。C环境下生长的8株低温耐受菌，单菌处理高浓度废水(COD为17763．79mg／L)的效率最高达87％，菌株混合后处理效率降低但相对稳定，处理效率最高达80％。通过分子生物学的方法从筛选菌株中扩增出维持微生物低温耐受相关的脂肪酸脱氢酶基因，利用生物信息学的手段分析不同物种中脂肪酸脱氢酶基因的分子进化关系、嗜冷菌脂肪酸脱氢酶的三维结构及活性位点的特异性。2、采用固定化微生物技术，选取两种固定化材料来固定筛选微生物进行污水处理的研究，并在此基础上筛选出污水处理效率较高的混合菌3和固定材料2的组合，此组合在15℃经6天处理污水的苯酚和COD去除率分别为70．9％和92％，而在平均环境温度20℃时3天处理后其COD去除率几乎达100％，而6天处理后最终苯酚去除率也达94．7％，较好的处理效果为其在实际环境污水处理的应用方面提供一定的可行性。本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：≥爿够年j7月≥(旧 西南交通大学硕士研究生学位论文第1页摘要据统计全国污水处理量中的80％以上所采取的技术是生物活性污泥法及其强化衍生技术，生物法处理污水受环境温度影响较大，生物法处理技术中起主要作用的活性菌株大多为环境中温菌。这类菌株在环境温度10℃以下时，其活性骤降，因此在我国冬季低温环境下，采取生物活性技术处理污水的污水处理设备其效率会受到严重影响。本研究从冬季4～8℃的环境中筛选出能在4。C环境下生长的8株低温耐受菌株，在15。C、100rpm的培养条件下研究8株单菌株分别处理高浓度废水的效果，经过6天处理后发现处理效果最好的菌株B2效率达87％、效果最差的菌株Y7达到63．40％。将筛选菌株按污水处理效率高低进行混合，测定混合菌株处理高浓度废水的处理效率，结果发现混合菌处理效率最低的为73．6％，最高为80％。混合菌在处理效率上虽不及部分单菌，在其不同混合菌处理效率之间的波动并不大。利用分子生物学方法从筛选菌株中扩增出与相关脂肪酸脱氢酶基因，采用生物信息学的手段研究多物种脂肪酸脱氢酶基因在分子进化间的关系，并揭示了嗜冷黄杆菌的铁离子结合活性位点的氨基酸位置Hisll4、GlulllGlu76、His200、Glul97、Glul64。从筛选菌株扩增出的脂肪酸脱氢酶基因中发现了其存在着HRLWSH、HRRHH、HNFHH的铁离子结合活性组氨酸区，这与多物种保守基序中发现的组氨酸活性区HxxxxH、HxxHH、HxxHH一致。从筛选菌株应用到实际污水处理的角度，利用自制10L反应池，电磁式空气泵作为鼓气装置，选用聚烯烃类的立体弹性材料及醛化纤维的生物组合填料作为固定化微生物的材料来模拟实际污水的曝气处理过程。环境平均气温15。C条件下经6天处理后发现混合菌3和材料2(醛化纤维组合材料)的COD降解效率达70．9％，苯酚去除率达92％远高于其他混合菌及固定材料组合，后经单因素废水处理效果分析，进一步确定混合菌3和材料2为最优污水处理的组合。最后在环境平均温度20℃条件下，分析混合菌3和材料2组合处理污水过程中的各影响因素，曝气下的混合菌3和材料2在2天处理后COD降解达91％，3天处理后COD降解率几乎达100％，而苯酚处理率也达94．7％，效果远好于非曝气反应池。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1I页而只投加材料2的曝气反应池COD和苯酚降解率也较为显著。经上述对于筛选出的混合菌3和材料2组合进行的模拟实际污水处理的过程，发现在20℃环境下其处理效果较好，其在15℃环境下COD和苯酚的降解率分别也能达到70．9％和92％，这也说明筛选出的菌3材料2组合在实际污水处理过程中的应用的可行性。主要结论：在低温环境下筛选出8株能在4。C下生长的低温耐受菌株，15℃下单菌处理高浓度废水(COD为17763mg／L)最高处理效率达86％，混合菌处理污水效率达80％且相对稳定。筛选并研究了固定化材料2与混合菌3组合在污水处理中的显著效果，为其在污水处理的实际应用中奠定基础。关键字：低温菌；污水处理；脂肪酸脱氢酶；固定化材料；曝气池 西南交通大学硕士研究生学位论文第1II页AbstractAccordingtotheNationalStatistics，morethan80％ofthesewagewastreatedbythebiologicalactivatedsludgetechnologyanditsderivativeproducts．Becausethiskindoftechnologymainlydependsonthebacteriumstrainswhichhavetheiroptimumreactiontemperature，SOtheyaregreatlyaffectedbyenvironmenttemperature．WhenthetemperatureisbelowIO。C，theiractivitydecreasesharply．So，inthewinterofChina，theefficiencyofsewageprocessedequipmentswhichdependedonbiologicalactivatedsludgetechnologywereaffectedseriously．Inthisstudy,wescreened8lowtemperatureresistancebacterialstrainswhoCanliveat4"Cfromthe4～8℃environmentofwinter．Bycultivatedat15*C100rpm，wetestedthesestrains’efficiencyofprocesshighconcentrationsewage．6dayslater,wefoundthatthestrainB2hadthehighestefficiency(87％)，whiletheY7strainhadthelowestefficiency(63．4％)．Allthescreeningstrainsweremixedaccordingtotheirownsewageprocessefficiency,thenwetestedthesewageprocessefficiencyofthesecombinationsstrainsinhighconcentrationsewage．Thehighestefficiencywas80％andthelowestefficiencywas73．6％．Althoughtheefficienciesofcombinationstrainswaslowerthansomepurestrains，buttheywavedslightly．Sowethoughtthecombinationsstrainsweremorefitforsewageprocessthanpurestrainsinactualenvironment．weclonedthegenesrelatedtofattyaciddehydrogenationenzymefromthose8screeningstrainsbymolecularbiologytechnology,andthenanalysisthesegenes’evolutionrelationshipbybioinformaticsmethods．WerevealedtheactivityaminoacidHisll4，Glulll,Glu76，His200，Glul97andGlul64whichcombinedbyironioninFlavobacteriumpsychrophilum。Further,wefoundtheHRRHH、HNFHHactivityHisregionwhichcombinedbyironion，whichisconsistentwiththeHxxxxH，HxxHH，HxxHHactivityHisregionfoundinotherspecies．Fortheapplicationofscreenedstains，wesimulatedtheactualsewageaerationprocessbyhomemade10Lreactionpool，whichdrumminggasbyelectromagneticair 西南交通大学硕士研究生学位论文第1V页pumpandfixingthebacteriumusingdimensionelasticmaterialofpolyolefinandaldehydefibers。Whentheaveragereactiontemperatureis150Candafter6daysprocess，thecombinationofthethirdmixedbacteriumandthematerialnumber2hadthebestperformance．ItsCODdegrationefficiencywas70．9％andphenolremovalratewas92％whichwasmuchhigherthanothercombinations．Aftertheanalysisofthesewageprocesseffectsofsingle-factors，weconfirmedthatthecombinationandthethirdmixedbacteriumandthematerialnumber2iSthebestcombinationforsewageprocess．Atthe20。Cenvironment，weanalysistheinfluencingfactorsinthesewageprocessofthebestcombination．Whenaeration，theCODdegradationratewas91％after2days，andnearlyreachedto100％after3days．Atthesametime，thephenoldegradationratealsoreachedto94．7％．Theresultwasmuchbetterthanwithoutaeration．Eventheaerationreactionpoolwhichonlyhasthematerialnumber2，itsCODandphenoldegradationratealsohasagreatimproved．Aftersimulatingtheactualsewageprocessforthebestcombinationfthetllirdmixedbacteriumandthematerialnumbertwo)，wefoundithasthebestperformanceat20"C．Eveninthe15。C．thedegradationforCODandphenolCanreach70．9％and92％respectively．Alltheseresultshowedthefeasibilityapplicationofthiscombinationintheactualsewageprocess．Conclusion：wescreened8lowtemperatureresistancebacterialstrainswhoCangrowat4"C．Bycultivatedat15。C，wetestedthesewageprocessefficiencyofthesesceenedstrainsinhighconcentrationsewage，themaximunprocessefficiencywas86％，Thehighestefficiencyofmixedbacteriawas80％andrelativelystable．Screeningandstudiedthesignificanteffectofthecombinationofthemixedbacterium3andthematerial2inwastewatertreatment，foritspracticalapplicationinwastewatertreatmenttolaythefoundation．Keywords：Lowtemperatureresistantbacterium，sewagedisposal，fattyaciddesaturase，fixedmaterial，Aerationreactiontank 西南交通大学硕士研究生学位论文第V页目录第一章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2耐低温微生物的冷适应机制及研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1耐低温微生物细胞膜的流动性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2耐低温微生物的冷传导机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．2．3耐低温微生物的相关研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．2．4低温微生物在环境中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．3固定化生物填料的发展现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4课题的研究意义与内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．4．1课题的研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．4．2课题的研究内容与目的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第二章冷适应微生物筛选与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．2材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．2．1水样来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．3COD测定所需试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．4细菌形态及分子鉴定所需材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2．4主要仪器设备(见附录1)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．3方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．3．1水样COD测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．3．2耐低温茵的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．3．3筛选污水处理能力较好的低温耐受菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．3．4混合菌株处理污水能力研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．3．5筛选出的优势菌株的形态学及分子生物学鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．4结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．4．2COD测定标准曲线的绘制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一18 西南交通大学硕士研究生学位论文第VI页2．4．1低温耐受菌分离筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．4．2低温耐受菌降解污水分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．4．3筛选菌株的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27第三章脂肪酸脱氢酶的序列及分子进化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一283．2材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．2．1分子进化分析所需材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．2．2PCR扩增脂肪酸脱氢酶材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．3．1脂肪酸脱氢酶分子进化分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3．2PCR获取筛选菌株脂肪酸脱氢酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．5结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一323．5．1PCR扩增获取△9．脂肪酸脱氢酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．5．2氨基酸序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．5．3系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．5．4保守基序分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．5．5分子建模⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．5．6分子建模评估⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．5．7活性位点分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．6讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．393．7小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一40第四章冷适应微生物污水处理工程实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯414．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．414．2材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．414．2．1重铬酸钾法测化学需氧量COD所需试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．2．2烘箱消解一分光光度法测定COD所需试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．2．3紫外分光光度法测定苯酚所需试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42 西南交通大学硕士研究生学位论文第VII页4．3方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．424．3．1重铬酸钾测定COD步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．3．2烘箱消解一分光光度法测定COD步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．3．3苯酚含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．3．4固定化微生物降解模拟污水方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．4．5电镜材料的制作方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．4结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．444．4．1COD测定标准曲线的绘制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．4．2苯酚含量测定标准曲线的绘制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．4．3最优固定化材料与微生物的组合筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯464．4．4单菌或材料投加反应池的污水处理结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．4．5微生物材料组合处理污水的因素研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．4．6固定化材料2的电镜扫描结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯514．5讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．534．6小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．65攻读硕士学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72 西南交通大学硕士研究生学位论文第1页第一章绪论1．1引言随着我国经济的快速发展以及城市化进程的加速，近年来工业污水的排放居高不下，而城市有机污水的排放也逐年增加，水环境污染越来越严重。从2005年工业污水排放量243．1亿吨到2012年的221．6亿吨，工业污水的排放量虽有少量下降，但减排量却并不明显，同时工业污水因其化学成分复杂，污水中微生物可利用的营养物低、降解困难等特点，工业污水依然是威胁水环境安全的重要因素。而城市化进程的加速，使得城市对于水资源的利用也逐步加大，而城市污水的排放量在全国污水排放量中所占的比例逐年增高，有统计表明，中国2010年的城市化程℃大约在50％，预计2020年则可能达到58％，而生活有机污水的排放量从2005年的281．4亿吨急速上涨到2012年的463．2亿吨【11，所以生活有机污水的治理将会是国家污水治理的重点。截止到2012年，全国建成投运的污水处理厂有4628座，每日平均处理污水能力约1．5亿吨，全年共处理污水416．2亿吨，而2012年全国污水排放总量为684．8亿吨，这说明2012年全国处理污水量只占到污水排放总量的60．78％，还有约废水总量的39．22％也就是约286．6亿吨的污水排放到自然环境之中，这将严重影响人们的正常生活。现今国内污水技术可以按照处理对象大致分为三类，处理工业废水的物理方法，如离心、气浮、反渗透的方法等，化学方法如离子交换、氧化还原、混凝中和的方法等，还有一种就是生物活性污泥方法，这也是城市生活污水处理的主要技术方法。污水处理技术中的物理和化学的方法针对性比较强，对于一些特殊性难降解的工业废水需采用这些方法，其缺点也比较明显，主要表现为费用高，适用范围较窄，而且造成二次污染的风险较大，技术要求较高等。相对于物理和化学方法，生物活性污泥技术以其处理效果好，管理简易，投资消耗小等优点早已被国内外所接受，而以此为基础逐步发展起来的生物强化处理工艺己成为国内外污水处理技术的主流。我国当前使用的主要污水处理技术有：传统活性污泥法、氧化沟法、间歇式活性污泥法(SBR)以及其改进后的技术、厌氧．缺氧．好氧法 西南交通大学硕士研究生学位论文第2页(AAO或A20)，而A20、SBR和氧化沟法的处理技术在国内污水处理的技术和处理能力上就占据了80％左右。随着核糖体16SrRNA分子鉴定细菌微生物技术的发展，活性污泥中起到主要作用的微生物菌群逐渐被发现，除传统分离培养发现的短杆菌属、产碱杆菌属和黄杆菌属等活性污泥中存在的优势菌属外，还发现有除磷脱氮作用的类红环菌以及固氮弧菌属【2】。这些在活性污泥中发现的功能微生物大多属于中温菌，中温菌是环境依赖性比较强的菌株，其最适生长温度在25℃到40℃之剐3|，而当环境温度一旦下降到10℃以下将对中温菌的生长及其代谢产生严重影响，此时中温菌代谢能力急剧下降，其生物学活性也将随之降低。作为活性污泥中发挥主要作用的中温菌在温度降到10℃以下时，活性急剧下降，因此当环境温度在10℃以下时，将会造成以生物法为主的污水处理效率严重下降。从环境温度来看，我国华北、东北、西北的各大城市月平均气温在10℃以下的全年就有6个月，而部分南方城市冬季月平均气温在10℃以下的也不在少数。而全国监控的污水处理厂在北方城市的就有将近1350座，虽然通过循环回流净化、冬季保暖来促进一．‘污水处理效率的提高，但其巨大的能耗依然是冬季污水治理的一大负担。综上所述，在低温环境下提高污水处理效率，降低污水处理耗能是制约污水处理能力的两大因素，温度的降低导致以中温菌为主的生物法污水处理的效率急剧下降，在温度到10℃左右中温菌几乎丧失活性，而不再是优势菌株。另外低温环境下，活性污泥本身的吸附能力随着温度的降低而下降，而吸附于其上的微生物则处于游离状态，由于温度的下降，微生物本身的活性降低其降解污水中有机物的能力也随之减弱，活性污泥也由于其吸附微生物量的减少，其降解污水的效率也迅速下降。活性污泥在低温环境下很难再生，因为温度的下降，污泥的吸附能力下降，处于游离态的微生物量增加而相互之间又不易形成新的菌胶团，从而很难生成新的活性污泥，一些寒冷地区冬季污水处理厂中活性污泥则会出现膨胀，生物活性严重下降等问题。因此，通过筛选出冬季低温环境下活性较高的环境菌株，经过进一步的优化处理，利用污水中存在的有机物生长代谢，结合现代化微生物固定技术来达到低温环境下污水处理的目的。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3页1．2耐低温微生物的冷适应机制及研究现状1887年Forster发现有微生物可以在零℃以下生长，但直到1902年嗜冷菌的概念才被提出，当时定义嗜冷菌是根据细菌的最低生长温度，最佳生长温度以及其生长温度范围，还有与温度不相关的因素，比如其必须是革兰氏阴性杆菌以及是巴斯消毒法能杀死的细菌。后来Morita[4J定义最低生长温度在0℃或0℃以下，最适生长温度在15℃，最高生长温度在20℃的微生物为耐低温或嗜冷微生物。随着分子生物学技术以及1974年MacELroy极端微生物概念的提出，对于耐低温微生物的研究也快速发展起来。1．2．1耐低温微生物细胞膜的流动性微生物细胞膜对于微生物维持自身的新陈代谢有着重要作用，细胞膜是微生物与外界环境进行物质能量交换不可或缺的要素，细胞膜通过其物质交换的功能来调整细胞内稳态，维持微生物的整个生命活性，因此细胞膜本身的流动性在其中扮演着重要角色。温度的下降会严重影响细胞的流动性，中温菌在10℃以下的环境中其细胞的流动性下降，而在5℃以下时几乎不能代谢外源物质。在低温环境下，细胞膜中不饱和脂肪酸的含量对于维持细胞膜的流动性起到关键作用，这一点得到国内外很多研究的证明。其中比较有代表性的观点是，温度的下降将引起不饱和脂肪酸含量的增加，链长变短，带甲基支链的增加以及反式异构于异构脂肪酸分支的比例增加，而所有的这些变化将导致脂质的脂酰链的减少，从而于降低了液晶态到凝胶态转变的温度【5J，来保持生物膜的流动性。不饱和脂肪酸作为细胞膜的重要组成成分，其在生物体内的形成过程的研究，对于其在维持细胞膜流动性方面非常重要，同时对于从基因工程等方法上改造微生物使其能更好的适应低温环境等方面提供一定的理论基础。生物体内脂肪酸脱氢酶催化特异性位点形成双键，不饱和键的引入也遵循着严格的顺序，如蓝藻16JSynechocystissp．PCC6803．是由△弘脂肪酸脱氢酶来催化硬脂酸，使其9号和lO号碳之间形成双键，其次由△卜脂肪酸脱氢酶或△12’脂肪酸脱氢酶在含有一个双键的不饱和脂肪酸中催化形成第二个不饱和双键，再由∞3．脂肪酸脱氢酶在12号碳上引入第三个双键。 西南交通大学硕士研究生学位论文第4页广18：0I"--18：1(9)广18：2(9．12)I-"18：3(9．12．15)卜_16：0一卜16：0一卜16；0一卜16；0bY心9’hY心12’kY心强’LxYIc㈦Jr㈨，J㈨，[----18：2(6．9)广18：3(6．9．12)厂18：4(6．9．12．15)卜16：0一卜16：0一卜-16：0kY(512)hY(515)bY图1．1蓝藻Synechocystissp．PCC6803．多不饱和脂肪酸的形成过程其中x表示碳链的长度，Y表示引入双键的个数，()中表示双键引入到碳链中的位置。Fig．1-1Polyunsaturatedfattyacidformationprocessof．cyanobacteriumSynechocystissp．ecc6803．Xrepresentsthelengthofthecarbonchain，Yrepresentsthenumberofdoublebond，0representsthepositionofadoublebondinthecarbonchain．在迄今发现的很多物种中的脂肪酸脱氢酶，如△9。脂肪酸脱氢酶都含有与非血红素铁离子结合的组氨酸保守区，有研究表明组氨酸结构区的位点突变会严重影响脂肪酸脱氢酶的催化活性。而在催化形成多不饱和脂肪酸的过程中，硬脂酸引入的第一个双键都是在9号碳和10号碳之间，如酵母SaccharomycescerevisiaeOLEl的硬脂酸经△9。脂肪酸脱氢酶催化形成棕榈酸，△9。脂肪酸脱氢酶在昆虫，线虫以及脊椎动物中也发挥着相似的作用。△9‘脂肪酸脱氢酶在多物种中是催化饱和脂肪酸形成不饱和脂肪酸的第一个双键，其催化形成的含有单个双键的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸的重要前体物质，因此△9。脂肪酸脱氢酶在多不饱和脂肪酸的形成过程中是非常重要的关键酶，其在调节生物体内不饱和脂肪酸的含量方面有不可替代的地位。1．2．2耐低温微生物的冷传导机制细胞膜作为微生物与外界环境进行相互作用的重要平台，调整膜的流动性可能是面对冷刺激的第一个适应信号，微生物通过调整细胞膜饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例来调节细胞膜的流动性【7J，但是细胞膜上面的传感元件是什么?冷刺激后下游一系列的反应又是如何发生的?这两个问题的明确阐述对于耐低温机制的研究意义重大。温度的降低引起生物膜中脂分子的分子动力学活性下降，从而导致膜的流动性下降，而膜的这种硬化有可能激活位于膜上的冷刺激信号感受器【81。为了鉴别蓝藻细胞的低温感应器，Suzuki等【91用基因沉默的方法，使蓝 西南交通大学硕士研究生学位论文第5页藻SynechocystisPCC6803的43个推断的组氨酸激酶基因(H／k)逐个沉默，最后发现位于膜上的I哳k33和一个可溶性的Hikl9以及一个响应调节元件(Rel)Rerl与低温感应相关，Suzuki的进一步研究发现Rer26与H／k33都参与到低温信号转导中。H／k33在其羧基端有个高度保守的组氨酸激酶区，氨基端则有两个跨膜结合区，一个P型接头以及中间区域的一个亮氨酸拉链结构，其中亮氨酸拉链结构在很多有机体的膜结合组氨酸激酶中存在。Mikamitl0J等推断温度降低引起的H／k33附近的膜脂固化，可能会改变H／k33的跨膜结构区的构象改变，从而使H／k33形成活性二聚体在整个冷感应系统中发挥重要作用。SzaloInai【llJ利用傅立叶转换红外色谱法测定低温环境下膜脂含量以及蛋白与膜脂肪含量比例的变化，从而探究微生物对低温适应机制。Inaba【12】，Browse和Xin[131以及Suzuki／14】贝0是通过对蓝藻SynechocystisPCC6803的H／k33基因进行沉默突变，来研究冷诱导基因在冷刺激条件下的变化，结果发现有部分冷诱导基因如hliA，hliBandsigD，在冷刺激下不在受到诱导。而另一些基因如desA，desD则不受H／k33基因沉默的影响，在冷刺激下一样能诱导表达或受影响较小，desB则不会表达。枯草杆菌的DesK和DesR[15】组成膜冷适应双信号传导系统是迄今为止发现的较为系统的一个膜感应冷信号的传导机制。研究发现DesK有四个跨膜结构域被认定为膜冷感应器，还有一个C末端的组氨酸激酶区，其中C末端的组氨酸激酶区在ATP存在的条件下自磷酸化而激活DesK，活化的DesK可以进一步使DesR磷酸化，磷酸化后的DesR作为有活性的转录调节元件直接参与到低温环境下脂肪酸不饱和酶(des)基因的激活转录。无活性的DesK和DesR则可以抑制des的低温诱导，在枯草杆菌中，DesK作为激酶或磷酸酶是由其所处的温度决定的，37。C时DesK[16】作为磷酸酶存在，而此时DesR则处于无活性的去磷酸化状态，一旦处于低温环境下，DesK催化DesR磷酸化而使其处于活化状态，活化的DesR结合与des基因的操纵子区域，上调des基因的表达。综上所述，对微生物细胞膜感受冷刺激的传导机制虽对特定的微生物细胞有一定的研究，如蓝藻细胞SynechocystisPCC6803膜上的H／k33感应冷刺激机制和枯草杆菌的双信号转到系统，但现今所发现的信号通路大多为冷刺激感应的单一通路，蓝藻细胞SynechocystisPCC6803上的H／k33就只能诱导部分的冷相关 西南交通大学硕士研究生学位论文第6页基因的表达，而像desB等冷诱导基因则不会表达，这说明有可能有其他膜上的冷刺激感应器在调节其他冷感应基因的表达。1．2．3耐低温微生物的相关研究进展1．2．3．1抗冻蛋白抗冻蛋白是一种结构多样性蛋白，不同类型的抗冻蛋白之间差异性非常大，迄今为止在鱼中发现了5种类型的抗冻蛋白【171，昆虫中发现了2种‘181，植物中则发现了6种抗冻蛋白【19抛】，而在微生物中抗冻蛋白的发现相对较晚，而且具有活性抗冻蛋白的细菌发现的较少。微生物为了维持在低温环境下的生存有很多方式，比如维持自身生物膜的流动性，保持自身的代谢活性等【23】，而在相对较低的环境下，外界和自身的水分子形成冰晶结构对细胞膜以及微生物的内部结构会造成很大的威胁，抗冻蛋白在低温环境下所起到的作用就是抑制细胞内冰晶结构的形成，阻止细胞内冰晶的重结晶能力，降低冰晶形成的温度【24"251。对于抗冻蛋白结构的多样性而其功能却相似的解释，Jia和Davies等‘261推断是由于抗冻蛋白通过与冰晶之间结合从而阻止其生长，这就有可能是冰晶形态的多样性，从而导致与其契合的抗冻蛋白结构的多变。JackA．Gilbert[271等从南极细菌中发现了Ca2+依赖的抗冻蛋白，发现这种Ca2+协同抗冻蛋白能使冰晶形成温度下降超过2度，这可能是一种新型的抗冻蛋白。JamesA．Raymond[28】等研究南极细菌发现能结合冰晶的蛋白，这种蛋白虽比抗冻蛋白和冰核蛋白分子量小，但它也具备与冰晶结合以及抑制冰晶重结晶的能力。现今随着对于低温耐受性机制的不断研究，抗冻蛋白作为微生物低温环境下维持其活性的重要蛋白，在微生物低温耐受的改造及低温保藏方面，抗冻蛋白会越来越受到关注。1．2．3．2冷休克蛋白冷休克蛋白在微生物和高等动植物中广泛存在，其是冷刺激下的重要应激蛋白，冷休克蛋白的分子量很小，大约有70个氨基酸左右。微生物和高等动植物中的冷休克蛋白都有核酸结合保守结构区，冷休克蛋白之所以能方便的与RNA，单链DNA以及双链DNA结合主要是依赖于冷休克蛋白中的核酸结合区的活性【291。 西南交通大学硕士研究生学位论文第7页微生物编码的冷休克蛋白大小在67．72个氨基酸之间的小分子蛋白，包含有一个单链的核酸结合区，在核酸结合区内还包含有两个一致的保守RNA结合基序m321，研究大肠杆菌的两种冷休克蛋白A(CspA)$1B(CspB)发现在其核酸结合区都存在着两个保守的RNA结合基序。冷休克蛋白在微生物的冷适应过程中发挥着重要作用，J．Goldstein{33】等研究大肠杆菌发现，当把在37。C培养下的大肠杆菌一下转移到IO。C或15。C时，CspA蛋白会大量表达，其表达量几乎占到冷刺激细胞蛋白总量的10％。微生物在冷刺激的情况下冷休克蛋白与RNA结合改变其二级结构，从而促进其在低温环境下的翻译效率，维持微生物自身的生理活性状态。细菌的抗冻蛋白有维持染色体结构和DNA复制的功能，如CspE和CspC的过表达可以阻止染色体的去凝缩，而在营养缺乏的情况下，发现CspD是一种新的抑制DNA复杂的抑制蛋白，其在染色体复制上也发挥重要作用【34,35】。大肠杆菌的冷休克蛋白在转录水平上可以作为反终止因子存在【36，371，如CspE的过表达使几个离启动子中远距离的几个基因过量表达，CspA、CspE和CspC都可以作为这种反终止因子存在。大肠杆菌中很多冷休克蛋白可以与RNA结合，RNA的二级结构与温度相关，在低温下RNA的二级结构阻碍蛋白的翻译，而CspA的功能是作为RNA的分子伴侣改变其低温下的二级结构。CspE能降解部分双链和发卡型结构的RNA其也可以与poly．A尾巴的mRNA结合【38。421，通过减少RNA酶来维持mRNA的稳定性。另外因其可以降解RNA，所以也同样可以影响mRNA的稳定性，尤其是CspE和CspC。冷休克蛋白作为微生物冷刺激下的应激蛋白，影响到微生物在低温环境下生存生长的各方面包括了冷适应调节过程，DNA复制以及转录和翻译过程，对于冷休克蛋白的研究虽然很多，但大多停留在存在的冷休克蛋白对于下游DNA等核酸序列及相关酶类的调节，而上游冷刺激下如何促发冷休克蛋白的表达机制等问题还有待进一步的研究阐述，冷休克蛋白对于微生物低温耐受至关重要，更深一步的阐明冷休克蛋白的作用机理及诱导冷休克蛋白产生的因素将更有利于我们了解低温微生物耐低温机制。1．2．3．3其他低温环境下的机制研究Eriksson[431等研究表明温度可以诱导DNA，RNA和蛋白质的构象或物化性质 西南交通大学硕士研究生学位论文第8页变化，低温下枯草杆菌DNA的形状和大小都没有发生变化，但却发现冷刺激下其拟核区呈现紧缩状态，这种紧缩状态可能是由于温度引起的DNA构象的改变，也可能是DNA蛋白活性或数量的改变，如DNA螺旋酶，拓扑异构酶或损伤修复酶等影响核酸构象的酶。在低温环境下DNA的构象对于基因的表达非常重要，有研究表明抑制DNA的负超螺旋结构可以抑制冷诱导基因的表达，而拓扑异构酶可以调节DNA的超螺旋构象。因此，这些DNA相关酶类通过改变DNA等核酸序列的构象来对低温应激做出适应的反应。一些细菌通过自身蛋白构象的变化来对低温刺激做出反应，如沙门菌144-46](Salmonellatyphimurium)的TlpA蛋白能感应温度的变化并调节基因的表达，嗜冷菌P．syringaeLz4w的一系列膜蛋白可以随着温度的上、下调进行磷酸化和去磷酸化【471。低温微生物在冷刺激的情况中，会做出整体的应激反应，从上述表述中发现，不论是DNA等核酸序列还是微生物的膜结构以及蛋白结构，都会在冷环境中作出适应性调整，虽然如今部分微生物在低温环境下的有相关部分做了一定的研究，但还缺乏在冷刺激下的整体耐受机制的明确阐述，低温微生物作为环境中的一个特殊存在，而其应用价值也会随着研究的持续逐步发掘。1．2．4低温微生物在环境中的应用低温环境下污水处理效率低下的问题，从环境中筛选出低温耐受性较好的有机物降解菌方面的研究在国外起步较早，L．G．Whyte[48】等分离出的红球菌(Rhodococcussp．)在O。C～5℃时能矿化降解短链烷烃类物质如十二烷烃、十六烷烃等。MohnWW【49】等从北极冻土中分离出能降解联苯的微生物，在环境温度7℃条件下，微生物能将起始浓度50mg／L的联苯污泥，按0．5．1mgm的速度进行降解，虽然降解效率不是特别好，但可以应用到持续性降解联苯污水。Master【5UJ等对降解联苯的中温菌和冷耐受菌不同温度下的降解效率进行比较，发现冷耐受菌株的降解酶系统为冷适应性的。AislabieJ【”】等从南极土壤中分离出能以污染物如萘、菲等多环芳香族有机物作为碳源和能量来源的低温耐受菌株，其中比较有代表性的菌株是鞘氨醇单胞菌和假单胞菌。国内对于低温耐受菌株的研究相对较晚，从上世纪90年代才陆续从南极、深海以及低温冻土中收集相关低温耐受微生物进行研究，孟雪型52J等在冬季低温环境下，从污泥中筛选出4株低温耐受 西南交通大学硕士研究生学位论文第9页且能降解生活污水的低温菌，且在后续的降解实验中发现其低温环境下的污水降解效率较高。李亚选【53J等从低温污水中筛选出混合菌株，通过与中温菌在不同温度环境下污水处理效果比较，结果发现其所筛选的菌株在中温环境下比中温菌的降解效率低10％，而在低温环境下其降解效率却比中温菌高60％。综上所述，低温微生物在环境净化中的作用越来越突显其优势，国内外从低温环境下所筛出的耐受菌株对于特定污水处理的效果也非常显著，但离真正应用到实际的污水工艺之中还有一段距离，究其原因发现国内外对于低温耐受菌株的研究大多局限于一种或为数不多的几种低温菌，实际污水是一个复杂的体系，其中处于优势的降解菌株也并非是一种，而是数量和种类相对较多的菌株共同起作用。另一方面对于筛选出的菌株在实际污水处理中所发挥的效用，筛选菌株的稳定性以及持续性降解污水的能力等方面的研究还比较少。随着低温微生物在低温环境下其独特的优势，其应用范围会越来越广泛，利用低温微生物来解决环境问题将非常有前景，而生物技术的不断发展，通过对环境中筛选出的优势低温菌株进行优化改造，使其能在实际污水处理中达到较高的处理效率，在低温环境下具有更大的生物活性。随着微生物固定化技术的不断发展，利用固定化技术使低温菌耐受污水能力及低温能力更强，其持续性降解污水的能力更为突出，固定化技术与低温微生物的结合将会成为低温环境下污水处理的一大突破口。1．3固定化生物填料的发展现状固定化微生物技术发展与上世纪的七十年代，因其独特的污水处理优势而迅速发展起来。相较于传统污水处理技术，固定化微生物技术具备特定区域优势微生物富集量大从而能有效的处理污水中有机物，处理时间短效率高，微生物在污水中的稳定性好，污水处理过程中产生的污泥少等优势。微生物固定化污水处理技术在国内外的研究中发现，经固定化的微生物更能耐受高浓度的污水，而且对于高浓度污水的处理效果比游离微生物处理效果要好。叶正芳【54】等通过处理高浓度的焦化废水研究发现，采用经处理后的大孔功能化固定载体(FPUFS)，如含有羟基、酰胺基等功能基团，来固定微生物处理高浓度有机废水，结果显示在微生物生长较大的温度与pH范围内固定化微生物的处理效果都较游离微生物好。刘和【55】等利用活性炭，聚乙烯醇和经苯酚驯化好的活 西南交通大学硕士研究生学位论文第10页性污泥制成固定化微生物小球来降解高低两种不同含量的苯酚污水，结果发现经固定化的微生物能在2148．Omg／L的高浓度苯酚溶液中生存降解效率能达到50．1％，而在180．7mg／L的低浓度苯酚溶液中的降解率达到89．1％，这都要优于游离的活性污泥中微生物的处理效果。国外Alejandro[56J等利用藻酸钙固定筛选出的绿藻细胞Scenedesmusobliquus和Chlorellavulgaris来处理氮磷含量较高的城市生活污水，结果显示48小时处理过后氨氮去除率达到90％以上，而磷的去除也达到85％污水中大肠杆菌类的去除率则能达到95％。Anjalil57J等利用藻酸钙固定化假单胞菌sp．USl来对污水中的一氯苯甲酸和2，4．D进行降解研究，结果发现在污染物浓度比较高的情况下经固定化的sp．USl比游离态的sp．USl去除率高10～15％。表1．1根据固定化技术固定微生物的方法可以将其分为三个种类Tablel-lbasedonafixedmicrobialimmobilizationmethodscanbedividedintothreecategories由上述图表可以看出，当前所使用的固定化方法都各有利弊，包埋固定微生物方法利用高分子聚合物内部的网格结构，将微生物细胞固定在材料内部的网格内而不直接与污水进行接触，而微生物细胞所作用的底物也可以通过网格进入，从而使微生物细胞可以作用于底物达到降解污水的目的。目前使用的包埋材料主要有天然高分子材料如海藻酸钠、海藻酸钙、琼脂等，还有一类为人工合成的高分子材料如聚丙烯酸酯、聚乙烯醇等。天然的高分子包埋材料具备对固定化细胞无伤害，能充分保持微生物活性，固定生物量大等优点，但其本身也有在特定条件下不稳定，易被微生物降解等缺点。交联法是固定微生物技术是利用功能性试剂如：戊二醛、苯酚甲醛树脂等，使微生物细胞或酶之间进行相互连接在一起而达到固定化目的。交联法因具备较好的稳定性，其固定化效果较好等优点，而使其在污水处理中能反复利用，但交 西南交通大学硕士研究生学位论文第11页联法因使微生物细胞通过自身功能性物质进行交联固定，在交联的过程中有可能导致某些特定微生物的活性受到影响，而且交联试剂因为其自身材质的价格，也为工程化的普遍使用带来挑战。吸附法是目前固定微生物方法利用最为普遍的一种固定化技术，它是利用物理或化学等的方法将微生物固定到固化材料上。常用的吸附固化材料如：活性炭、多孔玻璃珠、硅胶、陶粒等，因其价格便宜、对微生物的活性影响小、操作简便、适用性好等特点而被广泛使用，但这种固定化材料有其自身的缺点如反复利用性差、对微生物的固定量小、稳定性不好以及非优势菌株也可以富集从而影响其实际处理效果等。综上所述，固定化微生物技术在虽因其独特的优势，相对于传统污水处理技术，其具备微生物富集密度高，污泥量小避免传统方法处理后泥水难以分离的问题，耐受性好能处理毒性物质含量较高的污水，处理效率高等优点，但也因其自身的足多局限性而一直处于实验室研究阶段。目前对于固定化技术方法的研究多是对单一菌株的固定化，或者是单一材料对特定污水进行处理的研究，而不论是城市生活污水还是工业污水，其本身物质的复杂性都是对单一菌株或单一固定化材料的冲击，因此固定化技术的普遍使用还亟需考虑以下问题：1、从材料本身来讲，需要其稳定性好，价格低廉，固定化过程中能不影响微生物活性，固定化效率高。2、从固定化对象来讲，面对复杂的污水环境，从多种微生物联合治理的角度，配合固定化技术来达到污水处理的效果，单一菌株在实际污水处理中风险太大，实际污水处理也很难达到理想效果。3、多种材料的同时使用，如上述中在吸附性材料的基础上，使用交联材料等，因各类型的吸附材料各有利弊，混合材料的配合使用来固定化微生物也是很有前景的。4、新型固定化材料的研制，以及当前材料的化学处理，如烷基化、芳基化等增加材料与微生物之间的结合性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第12页1．4课题的研究意义与内容1．4．1课题的研究背景随着环境问题的日益加剧，水环境污染作为环境污染的一大部分对人们的日常生活乃至整个自然环境的威胁越来越严重，而当前对于水污染的治理主要采取是生物氧化池的方法，冬季低温环境下对于以中温菌为主生物氧化活性造成剧烈的影响，大大降低了污水的降解效率。当前为提高低温环境下增加污水处理效率，主要是通过降低污泥的处理负荷，增加污水回流频率，延长污水的处理时间还有就是冬季污水处理保温措施等高能耗，高运行费用的手段来解决，虽在一定程度上能提高污水处理效率，但起效甚微。国内外虽有对低温微生物的报道，但大多局限于低温微生物的耐低温机制的初步探究，或是单一菌株处理特定废水的实验性研究，以及低温微生物在低温保存等方面的应用研究，迄今为止少有系统且卓有成效的对于多种混合微生物处理污水方面的研究报告。本研究通过低温环境下筛选出的多株微生物，进行混合微生物处理污水的研究，而且从固定化微生物处理污水的角度对所选用的固定化材料固定混合菌株处理污水的研究。1．4．2课题的研究内容与目的本课题通过从冬季环境温度4～8℃的环境中筛选出8株适应低温的菌株，经过进一步的污水处理效率筛选及固定化材料固定微生物处理污水等方面的研究，从而来寻找出实际低温环境下较为有效的处理污水的途径。(1)在冬季低温环境下，从污水处理厂的生化反应池中，通过富集培养低温筛选的方法筛选出能适应低温的微生物菌株。(2)将筛选出的低温菌株逐个测试其在相对低温环境下处理废水能力，根据处理效果，进一步测定混合筛选菌株处理污水的能力，并对筛选菌株进行形态及分子生物学鉴定。(3)通过分子生物学手段扩增筛选菌株的脂肪酸脱氢酶，并利用生物信息学的方法探究脂肪酸脱氢酶在不同物种中的序列差异性、分子进化关系以及其活性位点差异性等，为进一步了解微生物的耐低温环境机制及通过基因工程手段 西南交通大学硕士研究生学位论文第13页改造低温菌并应用于低温污水处理方面提供一定的理论依据。(4)选用固定化微生物材料，通过模拟实际污水处理过程中生物反应池，探究经固定化混合微生物菌株在模拟生物反应池中处理污水的效率，筛选出处理效率较好的生物材料和混合菌组合，为其在实际污水处理中的应用奠定基础。 西南交通大学硕士研究生学位论文第14页第二章冷适应微生物筛选与鉴定2．1引言如前所述，当前污水处理技术的主题依然是依赖于污水中活性微生物对污染物的降解，不管是现今采用较为普遍的R20、序批式活性污泥法(SBR)、氧化沟法，还是当前发展较快的MBR方法。温度的下降对于中温菌的活性影响巨大，当温度在10。C以下时，中温菌的代谢将收到严重影响，而目前所采用的污水处理技术中发挥作用的微生物大多为适应中温的微生物，因此温度的下降对于污水处理的效率的影响至关重要。为提高低温环境下污水处理效率，在低温环境下活性较高的冷适应微生物的筛选将非常重要。为筛选到活性较高的冷适应微生物，选定成都冬季10℃以下的环境中，从成都爱思特制药有限公司的污水处理厂采取水样，分别从发酵池、厌氧池、曝气池中采取水样。经分离筛选获得活性较高的8株冷适应菌，并对其进行分子生物学和生理生化鉴定以及其污水处理能力的研究。2．2材料2．2．1水样来源水样采自成都爱思特制药公司的污水处理池，分别从废液池、厌氧池以及曝气池中采取适量水样。时间为2012年12月10号，温度4．-一8。C。2．2．2培养基◆LB液体培养基(1L)：酵母提取物59，氯化钠109，蛋白胨109，溶于适量水中混匀，定容至1L后，高压灭菌后4。C保存备用。◆LB固体培养基(1L)：酵母提取物59，氯化钠109，蛋白胨109，琼脂粉159，分装灭菌4℃保存备用。◆废水培养基：取自污水处理厂的灭菌污水与LB液体培养基按(9：1)的比例配制而成。 西南交通大学硕士研究生学位论文第15页2．2．3COD测定所需试剂2．2．3．1重铬酸钾法测化学需氧量COD所需试剂◆重铬酸钾标准液：称取12．2589重铬酸钾溶于水中，移入1000mL容量瓶，稀释至标线后混匀。◆．试亚铁灵试剂：取1．4859邻菲哕啉、0．6959硫酸亚铁溶于水中，稀释至100mL，存储于棕色瓶中。◆硫酸亚铁铵标准溶液：称取39．59硫酸亚铁铵溶于适量水中，缓慢力H／X．20mL浓硫酸，冷却后加水于1000mL容量瓶摇匀定容。◆硫酸—硫酸银溶液：在500mL浓硫酸中加入59的硫酸银，静置1．2天使其溶解。◆粉末状的硫酸汞。2．2．3．2消解一分光光度法测定COD所需试剂◆邻苯二甲酸氢钾标准液【58】：称取邻苯二甲酸氢钾2．12749，溶解于250mL水中，定容至500mL，摇匀后常温贮存，此溶液标准COD值为5000mg／L。◆重铬酸钾消解液：称取恒重的重铬酸钾24．51549溶T"600mL水，之后缓慢加入100mL浓硫酸，冷却后移于1000mL容量瓶，加水定容。◆硫酸—硫酸银溶液：在500mL浓硫酸中加入59的硫酸银，静置l-2天使其溶解。◆硫酸汞溶液：称取489硫酸汞分次溶解-T200mL硫酸中。2．2．4细菌形态及分子鉴定所需材料◆结晶紫染色液：29结晶紫溶于20mL95％7,醇与1％草酸铵溶液80mL混匀过滤。◆碘液：0．339碘，0．669碘化钾，蒸馏水100mL棕色瓶保存。◆番红染色液：2．59番红，95％乙醇100mL，溶解后存于棕色瓶。◆通用上游引物5’．AGAGTTTGATCCTGGCTCAG．3’下游引物5’．TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3；由筛选出的8株菌经试剂盒提取的基因组作为模板，PCR所需的酶，缓冲液，dNTP等由TaKaRa公司提供。 西南交通大学硕士研究生学位论文第16页2．2．4主要仪器设备(见附录1)2．3方法2．3．1水样COD测定方法2．3．1．1重铬酸钾法测COD(1)在250mL磨口三角瓶中加入0．49硫酸汞固体粉末，10mL水样，5mL重铬酸钾标准液及数粒玻璃珠，连接冷凝管并从其上口缓慢加入15mL硫酸．硫酸银溶液，摇匀后加热回流2小时。(2)室温冷却后，加50mL一次纯水冲洗冷凝管壁，取下三角瓶。(3)加入3滴亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵溶液滴定，至溶液颜色到红褐色为止，记下标准溶液用量。(4)CODCr(mg／L)=(V0-V1)xCx8x1000／V，其中C为硫酸亚铁铵标液的浓度；V0为滴定空白硫酸亚铁铵标液用量；V1为滴定水样时硫酸亚铁铵标液用量；V为水样体积；2．3．1．2消解分光光度法测COD(1)将配置好的标准COD原液稀释为50mg／L、100mg／L、200mg／C、400mg／L、600mg／C、800mg／L、1000mg／L的标准溶液各lmL加入到消解试管中。(2)之后加入O．5mL的预装混合试剂(重铬酸钾消解液：硫酸汞=2：1)和2mL硫酸一硫酸银溶液于消解管中混匀后放入165℃的烘箱中消解20分钟。(3)消解过后，温度降至120"C，拿出消解管混匀室温冷却。(4)按COD含量从低到高测定其在OD600下的吸光度值，绘制COD．OD600的标准曲线。(5)根据绘制的标准曲线测定水样的COD含量。2．3．2耐低温菌的筛选(1)分别取废液池、厌氧池以及曝气池废液，采用稀释涂平板法，铺fl；ULB固体平板上，置于4℃培养箱中培养。(2)观察微生物的生长情况，挑取40C环境下长势较大，颜色形态各异的菌落。(3)置于5mLLB培养基中富集培养，培养条件：100rpm，15℃，待菌液OD值 西南交通大学硕士研究生学位论文第17页0．4～0．6时，取5001al茵液加到500pl30％甘油中混匀，低温预冷后放入．70度冰箱保存。(4)取上步富集菌液10091)J1]),,至lJ50mL废水培养基中培养，条件：100rpm，15。C，测定各菌株的生长情况，绘制生长曲线，筛选出低温耐受较好的菌株。2．3．3筛选污水处理能力较好的低温耐受菌(1)将上述筛选出的低温耐受较好的菌株，划线挑取单克隆后置于5mLLB液体培养基中富集培养。(2)取上述富集培养的菌液1009l转接于50mL的废水培养基中培养，测定菌株生长情况以及COD降解情况，从而筛选出污水降解能力较好的低温耐受菌株。2．3．4混合菌株处理污水能力研究(1)将上述筛选出的细菌按照COD降解效率从高到低依次进行排序，从降解效率最高的前2株菌，前3株菌依次到全部的菌株法分别进行混合，进行混合菌株污水处理状况分析。(2)将筛选出的低温耐受菌划线挑取单克隆后于5mLLB液体培养基中富集培养。(3)取富集培养的菌液等比例混合，按投菌量0．5％的比例加入到50mL的废水培养基中，培养条件：100rpm，15。C。(4)测定含混合菌株的废水培养基COD降解情况，分析混合菌株处理污水效率。2．3．5筛选出的优势菌株的形态学及分子生物学鉴定2．3．5．1革兰氏染色法(1)取109l待检样品滴在干净载玻片中央，涂布成均匀薄层且涂布面不宜过大。(2)将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，在酒精灯焰高处微加热干燥，使水分蒸发而不使标本变形。(3)标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2．3次，共约2．3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不宜过烫(不超过60。C)，放置待冷后，进行染色。(4)在涂片上滴加1．2滴结晶紫溶液，并使其覆盖图片，染色1分钟。(5)用自来水小量冲洗至水呈无色为止。(6)吸取适量碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约lmin。 西南交通大学硕士研究生学位论文第18页(7)用自来水小量冲洗至水呈无色为止。(8)使用95％7,醇滴加至流出的乙醇无色为止，随即水洗。(9)滴加番红复染，染色时间3-5分钟。(10)用自来水小量冲洗至水呈无色为止，吸水纸吸掉水滴后晾干。2．3．5．216SrDNA法鉴定筛选出的优势菌株(1)将保存好的菌液划线挑取单克隆，加入到5mL的LB液体培养基中摇菌过夜富集培养。(2)取1．5mL的菌液12000rpm离心30s，弃上清，得到离心菌体。(3)按照试剂盒说明，完成整个细菌基因组提取过程，将提取的基因组放在一20。C保存。(4)根据细菌16SrDNA的保守性序列，由上海生工合成引物。(5)按照设计的引物，进行PCR扩增，得到相应扩增产物后，切胶纯化后送往上海测序。(6)根据测序结果，在NCBI数据库中进行核酸BLAST同源比对分析，鉴别微生物种类。2．4结果2．4．2COD测定标准曲线的绘制硫酸亚铁铵溶液标定：吸取5．00mL重铬酸钾溶液放入250mL的锥形瓶中，加纯水50mL，然后加入15mL浓硫酸，摇匀后静置。待冷却后加入几滴试亚铁灵指示液，再用硫酸亚铁铵溶液进行滴定，当溶液颜色变为红褐色时就是滴定终点。硫酸亚铁铵标定浓度为0．0933mol／L表2．1纯水消耗硫酸亚铁铵量R出le2．1ferrousammoniumsulfateamountofwaterconsumed 西南交通大学硕士研究生学位论文第19页表2．2邻苯二甲酸氢钾组消耗硫酸亚铁铵量Table2-2potassiumhydrogenphthalategroupconsumedamountofferrousammoniumsulfate纯水平均消耗的硫酸亚铁铵量Vo=12．8mL得出稀释后的邻苯二甲酸氢钾消耗硫酸亚铁铵量V1=6．27mL。由COD测定公式可得所配置的邻苯二甲酸氢钾溶液的COD约为4869mg／L。重铬酸钾法测定废水培养基COD为17763．79mg／L。将所配置并测定COD值的邻苯二甲酸氢钾溶液分别稀释成48．69mg／L97．38mg／L194．76mg／L389．52mg／L584．28mg／L779．04mg／L973．80mg／L。从稀释好的溶液和纯水中分别取lmL，加入4．0mL硫酸银．硫酸溶液，充分混匀后，将试管和空白对照管放入试管架，一并放入预热到165℃的烘箱中，消解20分钟后调节烘箱温度，当温度降至120℃时，取出试管进一步冷却至室温，分别将溶液加入比色皿用分光光度计测定600nm波长下的吸光度值。表2-3标准溶液的测定数据R出le2．3standardsolutionmeasurementdataresults下：根据上表作图，绘出溶液COD值与经消解后的OD值的二元线性关系图如 西南交通大学硕士研究生学位论文第20页v：4428．1x·3．9685酽=0．99750U．U，U．1口．3．5U．Z口．Z，OD600(A)图2．1溶液COD与消解后600nto下吸光度值之间的线性关系Fig。2-1thelinearrelationshipbetweenthesolutionCODvaluesandthe600nmabsorbancevaluesofdigestionsolution由上图可以得到稀释标准COD值与OD600之间的线性关系为y=4428．1x一3．9658，R2=0．9975，其中Y表示COD值，X表示波长600nm下的吸光度值。2．4．1低温耐受菌分离筛选根据4。C培养下的平板上，各菌落的形态、大小、颜色的差异，从原液废水铺制的平板中挑取10个单菌落分别标记为：01--010，曝气池废水铺制的平板中挑取9个单菌落标记为：B1～B9，厌氧池废水铺制的平板中挑取10个单菌落标记为：Y1～Y10。为进～步研究挑取的微生物在相对低温下的生长情况，将挑取的单克隆在5mL的LB液体培养基中富集之后，取100I．tl加入到50mL的废水培养基中15。C，100rmp摇菌，绘制各菌株的生长曲线，挑取长势较好的菌株。∞撇啪枷瑚^《9￡一oou 西南交通大学硕士研究生学位论文第21页j：’-"-．．(r、j图2-2细菌生长曲线Fig．2-2Bacterialgrowthcurve由上述29株菌在15。C条件下的生长状态分析，原液池废水挑取的菌株中05、06、07在培养3天后其菌液浓度较大，说明其生长速度要优于其他菌株，而在培养5天过后基本趋于稳定期，且持续时间相对较长，低温环境下稳定期较长的菌株对于污水处理非常重要。厌氧池废水挑选的菌株中Y4、Y7、Y10在培养3天后其菌液浓度明显较高，且随着培养时间的增加这三株菌的长势也较其他 西南交通大学硕士研究生学位论文第22页菌要好，说明其有相对较好的低温下生长能力。曝气池中挑取菌株中经过两天培养后的菌液浓度相差不大，其中B2、B6随着培养时间的增加其菌液浓度相比其他曝气池中挑选菌株的菌液浓度要大，说明其此温度条件下由相对较好的适应性。综上所述，从29株菌种挑选出05、06、07、Y4、Y7、Y10、B2、B6，8株菌进行进一步的低温环境下污水降解研究。2．4．2低温耐受菌降解污水分析2．4．2．1单菌处理污水效果分析将保存的05、06、07、Y4、Y7、Y10、B2、B6菌株分别划线富集培养后，取1009l菌液投入到50mL的废水培养基中，100rmp，150C条件下培养，每天测定菌株生长情况及污水COD变化。一■一菌谪OD600一■一蒂淹0D600123456处理时间(天)05j500030j4000。30002．51200041000!00002O9000吾乏86"00占吾157000蚕昌6000uo10500040003。00O52000·oooo123456处理时闻(天)B6t5000^4000t30。O‘2000‘1000—0000∈9000．≥o8C,008500。4∞03∞0150,901400013∞O12∞O”o。O1∞00900D蔷80。0兰凸7000o8。。c5㈣40。o300c2000100。=；拍如”仙¨∽(v】00∞oo帖∞舢姗¨他”¨：宝¨∞(v—oo∞Do 西南交通大学硕士研究生学位论文第23页一-一菌液OD600一·一苗液OD600处理时间(天)0712345678处理时间(天)Y10123456处理时间(天)Y4123456处理时同(天)Y7图2．3废水中菌浓度及废水COD的变化曲线Fig．2-3thecurveofchangesbetweenbacterialconcentrationandtheCODvalueinwastewaterdEoU由图2．3可以看出随着菌液浓度的增大到趋于恒定，污水中COD值呈现一定的负相关而逐渐降低，除Y4、Y7的生长趋势还未到稳定期外，其余菌株在培养3～4天时间后都能达到稳定期。05、06、07、Y10、B2、B6随着处于稳定期的时间增加，其COD降解量都有明显下降，B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7培养6天后各菌株的最终COD降解率分别为87％、85．50％、82．70％、82．20％、81．50％、77．70％、76．20％、63．40％。抽仙¨一《一00900一]／口cJJooo柚¨"一《)|8昌O一]『曲￡一凸ou鸺¨∞¨拍¨加(v—009ao(v—00900 西南交通大学硕士研究生学位论文第24页2．4．2．2混合菌处理污水效果分析按照各菌株降解污水效率的高低依次排序为：B2_Y10—05_07_Y4一B6_06_Y7，B2、Y10作为混合菌l，B2、Y10、05为混合菌2，B2、Y10、O5、07为混合菌3，B2、Y10、05、07、Y4为混合菌4，B2、Y10、05、07、Y4、B6为混合菌5，B2、Y10、05、07、Y4、B6、06为混合菌6，B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7为混合菌7。将这7组混合菌按0．5％的投菌量分别加入到50mL的废水培养基中，培养条件100rpm，15。C，培养6天后测定混合菌株降解废水能力。表2．4混合菌株处理污水效果Table2-4Effectofsewagetreatmentbymixedstrains 西南交通大学硕士研究生学位论文第25页2．4．3筛选菌株的鉴定2．4．3．1革兰氏染色镜检结果采用革兰氏染色法对筛选出的8株菌B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7进行染色后，显微镜下如图2-4所示：鬻菱豢鍪◆鬻鬻3·慧≤誊麓≤≥誊霉≥滋一!荽辫]．整一j：o囊趣蛰≤冬蠡．，¨：-．．p2th．，一， 西南交通大学硕士研究生学位论文第26页2．4．3．2分子生物学鉴定结果为进一步鉴定筛选出的微生物类别，采用分子生物学16SrDNA的方法，提取筛选菌株的基因组序列，通过PCR扩征出筛选菌株的16SrDNA保守序列，纯化后直接测序，将测序结果在NCBI数据库中进行同源比对来鉴别微生物。MR7Y1nn6Y4V7n，n7图2．5筛选细菌基因组提取结果Fig．2-5ScreeningbactedalgenomeextractionresultsB6Y7H05B20607Y10Ml上lJIlIl图2．616SrDNAPCR扩增结果Fig．2·616SrDNAPCRamplificationresultS—一2000bp—一1500bp——◆100。bo—一SOObp 西南交通大学硕士研究生学位论文第27页扩增出1拘16SrDNA片段大小在1000bp-1500bp之间，BLASTL卜,对分析结果如下：表2．5筛选菌株16S序歹IJBLAST结果Table2-5BLASTresultsofScreeningbacterial16Ssequences由表2．5比对结果发现除菌株06、Y7为环境野生菌，根据革兰氏染色镜检结果Y7应该为环境放线菌，菌株B2为弗氏柠檬酸杆菌，其余Y4、05、07、Y10、B6菌株都属于气单胞菌属。2．5小结(1)在冬季低温4～8℃环境下，从污水处理池中富集筛选出8株能在4。C下生长的耐受菌株。(2)15"C，100rpm的培养条件下，筛选菌株B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7单菌处理高浓度废水(COD为17763．79mg／L)的处理效率分别为87％、85．50％、82．70％、82．20％、81．50％、77．70％、76．20％、63．40％。(3)将筛选菌株按污水处理效率高低进行混合，进一步测定混合菌株处理高浓度废水的处理效率，结果发现混合菌处理效率最低的为73．6％，最高为80％，虽处理效率不及部分单菌，从整体稳定性来讲，混合菌处理效率虽有差异，但相对比单菌稳定，因此从面对实际污水处理角度，混合菌更能适应环境污水处理。(4)对筛选菌株进行形态及分子生物学鉴定结果发现，8株筛选菌株中有6株为革兰氏阴性菌，1株放线菌，1株革兰氏阳性菌，这也符合污水处理中主要活性菌株为革兰氏阴性菌的事实。 西南交通大学硕士研究生学位论文第28页第三章脂肪酸脱氢酶的序列及分子进化3．1引言多不饱和脂肪酸是生物膜的重要组成成分，在维持细胞膜的流动性与低温适应性中起到重要作用。本章以低温微生物嗜冷黄杆菌为对象，主要采用多重序列比对、同源建模、模型评价等生物信息学技术与方法，分析与研究了多不饱和脂肪酸代谢重要相关蛋白脂肪酸脱氢酶的序列组成与基序特征、系统进化与重要活性位点中心，模建并高评分地获得了其三维空间结构。系统发育分析表明，嗜冷黄杆菌等低温耐受菌与植物类物种的脂肪酸脱氢酶的分子进化关系较近，而与其他细菌的分子进化关系较远。多序列基序分析显示，多数物种含有HxxxxH、HxxHH和HxxHH等3个组氨酸保守区，为二Fe离子结合区。Swiss．Model对嗜冷黄杆菌的脂肪酸脱氢酶进行的同源建模及其模型分析发现，其也具备与Fe离子相互作用的活性区，与Fe离子直接作用的活性位点有Hisl14、Glul11、Glu76、His200、Glul9、Glul64，嗜冷黄杆菌的脂肪酸脱氢酶有异于其它细菌的特异性。这从某种程度上揭示，相对于常温菌而言，低温耐受菌可能存在着低温相关蛋白酶的序列乃至功效上的差异。本研究对于深入了解细菌耐低温机制，低温相关蛋白差异性分析及改造与应用均有重要的意义与价值。不饱和脂肪酸是生物膜的重要组成成分，同时也是生物体内信号传递、能量储备的前体物质，对于维持生物体的正常运行起到不可替代的作用。脂肪酸去饱和酶可以催化生物体内饱和脂肪酸的去饱和，根据作用底物的不同可以分为三类：分别为酰基载体蛋白去饱和酶、酰基．脂去饱和酶和酰基辅酶A去饱和酶㈣。△9．脂肪酸脱氢酶催化饱和脂肪酸链9和10位碳原子间碳碳单键形成双键，催化形成单不饱和键的脂肪酸是多不饱和脂肪酸的前体物质，很大程度上决定了多不饱和脂肪酸在生物体内的相对含量，从而影响整个生物体的生命状态。细胞膜中膜脂的含量决定着细胞膜的流动性，低温条件下，多数微生物通过改变膜脂中的多不饱和脂肪酸含量来维持细胞膜的流动性。Weinstein[60】等的研究表明，低温条件下培养部分真菌菌株，其细胞膜中多不饱和脂肪酸(PUFAs)的含量会增加，其中长孢被孢霉(mortierellaelongata)会合成十八碳四烯酸，后者主 西南交通大学硕士研究生学位论文第29页要存在于低温环境下的微生物中。Wada[611等使蓝藻脂肪酸脱氢酶(desA)-突变失活，改变了其细胞膜磷脂组成，使其在环境温度22。C时生长明显变缓，进一步把低温耐受蓝藻Synecho．cystisPCC6803的脂肪酸脱氢酶基N(desA)导入到对低温敏感的蓝流tnacystisnidulans中表达，结果增加了该冷敏感蓝藻的低温耐受能力。陆合㈣等通过低温胁迫根霉R31．6，发现其抵抗低温胁迫的主要机制是通过增加膜上不饱和脂肪酸的含量，以此来保证低温下膜的流动性。于爱群【63】等研究低温对于高山被孢霉(Mortierellaalpina)Oi勺A6-脂肪酸脱氢酶、△12．脂肪酸脱氢酶、∞3．脂肪酸脱氢酶3种脂肪酸脱氢酶的影响，结果发现低温能激活高山被孢霉的3种脂肪酸脱氢酶的基因转录。嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)是一种在低温环境下生存的极端环境微生物，其温度生长范围在4"C～25℃，最适生长温度在21℃。不饱和脂肪酸的相对含量对于细胞膜的流动性起到重要作用，而△9胡旨肪酸脱氢酶(DES)又是多不饱和脂肪酸合成的关键酶，因此DES在低温环境下的活性状况对于嗜冷黄杆菌的新陈代谢将非常关键。虽有不同物种脂肪酸去饱和酶研究的多个报道，但对于嗜冷黄杆菌的脂肪酸去饱和酶的三维结构解析以及蛋白序列结构中的活性位点分析却未见报道。本研究利用生物信息学的技术与方法对嗜冷黄杆菌DES的序列组成与理化特性、跨膜和功能结构区、系统发育、保守基序、三维结构特征和活性位点等进行分析，为后续深入研究细菌耐低温机制及应用奠定基础。3．2材料3．2．1分子进化分析所需材料◆嗜冷黄杆菌DES序列来自于NCBI中Protein数据库(登录号：YP001294991．1)，模板序列来自于PDB数据库(登录号：lOQ9)，用于系统发育及保守基序分析的序列均来自于NCBI中Protein数据库。◆在NCBI蛋白数据库中检索出不同物种的DES蛋白序列24个，分别为黄杆菌属(Flavobacteriumfrigoris，wP_007136780．1)、黄杆菌属(FlavobacteriumpsychrophilumJIP02／86，YP_001294991．1)、鲍氏不动杆菌属(AcinetobacterbaumannifOIFClll，EKP44864．1)、互生平胞杆菌(Alteromonasmacleodiistr"BlackSea 西南交通大学硕士研究生学位论文第30页JJ：YP一006826131．1)、淀粉丝菌(．4mylomycesrouxiLAAB82294．1)、拟南芥口，abidopsisthaliana，AEE27937．1)、PolysphondyliumpallidumPN500(PolysphondyliumpallidumPN500，EFA75230．1)、CapsasporaowczarzaMATCC30864(XP一004364396．1)、网柱菌(DictyosteliumdiscoideumAX4，xm_636528．1)、播娘蒿属(Descurainiasophia,ABS86965．1)、弗朗西斯菌属(Francisellacfnovicida3523，YP_005824683．1)、伽玛变形菌属(gammaproteobacteriumIMCC3088,WP_009574453．1)、柯柯豆毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae，ABQ00180．1)、被孢霉菌(Mortierellaalpina,ADE06659．1)、亚硝化螺菌属(NitrosospiraSP．APG3，CCU63342．1)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus，ACQ73330．1)、核腔菌属(尸yrenophoratritici—repentisPt-lC—BFP,EDU49212．1)、蓖麻(Ricinuscommunis，EEF44805．1)、蔷薇属(Rosahybridcultivar,BAA23136．1、管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis,AEB96387．11、土拉热弗朗西斯菌(FrancisellatularensissubsP．tularens括T10902，YP一005317387．1)、梭孢壳属(ThielaviaterrestrisNRRL8126,AE066985．1)、油桐属(VerniciafordiLADC80920．1)、unculturedmarinegroupHeuryarchaeo纪(EHR76326．1、。3．2．2PCR扩增脂肪酸脱氢酶材料PCR扩增模板为实验室筛选的低温耐受菌株07的基因组，引物为△9．脂肪酸脱氢酶保守结构区设计而成，由上海生工合成，PCR所需的酶，缓冲液，dNTP等由TaKaRa公司提供。3．3方法3．3．1脂肪酸脱氢酶分子进化分析方法使用ProtParam(http：／／web．expasy．org／protparamO、ProtScal(http：／／web．expasy．org／protscale／)、PSORT(http：／／psort．hgc．jp／)、Tmpred(http：／／www．ch．embnet．org／software／TMPRED_form．htmL)、InterProScan4(http：／／www．ebi．ac．uk／Tools／pfa／iprscan／)对目标蛋白序列DES进行氨基酸序列分析；应用ClusmlX软件进行蛋白序列的多序列比对，MEGA4．1构件系统发育树；利用Weblogo(http：／／weblogo．berkeley．edu／logo．cgi)分析不同物种中脂酰去饱和酶的保守基序；DES的三维结构由Swis 西南交通大学硕士研究生学位论文第31页s．Model(http：／／swissmodel．expasy．org／)同源建模完成，使用PROCHECK、Verify3D(http：／／nihserver．mbi．ucla．edu／SAVES／)对构建的模型进行评价；Swiss-PdbViewer用于显示和分析三维结构模型。3．3．2PCR获取筛选菌株脂肪酸脱氢酶(1)通过NCBI检索△．9脂肪酸脱氢酶序列，经比对分析后选取保守结构区设计上下游引物：上游引物5’．GCCGATTGGCGGTCTTTT．3；下游引物5"-CTGAAAGGAACCGAGTGAG．3：(2)PCR反应：0．2mLPCR管中加入(50“l体系)：成分用量1OxPCRBU丘．erdNTP(2．5mM)M92+f2．5mM)正向引物．‘反向引物模板Taq酶(5U／91)灭菌水59l49l39llgl29lO．259l加至509l将酶置于冰盒最后加入，整个实验操作过程在冰盒上进行，将反应体系混匀，进行下列循环：94。C3min，35cycle(94。C40s，57。C2min，72。C5min)，72。C10min。电泳纯化目的片段，回收后送至上海生工进行测序，测序结果利用BLAST在NCBI数据库中进行同源性对比分析。 西南交通大学硕士研究生学位论文第32页3．5结果与分析3．5．1PCR扩增获取△9．脂肪酸脱氢酶07M1500bp1000bp500bp图3．1电泳图扩增出△9．脂肪酸脱氢酶的核酸序列Fig．3-1electrophoresisofamplifiednucleicacidsequenceA9-fattyaciddesaturase由电泳图可以看出PCR所扩增出来的序列长度在1000bp到1500bp之间，经过进一步的纯化回收PCR产物后，送往上海生工测序，测序结果及0RF框预测结果如下：GGGGACACGATCTCATGACC从CACCCTGCTGTTTGCCCTCTCCGGGCTGACTGCACTGATCGCCGTGCCCTGGTACGGCATGMTNTLFALSGLTALIAVPWYGMACCCATGGCTATGACCTCTGGCAGTGGGGCAGCTTCCTGCTGCTGTTCTGCTATTGCGGCATCTCCATCACcGCCGGCTACcATHGYDLWQWGSFLFCYCGISITAGY}{CCGGCTCTGGTCCCAC从GGCCTAC从GGCACACCCGATCCTGCAGTGGATCTTCGCCATcGGcGGCGCCCTCGCCCTGCA从RLWSHKAYKAHPILQWIFAIGALALQNACTCGGCCCTGCACTGGTCTTCCGACCATCGCCGCCACCATCGCCACGTGGATGACAATCAGCAGGATCCCTACAGTGCGGGASALHWSDH}{RHRHVDNQDPYSAGRCGCGGTTTCTGGTACTCCCACATCGGCTGGATGCTGCGCGAGTATCAGGGTGACACCTATCACGACTACAGCAATGTGCGGGAGFWYSHIGWMLREYQGDTYHDYSNVRDTCTGCAG从C从CCCCATCGTCGTTTTTCAGCAC从GCACTATCTGGCGCTGACCCTGGCCACC从CATCGGCATCCCGCTGCLQNPIVFQHKHYLALTLATNIGIPLTGCTGGGGCTCGTCCACGGCGATCTGCTCGGCATGTTGCTGCTGGCCGGGGTGCTGCGCATGGTGATGACTCATCACACCACcLGLVHGDLGMLAGVLRMVMTRMVMTTCTTCATC从CTCGCTGGCCCACATCTGGGGCAGCCAGCCCTTCACCGACCGC从CAGCGCACGGGAC从CGGCATCCTGGCTFINSLAHIWGSQPFTDRNSARDNGIL 西南交通大学硕士研究生学位论文第33页CTTCTTCACCTTCGGCGAGGGTTACCACAACTTCCACCACCTGTTCGAG从CGATTATCGC从CGGCATCCACTGGTGGCAGTAFTFGEGYI{＼|llj1]LFENDYRNGIHWQTCGATCCCACC从GTGGCTGATCCGCAGCGCCTCCTGGTGCGGGCTGACCCGGGATCTGCGCGCCTGTCCGG从GAGCGGATCFDPTKWLIRSASWCGLTRDLRACPERIG从CAGGCCAGGCTGGAGATGCAGCTGAAACGGGCCCAGGCC从GTTGCGCAAGCAGGATGACAGGG从CTGTGGCAGGCCCTEQARLEMQLKRAQAKLRKQDRELWQALGCTGCAGGAGGAGTACGAC从GCTG从CCAGCAGTTGCAGCACTACTACGCCAGCCGCA从CGCCTGCTGGAGCAGCGCAAGCLQEYDKLNQLQHYASRKRLEQRKGC从GGCGCTGGCCCGCTACGACCAACTG从GCTGCAGCTGGAGTATCGCAACCTGCACGATGCCTTCATCGCCGCCA从CGCRKALARYDQLKLQLEYRNLHDAFIAKR从CTGGAGCCGACTGCTGGCAGGCATCGCCTGATCCTGAACTCACCTGNWSRLAGIA木测序结果序列全长1127bp，ORF框全长1098bp，编码365个氨基酸。3．5．2氨基酸序列分析ExPASyProtParamt001分析显示，嗜冷黄杆菌DES序列全长329个氨基酸，理论等电点pI=5．08，分子量38．42KD，含酸性氨基酸Asp和Glu共51个，碱性氨基酸Arg和Lys共38个，为偏酸性稳定蛋白质。ProtScal分析表明DES为亲水性蛋白。PSORT分析DES定位于细胞质中，这与Tmpred分析的DES为非跨膜结构蛋白一致。InterProScan4分析DES表明其具备功能Delt9．acylAcp．des区以及Fe离子结合区，推断DES合成后直接在细胞质中与Fe离子结合形成反应复合物，催化9与10位上的碳碳单键形成双键。 西南交通大学硕士研究生学位论文第34页3．5．3系统发育分析r_一F的∞LF私T删砷J13洲懈毽湘日spAPG3一AIIlala喝‘．．．．．．．．——EeonmtⅢs，--·---------------·--------_一r—LVhm一——Am毓I∞压Bi虻IS∞厂L———_|_一-_——————1■—■_UL——————————一p，MCC∞鹄}I，：㈣篇∞LLtuarmssg船；．I山伦∞6TO甄——哪u喇nB—睡即pI铷纠嘴∞啪——～r0嘲II——ua嘲『1[：=射西厂]pffIlo-踟15P11∞FP1一P埘帅IaNS00I_D把触帅堋C主FtO∞s———-_1F芦；crq蝴∞J002186——_J№r∞∞翻tSE：AFG3A憾刚3笛kseall一L■_——U^．r训蚓一Bfxb¨————————————一Lm鼬hon*——h．}lTtecestIsN汛8。2}一j．．．．．．．．．．．．．．J‘-。一P嘶cHe阳mR．1Ce-^——|I9删彻9‘瞰———_]．广Dm㈣心———jL|图3-2不l司物种中△9-脂肪酸脱氢酶的系统进化树Fig．3-2PhylogenetictreeofAcyldesaturasefromdifferentspecies由图1分析可见，此系统发育树分为五个分支，嗜冷黄杆菌Efrigoris、EpsychrophilumJIP02／86和细菌Nitrosospirasp．APG3同源关系较近并聚为一个分支A，B为植物类分支、C为细菌类分支、D为真菌类分支、E为动物类分支，其中与C类分支较近淡黄色标注的unculturedmarinegroupIIeuryarchaeote为古细菌，红色标注的为扩增出的目标序列在进化树中的位置。3．5．4保守基序分析利用Weblogo分析不同物种中DES的一致或相似区【641。Weblogo是将多序列比对的结果以一种比较直观的方式表现出来的软件，如图3．3所示，字母越大表示此位点该氨基酸一致性越高；反之一致性越低，保守性也越差。从图3．3可以看出，Hisl02、Hisl07和Hisl39、Hisl42、Hisl43以及His303、His306、His 西南交通大学硕士研究生学位论文第35页307组成HxxxxH、HxxHH、HxxHH([訇3-3红色箭头表示)三个组氨酸保守区，这三个区域是铁离子结合区，8个组氨酸任何一个的突变都可能导致整个蛋白酶失去活性【651。I盛；塞蹼磊，。二：鹫照：螬}；o：：=：：如o；=：；=l：l：【6№VD基^U=!；利!蝗i；ii图3．3不同物种中脂肪酸脱氢酶的保守基序分析Fig．3-3Analysisofacyldesaturase’Sconservedmotifsfromdifferentspecies3．5．5分子建模¨蜷；ll8C将DES蛋白序列在NCBI中进行BLAST分析，结果显示，在所有的三维结构中，嗜冷黄杆菌DES与蓖麻子硬脂酰一ACP去饱和酶(StearoylAcylCarderPr+川：三¨¨婪“．-rj7．VE：-；●S囊l雕潼：：●m蛄芝：：oh拦k山量一：m，．1卜ⅢF一点意娃誉～0J留Ⅲ&饕”“乩鬟～I。-廷％_．￡”P!：：E-‘二一-■P：=：h_●■●-TE：l-■．H￡●-pJlll_●●]●-r_1●叫l叫J1lN价lIDi●憾孙则h卧型融．L“■●k嘲．L}I=0●，，●●●●●●●●●●●L■I●■■■iiiiiiiiiiiU■IR-E¨iu-●^L‘l‘Eo噩采!Z醛z"RDT_e¨u嶂殴■¨i』¨“娜㈣WⅫ瓷Ⅲ雌蝇n雌Ⅲ卅m㈦峨Ⅲ“¨㈨¨卧¨‰矬试¨■n^nr．．；D}R=ltI^U．．I，●●■ii¨i¨ij-IE¨o=●IIiV：一●HF-^，#--_i¨ii-_-ii¨¨¨¨№m¨_“ii0●i叫⋯训吐"0o一“nⅫq¨^㈧∞“觚弱“二=酬啭‰=t^^Tpvtij=．；if^LiV(I-：R●LFr_l—a●l口InLT}li●●●●．■．．-●V"lF}I：一ⅥF．．ERe‘n一：●，●■¨¨I、11．1-nr■，L!：¨-h．．LP：．I=：●I_■_iKLV^一K_：ji．●PrLoI￡v．^_Ee■^iU■j¨¨iV．^，。0Jlll_lJll_r●J●叫J1Ⅵ3．N价_lq限聪¨*FoJ_I^，刑¨锻B：：：一灿晖砸h_二蔓弧i№"雌驻。～_；：：¨M⋯川叫旧㈨跏-l●^^^r^、■y§．川队m最拉一鞋醵吖¨咿州虬．叫M孙2¨一，球裂㈣iii¨iu■●i¨iii¨¨^‘=^Il■■^■n^vV一￡_●．¨¨邺潍{||iiHm日ijjj¨¨i¨He^|Ii¨-ISIH^0FL』、，HY0§}II．‘，n●●■■^■■n¨¨”Ilii■¨¨¨—^ULI=l^ii■¨¨¨iEo．I一^tiiv_T。=．一?hFL，x一一#V{．．o≈●Liu，：一●_■■¨iU■^ii¨¨v_．L■^●●●●iY：；^L、L}￡ri"●-¨■N^．Sh^UI^^K-i^00玲靠．‰隆孓弧■翟{|10矿鲫毫-l，0¨e、¨一¨屿h。靠●¨强．如lLinv晶一tH_hIht■目～舱t■l^hh_卧＆hl油引觋I¨iV"驰．．．●^～●．Hhl|n．I直雕蕊●尊一“0E最¨眺强：=畦钍童¨量Ⅲ}等酣I●誊：：：=0冉嚣孙。题¨：=A}v．¨：¨0醍≥‘10薛笺“I．，．IILJ鼍“。¨鹃甍¨1怍埔餮b暗乏“0"昨譬．1k爨一黧酣“}||ji¨uT”．^D-i10绷上¨l蛉逞t”k捶‰㈣¨¨M¨卧轴．●‰㈣⋯胁眦镟V0IJ：￡^niii¨，DIlII#ⅢfV；F，目miⅣ■■■●■¨nF自．#^U_i_tK一．1-L．．=‘l^‘niir●-n-^9．1^iiiⅢmii0¨tR¨V=_iii_，．●^F^；■^iiiii¨I-^≥E1．_●i型一!l^Y；-rl—¨-Th■¨』；●43210n价．IcI 西南交通大学硕士研究生学位论文第36页oteinDesaturase，SAD)的同源一致性为49％，序列覆盖为96％，而且SAD与DES的分子进化关系较近，因此选定蓖麻子SAD作为同源建模模板。其与嗜冷黄杆菌DES的序列比对结果见图3．4。利用Swiss．Model进行同源模建得到嗜冷黄杆菌DES的三维结构，其三维结构含18个a．螺旋，2个B．折叠。SAD与同源建模得到的DES三维结构重叠如图3—5所示，二者呈现较高的相似性，其重叠的均方根偏差(RMSD)为1．5A。1“、n{“Jf一5060一Os0T90lo(1ll(11二。鬻量詈冒圈葛璺璺詈曼留p印譬萼碧—墨墨■■■—■—墨■—墨■■■■■置雹盘■■■■■—曩■墨一■■—■墨S吣AD翌日●●●|●||●●臼日●园|圆匮蛋窿|匿■■■■■■■■■■■曩■■●■_——●—■—■■●■■■■●，叠■■■■■■■—■墨190200210，T220230240裟●●旺圈囵■■口●■圈围匪■圃—■—●■匪习●要墨__固2田50墨墨鼍斧圈墨圜勇__—鼍尸_墨囡烹圆圈_焉嚣■■日■■匾垂噩墓臼■习■■■目围■囡匪l￡llIIlI墨31。’f⋯j：。ll!IllIIjljljlIlIlIl31310I_lllIIlll31410lllIIIllljlIIIIIlIIIl_131510llj6。意l熏■■■涠【■■碍曩■忑i嗣睚贾1riF磊一一嗣墨墨曩■—■■墨墨墨圈墨墨■墨墨--◆⋯⋯曩墨—-◆。。◆pq打譬V活性位点图3-4SAD与DES的序列比对及二级结构分布三角符号表示与二铁离子相互作用的活性位点区。Fig．3．4AlignmentandsecondstructuredistributionoftheaminoacidsequencesbetweenDESandSAD．Trianglerepresentstheactivesiteregionwiththeironioninteraction． 西南交通大学硕士研究生学位论文第37页■■图3-5SAD与DES三维结构重叠Fig．3-5SuperpositionoftheoverallribbonstructuresofSAD(red)andDES(green)．3．5．6分子建模评估采用PROCHECK和Verify3D对建立的嗜冷黄杆菌DES三维结构模型进行评估。PEOCHECK通过分析残基与残基间的几何结构以及整体的几何结构来评估蛋白结构的立体质量，Verify3D依据原子模型所处的位置和环境(0【．螺旋，13．折叠，无规则卷曲，极性，非极性等)以及与适当结构的比较从而决定原子模型与自身的氨基酸序列的兼容性。PEOCHECK得到的拉式图见图3-6所示，99．3％的氨基酸的结构处于合理区，仅有0．7％的氨基酸位于合理区外，说明同源建模得到的DES三维结构模型立体几何结构较为合理。同样地，通过Verify3D评价，超过80％的氨基酸评分大于0，也证明了同源建模得到的DES结构模型其三维结构构象的合理性评价良好。 西南交通大学硕士研究生学位论文第38页≥■K●01～厂‘190L一一l一强尘二!!正：型：：A0．6O5∞g04ga0；‘：>0．2010-01-O21，11011512012S1301ResiduenumberB图3-6DES三维结构模型的评估(A)DES三维结构模型的拉氏图。其中“A，B，L”为核心区，“a，b，l，P”为允许区，“—岛~b，～l，~p”为额外接受区域，空白区为不合理区域。(B)DES三维结构模型的verify．3D图。分值大于0的为合理构象。Fig．3-6Evaluationofthethree-dimensionals仃ucnlremodelofDES(A)RamachandranplotofDES，【A，B，L】indicatedthemostfavoredregions；[a,b，l，P】indicatedthesubstitutedadditionalallowedregions；[-a,-b，～l，~p】indicatedthegenerouslyallowedregions；theblankregionsindicatedthedisallowedregions．(B)Verify-3DofDES，thereasonableconformationvalueisgreaterthanzero．3．5．7活性位点分析将DES与SAD三维结构重叠，从DES上找到了与SAD一致的活性位点，主要有Hisll4、GlulllGlu76、His200、Glul97、Glul64，与SAD上面的活性位点高度保守(图3．4)，其中包含两个螯合铁离子Fel、Fe2，Fel与Hisl14、Glulll、Glu76相互作用I硎，Fe2与His200、Glul97、Glul64作用。铁离子对于维持整个蛋白活性起到重要作用，铁离子的缺失将会造成活性位点碳侧链的构象紊乱，从而导致DES活性丧失。Il。hL．卜b舒。斟彳。2蕾皂=王 西南交通大学硕士研究生学位论文第39页图3．7活性位点与铁离子的相互作用及立体构象Fig．3—7StereostructureoftheironcenterofDES3．6讨论微生物在低温条件下的耐受与活性机制一直都是嗜冷微生物研究的热点，不饱和脂肪酸对于低温情况下维持微生物细胞的流动性起到非常重要的作用。本研究以低温微生物嗜冷黄杆菌中与多不饱和脂肪酸代谢重要相关的蛋白DES为研究对象，就其序列组成与基序特征、系统进化与重要活性位点中心，三维结构模建及评价等展开了广泛和深入的研究。系统发育分析发现，不同物种的脂肪酸去饱和酶差异很大，嗜冷黄杆菌等低温耐受菌与常温细菌之间的DES分子进化关系较远，反而与植物类物种的SAD分子进化关系较近。之后的保守基序分析表明大多物种的脂肪酸脱氢酶都具备HxxxxH、HxxHH、HxxHH三个组氨酸保守区【67】，该保守区能与二铁离子结合，对酶的活性产生重要影响。将DES蛋白序列在NCBI中用BLAST分析，结果显示在所有的三维结构中，DES与SAD的同源一致性为49％，序列覆盖度为96％，而其它解析结构的序列覆盖度都不超过50％，而且SAD与DES的分子进化关系较近，因此选定蓖麻子SAD作为同源建模模板。之后的三维结构建模及活性位点分析发现，DES与SAD的同源一致性非常高，两者之间的序列比对分析发现，SAD的二铁离子结合区，在DES中也同样存在。结合嗜冷黄杆菌DES与常温细菌的分子进化关系较远，而与植物SAD的分子进化关系较近，并且二铁离子结合区的活性位点更接近于植物SAD的活性位点，可以推测相对于常温菌而言，低温菌中的低温耐受相关的基因可能发生了一定的变异。本实验室目前从环境污水中筛选获得一株低温耐受性的嗜水气单胞菌07命 西南交通大学硕士研究生学位论文第40页名为似eromonashydrophilastrain07)并从中克隆和获得了△9-脂肪酸去饱和酶基因，ORF框预测结果发现在编码的氨基酸序列中含有HRLWSH、HRRHH、HNFHH三个组氨酸结构区，这与我们经过保守基序分析发现的其它物种中存在着的HxxxxH、HxxHH、HxxHH一致。△9．脂肪酸脱氢酶的分子进化分析发现，筛选出的嗜水气单胞菌07在进化关系上与细菌较近，而与嗜冷菌及植物类分支相对较远，而嗜冷菌的△9．脂肪酸脱氢酶在其铁原子结合区的氨基酸差异性为我们深入开展脂肪酸脱氢酶的结构改造与功能研究，了解低温菌低温耐受机制奠定了重要的前期工作基础。3．7小结(1)设计引物扩增出筛选菌株07的△9胡旨肪酸脱氢酶核酸序列，序列长度1127bp，ORF框全长1098bp，编码365个氨基酸。(2)分析多物种△9．脂肪酸脱氢酶的分子进化关系，发现细菌中嗜冷菌在进化关系上与植物类分支较近，通过进一步的铁离子结合区活性位点分析发现其活性区的氨基酸位点为Hisl14、Glul11Glu76、His200、Glul97、Glul64。(3)对07及多物种的保守基序分析发现，多数物种的△9．脂肪酸脱氢酶含有HxxxxH、HxxHH、HxxHH，普遍研究认为此为脱氢酶的铁离子结合重要活性区，而筛选菌株07的ORF框编码氨基酸序列中存在HRLWSH、HRRHH、HNFHH三个组氨酸保守区，验证了扩增序列的正确性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第41页第四章冷适应微生物污水处理工程实验4．1引言固定化微生物技术一直是环境污水处理研究的一大热点，固定化技术因其方法和采用的载体差异分为吸附、包埋和交联，上文提到各固定化技术的优缺点，包埋法因操作和制作过程的复杂，包埋材料的易降解性等问题是其应用于实际污水处理的一大难题，而交联法则因其制作材料的价格以及交联剂的毒性可能对于固定化微生物造成伤害等问题也是制约其规模化应用的挑战。吸附法虽结合生物量比较少，但因此材料便宜，操作简单，而随着对于微生物吸附材料的研究其结合微生物的能力也在越来越强，在当前生物接触氧化法处理污水的过程中，一些挂膜性较好的材料也渐渐运用到实际的污水处理过程中。立体弹性填料是由筛选出的聚烯烃类和聚酰胺类的耐腐、抗老化材料，混合亲水等助剂制作而成，其具备启动挂膜快，寿命较长，便于管理等优点是吸附法生物固定的改进材料，适用性相对普遍。组合生物填料是由醛化纤维固定成的塑料环，用耐腐蚀，强度高的中心线串制而成，其阻力小，布气布水性能好，挂膜容易是一种适用于生物接触氧化的生物固定化材料。本章通过筛选出的低温微生物混合菌株，采用立体弹性填料和组合生物填料分别固定微生物来处理模拟废水，从而筛选出固定化处理效果较好的材料与菌株组合，并对处理效果较好的菌株材料组合进行进一步的验证。4．2材料◆混合菌1：由实验室筛选出的标记为B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7◆混合菌2：由实验室筛选出的标记为B2、Y10、05、07◆混合菌3：由实验室筛选出的标记为B2、Y10、05、07、Y4◆材料1：立体弹性填料材料2：组合生物填料 西南交通大学硕士研究生学位论文第42页4．2．1重铬酸钾法测化学需氧量COD所需试剂(见2．2．3．1)4．2．2烘箱消解一分光光度法测定COD所需试剂(见2．2．3．2)4．2．3紫外分光光度法测定苯酚所需试剂◆原溶液配制：准确称取0．059苯酚溶解7：100mL的容量瓶中，溶液浓度500mg／L。◆标准溶液配制：原溶液稀释成5、10、25、50、100mg／L。◆模拟污水配方：KH2P050．59、NaCl1．09、NH4Cl2．09、CaCl20．069、C6HsNa307．2H200．39、酵母提取物0．19、苯酚0．59溶解于1L水中。◆生化反应池组成：自f1]lJl0L反应池，150L／min电磁式空气泵作为鼓气装置。4．3方法4．3．1重铬酸钾测定COD步骤(见2．3．1．1)4．3．2烘箱消解一分光光度法测定COD步骤(见2．3．1．2)4．3．3苯酚含量测定(1)对上述配置好的苯酚标准溶液，以去离子水做对照，按苯酚浓度从低到高测定紫外光270nm下的吸光度值。(2)根据不同浓度苯酚溶液的吸光度值绘制标准曲线，根据绘制的标准曲线测定水样的苯酚含量。4．3．4固定化微生物降解模拟污水方法4．3．4．1单菌或材料投加反应池的污水处理结果(1)将保藏好的筛选菌株B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7，分别划线挑取单隆后置于含100mLLB培养基的三角瓶中富集培养，培养条件100rpm／min，15。C，培养至各微生物菌株处于对数生长期。(2)在10L的反应池中加入5L的模拟污水，分别将混合菌1、2、3、按0．2％的接种量加入到反应池中，每组混合菌做3个重复。材料1和材料2各取适量加入的反应池中，每种材料做3个重复，空白组做3个重复，所有实验采用电磁式空气泵进行曝气，每个反应池的曝气量为：8．3L／min。 西南交通大学硕士研究生学位论文第43页(3)每天测定反应池中菌液OD值，pH变化，温度变化以及苯酚含量变化，COD隔天测定一次，检测反应池中的模拟污水COD变化情况。4．3．4．2最优固定化材料与微生物的组合筛选(1)将保藏好的筛选菌株B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7，分别划线挑取单隆后置于含100mLLB培养基的三角瓶中富集培养，培养条件100rpm／min，15。C，培养至各微生物菌株处于对数生长期。(2)在10L的反应池中加入5L的模拟污水，分别将混合菌1分别和材料1、2组合，菌2分别和材料1、2组合，菌3分别和材料1、2组合、菌按0．2％的接种量加入到反应池中，每种组合做3个重复。所有实验采用电磁式空气泵进行曝气，每个反应池的曝气量为：8．3L／min。(3)每天测定反应池中菌液OD值，pH变化，温度变化以及苯酚含量变化，COD隔天测定一次，检测反应池中的模拟污水COD变化情况。4．3．4．3微生物材料组合处理污水的因素研究(1)将保藏好的筛选菌株B2、Y10、05、07、Y4，分别划线挑取单隆后置于含100mLLB培养基的三角瓶中富集培养，培养条件100rpm／min，15。C，培养至各微生物菌株处于对数生长期。(2)在10L的反应池中加入5L的模拟污水，分别将混合菌3和材料2(曝气和不曝气)，单独混合菌3(曝气)，单独的材料2(曝气)，空白组分为曝气和不曝气，每种类别做3个重复。所有实验采用电磁式空气泵进行曝气，每个反应池的曝气量为：8．3L／min。(3)每天测定反应池中菌液OD值，pH变化，温度变化以及苯酚含量变化，COD每天测定一次，检测反应池中的模拟污水COD变化情况。4．4．5电镜材料的制作方法(1)固定：把材料两头拴住，放入EP管中，倒人2．5％戊二醛进行固定，可过夜处理。(2)脱水、脱醇：固定后离心_磷酸缓冲液清冼2次，每次10min---，7,醇梯度脱水：30％、50％、70％、80％、90％、95％各1次，100％2次。每次20min--o中间液乙酸异戊酯：50％、75％、90％、100％，每次20min。 西南交通大学硕士研究生学位论文第44页(3)临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条，将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包，用订书钉将一端订牢。成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包。立即用钉书器将另一端钉牢。放人临界点干燥器样品室，进行C02临界点干燥。(4)离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后材料贴于碳导电胶带上，另一面倒扣离子溅射金后，即可进行扫描电镜观察。4．4结果4．4．1COD测定标准曲线的绘制根据上述配置的标准COD含量溶液测定其在OD600nm下的吸光度值，其吸光度值与不同COD含量的溶液之间的线性关系结果如下：表4-1标准溶液测定的数据结果Table4．1standardsolutionmeasurementdataresults12001000800j粤0凸600U40020000．050．10．150．20．25OD600吸光度值图4．1溶液COD与其消解后600nm下吸光度值之间的线性关系Fig．4-1thelinearrelationshipbetweenthesolutionCODvaluesandthe600nmabsorbancevalues 西南交通大学硕士研究生学位论文第45页ofdigestionsolution由上述标准水样的COD值以及所测定的其吸光度值，通过二元线性回归找出两者之间的线性关系，得到两者之间的线性方程Y=5042．8x一8．1726，其中Y表示水样的COD值，X为水样的吸光度值，R2=0．9987说明两者之间的线性关系较好。4．4．2苯酚含量测定标准曲线的绘制根据所配置的苯酚标准溶液，在紫外光270nm下测定吸光度值，吸光度值与不同浓度苯酚溶液之间的线性关系如下所示：表4-2测定的标准溶液数据n山le4—2standardsolutionmeasurementdataresults12010000．511．522．5OD270吸光度值图4．2溶液苯酚含量与270nm下吸光度值之间的线性关系Fig．4-2thelinearrelationshipbetweenPhenolcontentofthesolutionandthe270nmabsorbancevaluesofdigestionsolution由上述标准水样的苯酚含量与所测定的紫外光270nm下吸光度值，通过二元线性回归找出两者之间的线性关系，得到两者之间的线性方程Y=49．575x．1．7389，其中Y表示水样的苯酚含量，X为水样的吸光度值，R2=0．9994说明两∞加0删缸鑫将 西南交通大学硕士研究生学位论文第46页者之间的线性关系较好。4．4．3最优固定化材料与微生物的组合筛选利用不同微生物与不同材料之间的组合来处理模拟污水，根据不同阶段微生物的处理效果筛选出最好的微生物与材料组合。六天的平均处理温度依次为：15℃_17℃一15℃_14℃_14℃_15℃。pH变化：初始污水的pH为6．47，测定每天各反应池中pH发现随着微生物量的增加，反应池中pH会有小幅度增大，而随污水中营养物质的消耗微生物量变少，pH也会随着稍降低，整体来看在处理的6天时间里，反应池偏弱碱性，pH范围在7．4～8．3之间小幅度变化。菌液变化：由下图可以看出通过材料1固定的混合菌与材料2固定的混合菌相比，除混合菌3的菌液浓度相差不大外，由材料1固定的混合菌1和混合菌2在培养1~2天后的菌液浓度要远小于由材料2固定的混合菌浓度，而在处理2天之后含材料1的反应池中菌液的浓度开始趋于平衡，而含材料2反应池的菌液浓度逐渐下降。苯酚含量变化：污水中初始苯酚含量为：500mg／L，菌1材料1的苯酚降解率为26％，菌1材料2的苯酚降解率为44％。菌2材料1的降解率为22％，菌2材料2的降解率为27％。菌3材料1的降解率为38％，菌3材料2的降解率达92％。COD变化：初始污水的COD值为2338．2mg／L，经6天处理后，茵1材料1的最终COD降解率为48．3％，菌l材料2的降解率为61．2％。菌2材料1的降解率为41．8％，菌2材料2的降解率为48．3％。菌3材料1的降解率为52．6％，菌3材料2的降解率为70．9％。综上所述该阶段反应池中苯酚处理效率从高到低的组合依次为：菌3材料2>菌1材料2>菌3材料1>菌2材料2>菌1材料1>菌2材料1，COD处理效率从高到低的组合依次为：菌3材料2>菌1材料2>菌2材料2=菌1材料1>菌2材料1。投加菌3材料2组合的反应池在苯酚处理和COD降解方面都优于其他组合，初步得出菌3材料2为最优反应池污水处理组合。 西南交通大学硕士研究生学位论文第47页一-蘸i在一#雎r一=：霉慧编-A．一焉?]。“●舶^承：，一=：；詈戮：；--A．。pH“。一fL产▲～～l～．20,SS‘一’。c’。∞●——▲一二0X’、、．‘50c一10，●．吼’．j—一▲～～、■、一i～．2∞：◆＼l‘—～▲一一。＼▲、?一1：*-1：：：--j：：_-●’＼、▲＼、!|j～▲—～I_：～■一232：．●-_u-■图4．3各反应池水样处理后测定结果Fig．4-3Themeasurementresultsofeachreactiontreatedwatersamples4．4．4单菌或材料投加反应池的污水处理结果使用重铬酸钾法测定了配制的模拟污水的COD值为2338．2mg／L，pH6．47，苯酚含量为500mg／L。对照实验是以不加材料不加菌的模拟废水为空白，对实验的单因素材料1、2，混合菌1、2、3进行对比分析，选取pH、温度、COD、苯酚含量以及菌液浓度分析污水过程中各因素的变化情况。 西南交通大学硕士研究生学位论文第48页温度变化：处理4天每天的平均温度依次为19℃_20℃_20℃_20℃。pH变化：污水起始pH值为6．47，污水处理的四天内pH总体趋于平稳，都是在呈微碱性，各反应器@pH范围在7．8～8．4之间。菌液变化：从处理废水的运行时间上来看，在菌株投加到污水中运行一天之后，反应池废水菌体量趋于稳定，这个稳定期可以维持2．3天的时间，从下图可以看出只有混合菌2和固定环境菌的材料1稳定期相对较短，稳定期是微生物生长代谢最为旺盛的时期，这个时期相对来说较长，对于废水中有机物的降解量也是最大的。苯酚含量变化：反应池中初始苯酚含量为500mg／L，经过四天处理后空白，材料1、2，菌1、2、3的处理效率分别为79％、70．1％、95．50％、62％、62．20％、71％。COD变化：只加材料1的反应池经两天处理后的COD降解率为78％，47处理后降解率为85％。只加材料2的反应池两天处理后的COD降解率为91％，4天处理后降解率为99％。只加混合菌1的反应池两天处理后的COD降解率为52％，4天处理后降解率为95％。只加混合菌2的反应池两天处理后的COD降解率为89％，47处理后降解率为92％。只加混合菌3的反应池两天处理后的COD降解率为79％，4天处理后降解率为96％。而不加菌也不加材料的空白对照两天处理后的COD降解率为75％，47处理后降解率为99％。综上所述该阶段反应池苯酚处理效率从高到底依次为：材料2>材料1，混合菌3>混合菌2>混合菌1。COD降解率从高到底依次为：材料2>材料1，混合菌3>混合菌2>混合菌1。此阶段环境温度上升至平均20℃，与上阶段相比，温度的提升很大程度上提高了微生物的活性，此温度条件下COD降解和苯酚处理效率都非常显著。而空白组随着温度提升，经两天处理后COD降解率从高到底依次为：混合菌3>混合菌2>空白组>混合茵1，环境野生菌对于反应池中有机物的利用加快，在COD降解中的作用也愈加明显，经4天处理后，除投加材料1的反应池外，其余反应池污水COD降解率都能达到90％以上。此阶段的试验得出材料2、混合菌3在反应池污水处理中的优势，温度对于反应池的处理效率影响显著。 西南交通大学硕士研究生学位论文第49页掣。、＼、●l一＼～√＼。i‘：：：＼一b一■一i二-一-差驰瓣灶珲乇致材料2卜：i、．：i■．．ij 西南交通大学硕士研究生学位论文第50页范围内，经过一天处理后总体pH变化不大，而不曝气的菌3材料2反应池的pH范围在6．7～7．2之间，总体偏中性与微弱酸性状态。单独加菌3和材料2的反应池总体pH变化范围相近在7．4～8．1之间呈弱碱性。曝气的空白组在处理一天后pH在8．0左右，而随着处理时间的增加，其pH逐渐降低，最后一天的测定结果为6．64呈弱酸性。而不曝气空白组在处理一天后pH依然在6．79呈弱酸性状态，随着处理时间的增加pH逐渐增加而趋于弱碱性状态。菌液变化：总体来讲处于曝气状态的菌3材料2，分别只加菌3和材料2以及空白的反应池中，经过一天的处理后各反应池中菌液浓度OD600都在0．3以上，其中菌3材料2反应池在处理的前三天其菌液浓度都趋于稳定，而其他曝气反应池中的菌液浓度在处理第二天后都开始有所下降。非曝气状态的菌3材料2，空白组反应池中处理一天后的菌液浓度OD600都在O．1左右，而处理三天后期OD600趋于恒定在0．28左右，不曝气反应池的菌生长远弱于曝气池中的细菌生长。苯酚含量：曝气状态下的菌3材料2经过三天处理后苯酚含量急剧下降，最终处理效率为94．7％，而不曝气的菌3材料2的反应池苯酚含量下降缓慢，最终的处理效率只有45．2％。只投加菌3和材料2的曝气反应池，随着处理时间的增加，苯酚下降的幅度稍平缓，最终的降解效率分别为91．9％和94．6％。空白曝气池在处理4天后苯酚含量降至最低，处理效率92．7％，而不曝气的空白反应池6天处理后的苯酚处理效率为35．8％。COD变化：曝气的菌3材料2反应池2天处理后COD降解率达91％，不曝气的反应池3天处理后降解率为91．3％。曝气的菌3反应池3天处理后COD降解率达97．2％，曝气的材料2反应池2天处理后COD降解率达90．4％。曝气的空白反应池3天处理后COD降解率达94．6％，不曝气的空白反应池4天处理后COD降解率达99．1％。综上所述各反应池苯酚处理效率从高到低依次为：曝气菌3材料2>不曝气菌3材料2，曝气菌3材料2>曝气菌3，曝气菌3材料2>曝气材料2，曝气空白>不曝气空白。COD降解效率从高到低依次为：曝气菌3材料2>不曝气菌3材料2，曝气菌3材料2>曝气菌3，曝气菌3材料2>曝气材料2，曝气空白> 西南交通大学硕士研究生学位论文第51页不曝气空白。在环境温度平均20℃下，投加菌3材料2的曝气池的苯酚处理和COD降解效率具有较明显的优势，这一方面证明了筛选的菌3和材料2组合污水处理的显著优势，另一方面表明曝气对于微生物降解反应池污水的促进作用。～一——-一苗被泳噬⋯．I爱水c00拧量—▲一苯酗0希r2”o蔓壁壁!!!!!里‘pH耍f：]4“234567处理无羲菌3材料2曝气处理大数菌3曝气处瑶t敏菌3材料2不曝气：：器：--A--T--b‘’ih●pH《‘二●t。＼＼＼l‘、、▲＼＼：●‘～～一，-、＼▲～▲．_4．4．6固定化材料2的电镜扫描结果为直观查看经6天反应池中曝气后，材料2固定微生物的状况，选取没有固 西南交通大学硕士研究生学位论文第52页定微生物的材料2作为空白组，以固定微生物后的材料2作为实验组制作成电镜扫描样品，通过在电子显微扫描来直观查看材料2固定微生物的结果。图4-6空白组材料2电镜扫描结果Fig．4-6blankgroupmaterial2SEMresults图4．7实验组材料2电镜扫描结果Fig．4-7experimentalmaterial2SEMresults图4．8实验组材料2电镜扫描结果Fig．4-8experimentalmaterial2SEMresults 西南交通大学硕士研究生学位论文第53页4．5讨论本章研究是基于将筛选菌株投入到污水处理的实际应用这个角度，采用18个10L自制处理反应池，150L／min电磁式空气泵作为鼓气装置，聚烯烃类的立体弹性材料及醛化纤维的生物组合填料作为固定化微生物的材料。考虑到单菌处理污水的实际应用可能性小，风险性高，因此采取多混合菌株联合固定化材料来处理污水的方式。首先是筛选出处理效果较好的固定化材料与混合菌株的组合，将混合菌分别与材料进行组合后投放到反应池，每个反应池做三个重复，处理6天后菌1材料1、菌1材料2的最终COD降解率分别为48．3％、61．2％。菌2材料1、菌2材料2的COD降解率为41．8％、48．3％。菌3材料1、菌3材料2的COD降解率52．6％、70．9％。而菌3材料2组合的苯酚去除率更是高达92％，远高于其他菌株和材料组合。6天环境平均气温为15℃左右，在相对低温环境下，混合菌3和材料2的组合较其他组合有更好的污水降解能力。为进一步确定筛选出的混合微生物和材料组合处理污水的优势，设计单因素处理模拟污水实验即在单一反应池中只加入一种混合菌或一种材料，每个反应池做三个重复，空白对照则不加材料不加菌。环境温度为20℃左右，处理4天的结果发现材料方面：材料2两天处理后的污水处理COD降解就高达89％，而4天后COD降解率达99％。而材料1的处理效率明显要低，2天和4天的处理效率分别为78％和85％。添加菌方面混合菌1、2、3的反应池2天处理后的COD降解率分别为52％、89％、79％，4天处理后降解率为95％、92％、96％。可以看出混合茵1的2天的处理效率偏低，而混合菌2的处理效率在处理2天和4天的效率差异不大，其最终的COD降解率要小于混合菌1和3。而空白组此接近20℃环境温度下，2天和4天后的污水COD降解率也达到了75％和99％，而材料2作为固定材料两天处理后COD降解率达89％，也能说明微生物的固定对于污水处理的显著作用。空白，材料1、2，菌1、2、3的苯酚处理效率分别为79％、70．1％、95．50％、62％、62．20％、71％。可以看出材料2的固定化效果要好于材料1，而菌3的污水处理效率又要优于其他混合菌，因此选定菌3和材料2作为污水处理的最优组合。 西南交通大学硕士研究生学位论文第54页为探究降解效率最优的混合菌3和材料2组合处理污水的影响因素，设计曝气与不曝气的空白和菌3材料2的组合反应池，单加菌3和材料2的曝气反应池。平均温度为20。C，经过6天处理结果发现，曝气与不曝气对于反应池中污水处理效率影响巨大，菌3材料2组合曝气反应池经过两天处理后COD降解就达到91％，3天曝气处理后污染物几乎降解完全，空白组曝气池也能在4天处理后降解完全，而不曝气反应池COD降解效率和速度都相对较差。单一因素菌3和材料2的曝气反应池的降解效果来看，材料2通过固定环境菌来降解污水效果相对显著，这也进一步说明经材料2固定后的微生物在污水处理中发挥的重要作用。单从菌3材料2组合反应池来看，在环境温度为平均15℃时，经过6天处理后COD和苯酚含量的去除率分别达到70．9％和92％，而当环境温度升高至20℃时，该反应池2天处理后COD降解就达到91％，3天处理过后COD降解几乎达100％，而苯酚含量在6天处理后也达到94．6％。温度的升高极大的刺激了环境微生物的生物活性使其代谢加速，利用废水中营养物质的速率也加快，而环境在15℃时环境菌株的活性很低，此时在污水中COD的降解主要依赖于筛选菌株的活性，从筛选出的混合菌3材料2组合的处理效率角度，说明在相对低温的条件下低温菌筛选联合生物固定化技术进行实际污水处理的可行性。4．6小结(1)设计模拟生物反应池，经混合菌、材料、以及混合菌及材料的联合处理污水效果分析，筛选出最优污水处理效率的混合菌3和材料2组合。(2)混合菌3和材料2组合在环境温度15。C时的苯酚和COD去除率分别为70．9％和92％，而在平均环境温度20℃时3天处理后其COD去除率几乎达100％，而6天处理后最终苯酚去除率也达94．7％，温度的升高对于环境微生物活性影响显著。(3)整个实验过程中，固定化材料2即醛化纤维组合生物填料对于污水处理效果的作用非常显著，经固定化的微生物反应池在处理效率与速度上都要优于不固定化的反应池。(4)固定化材料扫描电镜结果更直观的证实了微生物附着于材料上。 西南交通大学硕士研究生学位论文第55页总结，l：，、=口本研究通过从冬季低温4-8。C环境下，经富集培养筛选出能在4。C环境下生长的8株低温耐受菌，分别研究其单菌及混合菌株在相对低温环境下处理污水情况进行分析。通过分子生物学的方法从筛选菌株中扩增出维持微生物低温耐受相关的脂肪酸脱氢酶基因，利用生物信息学的手段分析不同物种中脂肪酸脱氢酶基因的分子进化关系、三维结构及活性位点的差异性分析为进一步了解微生物的低温耐受机制提供一定的线索。另外采用固定化微生物技术，选取两种固定化材料来固定筛选微生物进行污水处理的研究，并在此基础上筛选出污水处理效率较高的材料及微生物组合。本研究的主要结论如下：(1)在冬季低温4～8℃环境下，从污水处理池中富集筛选出8株能在40C下生长的耐受菌株。(2)15℃，100rpm的培养条件下，筛选菌株B2、Y10、05、07、Y4、B6、06、Y7单菌处理高浓度废水(COD为17763．79mg／L)的处理效率分别为87％、85．50％、82．70％、82．20％、81．50％、77．70％、76．20％、63．40％。(3)将筛选菌株按污水处理效率高低进行混合，进一步测定混合菌株处理高浓度废水的处理效率，结果发现混合菌处理效率最低的为73．6％，最高为80％，虽处理效率不及部分单菌，但从整体稳定性来讲，混合菌处理效率虽有差异，但相对比单菌稳定，因此从面对实际污水处理角度，混合菌更能适应环境污水处理。(4)对筛选菌株进行形态及分子生物学鉴定结果发现，8株筛选菌株中有5株为革兰氏阴性菌，一株放线菌，2株革兰氏阳性菌，这也符合污水处理中主要活性菌株为革兰氏阴性菌的事实。(5)设计引物扩增出筛选菌株07的△9．脂肪酸脱氢酶核酸序列，序列长度1127bp，ORF框全长1098bp，编码365个氨基酸。(6)分析多物种A9．脂肪酸脱氢酶的分子进化关系，发现细菌中嗜冷菌在进化关系上与植物类分支较近，通过进一步的铁离子结合区活性位点分析发现其活性区的氨基酸位点为Hisll4、GlulllGlu76、His200、Glul97、Glul64。(7)对07及多物种的保守基序分析发现，多数物种的A9．脂肪酸脱氢酶含有HxxxxH、HxxHH、HxxHH，普遍研究认为此为脱氢酶的铁离子结合重要活性区， 西南交通大学硕士研究生学位论文第56页而筛选菌株07的ORF框编码氨基酸序列中存在HRLWSH、HRRHH、HNFHH三个组氨酸保守区，验证了扩增序列的正确性。(8)设计模拟生物反应池，经混合菌、材料、以及混合菌及材料的联合处理污水效果分析，筛选出最优污水处理效率的混合菌3和材料2组合。(9)混合菌3和材料2组合在环境温度15℃时的苯酚和COD去除率分别为70．9％和92％，而在平均环境温度20℃时3天处理后其COD去除率几乎达100％，而6天处理后最终苯酚去除率也达94．7％，温度的升高对于环境微生物活性影响显著。(10)整个实验过程中，固定化材料2即醛化纤维组合生物填料对于污水处理效果的作用非常显著，经固定化的微生物反应池在处理效率与速度上都要优于不固定化的反应池。(11)固定化材料扫描电镜结果更直观的证实了微生物附着于材料上。 西南交通大学硕士研究生学位论文第57页致谢本课题是在导师茆灿泉教授的精心指导下完成的。在攻读硕士的这三年里，导师不仅为我创造了优越的科研和学习环境，同时在思想上，人生态度和意志品质方面给予了谆谆教诲，这些教益必将激励着我在今后的人生道路上奋勇向前。他渊博的知识，严谨谦逊的治学态度，孜孜不倦的科研精神一直深深的影响着我，让我受益终生。值此论文完成之际，谨对茆老师致以崇高的敬意和由衷的感谢。感谢谭博文、曾丽、黄家明、刘棕英、周毅洁、杨亚蓝、宋明珠、邬亦然、邱瑾怡、毕正飞分子进化与应用生物学实验室的全体人员对我的帮助和支持。他们开创性的研究拓展了我的学术视野，无数次的学术探讨使我研究工作有了长足的进展。感谢我的父母对我二十几年来的抚育和培养使我能够在这里进行我的硕士论文。他们对我的默默付出和支持，让我可以全心的倾注于学业而没有后顾之忧，我的每一点成功都是凝聚着他们深深的爱和付出!感谢所有支持和鼓励我的朋友们。最后感谢论文评阅人和答辩委员会的专家在百忙之中给予我的宝贵的建议和指导。 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西南交通大学硕士研究生学位论文第68页表3．2投加混合菌l材料2反应池数据表3．3投加混合菌2材料1反应池数据表3．4投加混合菌2材料2反应池数据 西南交通大学硕士研究生学位论文第69页表3．5投加混合菌3材料1反应池数据表3-6投加混合菌3材料2反应池数据附录4微生物材料组合处理污水的因素研究表4．1投加混合菌3材料2曝气反应池数据BrJ"l浯-](d)COD(mg．L-1)pH菌’液OD600(A)苯酚(mg．L-1)547．5+5．97．91土0．130．322土0．023347．5+1．2211．2--LO8．19+0．080．346士0．005256．8-4-6．107．74士0．070．358士0．00330．8士0．67．92士0．050．245士O．00033．6+1．87．81+0．100．119士0．03530．6+4．0 西南交通大学硕士研究生学位论文第70页67．89-4-0．1OO．107士O．00526．6+6．9表4．3投加混合菌3曝气反应池数据表4．4投加材料2曝气反应池数据时间(d)COD(mg．L。)pH]皴OD600(A)苯酚(mg．L。1)1093．8士30．97．72土0．110．324土0．013338．8士38．7223．9士7．77．98士0．070．307土0．001305．6+2．307．9士0．058土0．160．188士0．033225．5土53．3O．129士O．00171．5-4-11．27．68士0．090．011+0．00330．9+6．3 西南交通大学硕士研究生学位论文第71页67．42+0．080．001-4-0．00126．8+1．4表4-6空白曝气反应池数据 西南交通大学硕士研究生学位论文第72页攻读硕士学位期间发表的学术论文[1]张远，茆灿泉．嗜冷黄杆菌酰基一Acp去饱和酶(AAD)的序列分析和结构建模．生物学杂志，已收录．[2】张远，徐平，茆灿泉．耐冷菌处理低温生活污水的初步研究．全国农业生物化学与分子生物学第十一次学术研讨会议论文，2012，青岛．'