GBT18448.2-2008实验动物弓形虫检测方法.pdf 9页

'ICS65．020．30B44a雷中华人民共和国国家标准GB／T18448．2—2008代替GB／T18448．2—200l实验动物弓形虫检测方法Laboratoryanimal--MethodforexaminationofToxoplasmagondii2008-12-03发布2009-03-01实施{：瞀鹊紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 刖置GB／T18448．2—2008GB／T18448{(实验动物》由10项实验动物寄生虫检测方法组成。本部分为GB／T18448的第2部分《实验动物弓形虫检测方法》。本部分自实施之日起代替GB／T18448．22001。本部分与GB／T18448．2—2001相比主要技术差异如下：a)增加弓形虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫酶染色试验(IEA)，将PCR检测方法列入附录内容，保留间接血凝试验(IHA)作为推荐方法之一；b)将检测方法所需的“材料与试剂”和“检测步骤”分别叙述。本部分附录A是规范性附录。本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会。本部分主要起草人：潘振业、屈霞琴、陈俏梅、李冠民、王彦平。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T14926．341994，GB／T18448．2—2001。 实验动物弓形虫检测方法1范围GB／T18448的本部分规定了实验动物弓形虫的检测方法和试剂等。本部分适用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬及猴等实验动物弓形虫的检测。2原理根据免疫学原理，采用弓形虫抗原检测被检动物血清中的弓形虫抗体。3主要试剂和器材GB／T18448．2—20083．1试剂3．1．1ELISA抗原3．1．1．1特异性抗原弓形虫(RH株)速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠(KM、ICR、BALB／c等均可)，3d--5d后，以无菌生理盐水灌洗被接种小鼠的腹腔，收集含有虫体的小鼠腹腔液，3000r／rain离心10min，取沉淀，PBS洗3次。沉淀物加适量蒸馏水反复冻融5次，或用超声波处理后，10000r／min离心30rain，取上清液。上清液用葡聚糖凝胶G200进行纯化(柱内径×柱高：1．5cm×60cm)，流速为0．2mL／min。每管收集2mL左右。共收集60管以上。分别测定每个收集管中蛋白在280nm下的吸光度值。分离纯化后，出现2个蛋白峰；将第一峰各管合并，即为弓形虫特异性抗原(也称弓形虫可溶性抗原)。3．1．1．2正常抗原以无菌生理盐水注射清洁级以上实验小鼠(与制备抗原的小鼠同品种或品系)腹腔，3d～5d后，以无菌生理盐水灌洗被注射小鼠腹腔，收集小鼠腹腔液，3000r／min离心10min，取沉淀，PBS洗3次。沉淀物加适量蒸馏水反复冻融5次，或用超声波处理后，10000r／min离心30min，取上清液，即为正常抗原。3．1．2抗原片弓形虫RH株速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠(KM、ICR、BALB／c等均可)，3d～5d后处死，收取虫体，胰酶消化，以一定浓度涂片，充分晾干后冷丙酮固定，--20℃保存。3．1．3弓形虫抗原致敏绵羊红细胞将绵羊红细胞与一定浓度的鞣酸液反应，制成鞣化红细胞，然后，用弓形虫可溶性抗原在适宜的条件下致敏鞣化红细胞，制成弓形虫抗原致敏绵羊红细胞。3．1．4正常对照绵羊红细胞。3．1．5阳性对照血清自然感染弓形虫的相应动物抗体阳性血清，或弓形虫免疫血清。3．1．6阴性对照血清确证无弓形虫感染的动物血清。3．1．7酶结合物辣根过氧化物酶标记的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG抗体；或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。3．1．8荧光素结合物异硫氰氢酸荧光素标记的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG抗体。1 GB／T18448．2—20083．1．9包被液(o．05mol／L，pH9．6)碳酸钠碳酸氢钠蒸馏水3．1．10PBS(0．01mol／L，pH7．4)氯化钠氯化钾磷酸氢二钠(NazHPO。·12HzO)蒸馏水3．1．11洗涤液PBS(0．01mol／L，pH7．4)Tween一203．1．12稀释液含1％牛血清白蛋白的PBS。3．1．13磷酸盐一柠檬酸缓冲液(pH5．o)柠檬酸磷酸氢二钠(NazHPO。·12HzO)蒸馏水3．1．14ELISA底物溶液磷酸盐一柠檬酸缓冲液(pH5．o)邻苯二胺(OPD)30％过氧化氢3．1．15终止液(2mol／L硫酸)硫酸蒸馏水3．1．16IEA底物溶液3，3一二胺基联苯胺盐酸盐(DAB)PBS(0．01mol／L，pH7．4)丙酮30％过氧化氢3．2器材3．2．1酶标仪。3．2．2荧光显微镜。3．2．3常规的光学显微镜。3．2．437℃培养箱或水浴箱。3．2．5微量血凝反应板(u型或V型)。3．2．6震荡器。3．2．7微量加样器(5pL～100pL)。4检测方法1．59g2．93g加至1000mL8g0．2g2．83g加至1000mI．1000mL0．5mL3．26g12．9g700mL10mL4mg2“L58mL442mL40mg100mL5mLO．1mL4．1间接血凝法(IHA)4．1．1取样4．1．1．1采血约1mL(小鼠、大鼠、地鼠眶静脉窦采血；豚鼠心脏采血；兔耳部采血；犬和猴后肢静脉采2 GB／T18448．2—2008血)，凝血试管斜放待凝，置4℃冰箱2h。4．1．1．22h后，从冰箱中取出凝血试管，轻轻吸取血清移入另一试管中。4．1．1．3将分离出的血清置56℃水浴中灭活30rain，备用。4．1．2加样在微量反应板上，依次对每份血清进行倍比稀释，每份血清稀释两横排，每孔留量为25pL。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。4．1．3加致敏红细胞第一横排滴加弓形虫致敏红细胞25pL，第二横排滴加正常对照绵羊红细胞25pL。将加好样品的微量反应板置震荡器上震荡3min～5rain，使致敏红细胞与待检的稀释血清充分混合，置15℃～28℃室温下过夜后判定结果。4．1．4结果记录在对照系统(阴性血清对照、阳性血清对照、空白对照)成立的条件下判定结果。4．1．4．1红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，记为“++++”。4．1．4．2红细胞虽呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，记为“+++”。4．1．4．3红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，记为“++”。4．1．4．4红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，记为“+”。4．1．4．5红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，记为“一”。4．1．5结果判定出现“++”孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价。小于或等于1：16判为阴性；1：32判为可疑；等于或大于1：64判为阳性。4．2酶联免疫吸附试验法(ELISA)4．2．1包被抗原根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释。每孔100“L，置37℃2h，4℃过夜。4．2．2洗涤液洗5次，每次3rain，叩干。4．2．3加样4．2．3．1采血样约1mL／只(小鼠、大鼠、地鼠眶静脉窦采血；豚鼠心脏采血；兔耳部采血；犬和猴后肢静脉采血)，凝血试管斜放待凝，置4℃冰箱2h至过夜。4．2．3．22h后，从冰箱中取出凝血试管，轻轻吸取血清移人另一试管中。4．2．3．3将待检血清用稀释液做1：20稀释，分别加入两孔(特异性抗原孔和正常抗原孔)，每孔100“L，同时做阴性、阳性对照血清和空白对照，置37℃1h～1．5h后，洗涤同上。4．2．4加酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔加人100pL，置37℃1h～1．5h，洗涤同上。4．2．5加底物溶液每孔加入新配制的底物溶液100pL，置室温，避光显色5min～10rain。4．2．6终止反应每孔加入终止液50pL。4．2．7测A值在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。4．2．8结果判定4．2．8．1在对照系统(阴性血清对照、阳性血清对照、空白对照)成立的条件下判定结果。4．2．8．2同时符合下列3个条件者，判为阳性：a)待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别；3 GB／T18448．2—2008b)待检血清与特异性抗原反应的A值≥0．2；c)待检血清与特异性抗原反应的A值／阴性血清与特异性抗原反应的A值≥2．1。4．2．8．3均不符合上述3个条件者，判为阴性；仅有1条～2条符合者，判为可疑；需选用同一种方法或另一种方法重试。4．3免疫荧光试验法(IFA)4．3．1取出抗原片(3．1．2)，置室温干燥或冷风吹干。4．3．2将待检血清(4．2．3．1～4．2．3．2)用PBS按1：10稀释后，滴于抗原片上，置湿暗盒内，37℃45min。同时做阴性、阳性血清对照和空白对照。4．3．3PBS漂洗3次～5次，每次3min，室温干燥或冷风吹干。4．3．4将适当稀释的荧光抗体滴加于抗原片上，置湿暗盒内，37℃45min。4．3．5PBS漂洗3次～5次，每次3min。4．3．650％甘油PBS封片，荧光显微镜下观察。4．3．7结果判定：在对照系统成立的条件下，即阴性血清和PBS与抗原片上的弓形虫虫体反应均无荧光；阳性血清与弓形虫虫体反应有荧光，即可判定结果。待检血清与弓形虫虫体反应无荧光，判为阴性。待检血清与弓形虫虫体反应有荧光反应，判为阳性。根据荧光反应的强弱可判为+～++++。4．4免疫酶试验法(IEA)4．4．1取出抗原片(3．1．2)，置室温干燥或冷风吹干。4．4．2将待检血清(4．2．3．1～4．2。3．2)用PBS按1：10稀释后，滴于抗原片上，置湿暗盒内，37℃45min。同时做阴性、阳性血清对照和空白对照。4．4．3PBS漂洗3次～5次，每次3min，室温干燥或冷风欢干。4．4．4将适当稀释的酶结合物滴加于抗原片上，置湿暗盒内，37℃45rain。4．4．5PBS漂洗3次～5次，每次3min。室温干燥或冷风吹干。4．4．6将底物溶液滴加于抗原片上，置室温暗盒内，显色5mln10min。PBS漂洗3次，再用蒸馏水漂洗1次。4．4．7中性树脂封片，光学显微镜下观察。4．4．8结果判定：在对照系统成立的条件下，即阴性血清和PBS与抗原片上的弓形虫虫体反应均无色；阳性血清与弓形虫虫体反应呈棕褐色，即可判定结果。待检血清与弓形虫虫体反应呈无色，判为阴性。待检血清与弓形虫虫体反应呈棕褐色，判为阳性。根据颜色深浅可判为+～++++。4．5PCR检测方法见附录A。5结果判定待检样品用一种方法检测出现可疑或阳性时，应选用同一种或另一种方法重检，重检阳性则为阳性。6结果报告根据判定结果，作出报告。 附录A(规范性附录)实验动物弓形虫检测方法(PCR法)A．1范围本附录规定了实验动物弓形虫PCR检测方法。本附录适用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬及猴等实验动物弓形虫的检测。A．2原理GB／T18448．2—2008虫体DNA加热变性后，人工合成的两条特异性引物分别与虫体DNA两翼序列特异变性，在合适条件下，由耐热DNA聚合酶催化引物引导的虫体DNA合成(即延伸)，完成热变性——复性——延伸的PCR循环，通过30次左右的循环扩增，可通过琼脂糖凝胶电泳检查虫体DNA特异性条带。A．3主要试剂和器材A．3．1试剂A．3．1．1血细胞洗涤液：若样品为全血，采用0．83％NH；C1溶液洗涤。A．3．1．2DNA裂解液[10mmol／LTris(pH7．4)，10mmol／LEDTA，150mmol／LNaCl，0．4％SDS，100／zg／mL蛋白酶K]。A．3．1．3苯酚一三氯甲烷抽提液(苯酚：三氯甲烷为1：1)。A．3．1．4TE缓冲溶液(1mL1mol／LTris—HispH8．0，0．2mL0．5mol／LEDTApH8．0，总体积100mL)。A．3．1．5TBE缓冲液。A．3．1．6TaqDNA聚合酶。A．3．1．7引物A．3．1．7．1一次PCR引物按B1基因序列设计1．上游引物：5’GGAACTGCATCCGTTCATGAG3’(694bp--714bp)2．下游引物：5’TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3’(887bp～868bp)扩增产物为194bp。A．3．1．7．2套式PCR引物按P30基因序列设计引物P1为5’GCGAATTCATGTCAGATCCCCCT3’P2为5’GTGGATCCTCACGCGACACAAGCT3’P3为5’CGACAGCCGGTCATTCTC3’P4为5’GCAACCAGTcAGcGTCGTCC3’P1和P2的预扩增产物为889bp，P3和P4的预扩增产物为520bp。A．3．1．8i0×PCR反应缓冲液(含MgClz15mmol／L)。A．3．1．9dNTP：各为10mmol／L。A．3．1．10阳性对照(模板DNA)：弓形虫DNA片段。制备方法(有条件的实验室可参考)：将RH株弓形虫速殖子接种小鼠腹腔，3d--4d后处死。用NS洗腹腔，收集腹腔液，离心弃上清，沉淀悬浮于裂解液(含SDS和蛋白酶K)中，55℃消化2h，再100℃处理10min。虫体消化液用苯酚，三氯甲烷抽提数次，70％乙醇沉淀DNA，再溶解于TE溶液内。5 GB／T18448．2—2008A．3．1．11阴性对照：蒸馏水或TE溶液。A．3．1．12DNAmarker。A．3．1．132％琼脂糖。A．3．1．140．5XTBE电泳缓冲液。A．3．1．150．5mg／mL溴乙锭。A．3．2器材A．3．2．1DNA扩增仪。A．3．2．2微量移液器。A．3．2．3冷冻高速离心机。A．3．2．4电泳仪。A．3．2．5水浴锅。A．3．2．6紫外检测仪。A．3．2．7摄影器材。A．3．2．80．5mL和1．5mL塑料离心管。A．4操作步骤A．4．1待检标本的处理A．4．1．1抽取待检动物的血液或腹腔液，以及相关组织。A．4．1．2全血：取待检动物全血0．2mL，加入5×体积的0．83％NH。C1中，冰浴20min，6000r／min离心5rain，弃上清，在细胞沉淀中再加入1mL上述溶液，6000r／min离心，重复1次～2次(去除红细胞)，在沉淀中加入250mL裂解液。消化，提纯过程同模板DNA的制备。A．4．1．3腹水：取待检动物腹水离心弃上清，在沉淀中加入250mL裂解液，消化，提纯过程同模板DNA的制备。A．4．1．4各种组织：取适量待检动物肝、脾、子宫、肾脏等制成匀浆，加入等体积裂解液，消化，提纯过程同模板DNA的制备。A．4．2PCR实验A．4．2．1一次PcR总体积50pL，内含10mmol／LpH8．3面s—HCl，50mmol／LKCl，2mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTPs，样品3btL～5pL，引物1、引物2各10pmol。上述反应液先预变性，然后加入Taq酶2U，混匀。覆盖液体石蜡50pL，进行扩增。PCR反应条件：预变性为94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，41个循环，最后72℃，7min。A．4．2．2套式PCR第1次扩增：总体积50pL，内含10mmol／LpH8．3Tris—HCI，50mmol／LKCl2，2mmol／LMgClz，0．2mmol／LdNTPs，样品1pL～2pL，引物P1和P2各10pmol。上述反应液先预变性，然后加入Taq酶2U，混匀，覆盖液体石蜡50pL。第2次扩增：取第一次扩增产物1pL～2pL，引物P3和P4各10pmol，其他同第1次扩增。巢式PCR反应参数：预变性为94℃，3min；94℃，1min，55℃，1min，72℃，2min，30个循环，最后72℃，8min。A．4．3扩增产物的检定A．4．3．1一次PCR：5pL扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳(含0．5mg／mL溴乙锭)分离，(o．5XTBE电泳缓冲液电泳，电压5V／cm，1h～1．5h)，在紫外灯检测仪观察是否有194bp扩增条带。A．4．3．2套式PCR：第一次扩增后(同一次PCR)产物，经第二次扩增后，电泳检测(同一次PCR)，在紫外灯检测仪观察是否有520bp的扩增带。6 GB／T18448．2—2008A．5结果判断A．5．1一次PCR：在阳性、阴性对照成立的条件下，即模板DNA的扩增产物经电泳检测可见到194bp扩增条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测未见到194bp扩增时，可判定弓形虫检测结果。琼脂糖凝胶电泳板在紫外灯检测仪上观察到194bp扩增条带，弓形虫检测阳性。琼脂糖凝胶电泳板在紫外灯检测仪上未观察到194bp扩增条带，弓形虫检测阴性。A．5．2套式PCR：在阳性、阴性对照成立的条件下，即模板DNA的第一次扩增产物经第二次扩增后，电泳检测，可以见到有520bp的扩增带；阴性对照未见到相应扩增带，可判定弓形虫检测结果。第一次扩增后产物经第二次扩增后见到有520bp的扩增带，弓形虫检测阳性。第一次扩增后产物经第二次扩增后未见到有520bp的扩增带，弓形虫检测阴性。A．6注意事项A．6．1整个检测工作应遵循PCR实验室规范，加强安全防护，应有四个隔开的工作区域，分别从事试剂储存和准备、标本制备、扩增和扩增产物分析，以避免发生潜在的交叉污染。A．6．2整个检测工作应加强生物安全防护意识，特别是由虫蛛攻击小鼠产生阳性腹水，并制备模板DNA的工作，必须在生物安全防护2级的条件下进行。'