GBT19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法.pdf 6页

'ICS07.100.30一一C53溥羚中华人民共和国国家标准GBJT19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法DetectionmethodofthehemolysingeneforStreptococcussuistype2byPCR2005-09-27发布2005-11-01实施率督留瞥臀瓣譬篷臀臀暴发“ GB/T19915.9-2005Hi青猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。近年来，随着我国养猪业的发展，该病流行日趋严重，给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。溶血素是猪链球菌2型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌2型溶血素基因，可以作为区分猪链球菌2型无毒菌株与致病菌株的一个指标，特制定本标准。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈国强、唐泰山、张敬友、姜众、王凯民、张常印、林祥梅、吴绍强、刘建、韩雪清、贾广乐、梅琳。 GB/T19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法1范围本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因PCR检测的操作方法。本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌2型溶血素基因的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1猪链球菌2型Streptococcussuistype2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1^34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4缩略语PCRpolymerasechainreaction,聚合酶链式反应DNAdeoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核昔酸三磷酸bybasepair，碱基对5测定方法5.1方法提要以可疑细菌培养物提取的核酸，作为DNA模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。5.2试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。5.2.1猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物：10XPCR缓冲液2.5KL,25mmol/LM9Cl22.0p.L,2.5mmol/LdNTP2uL、上下游引物各1I}AL，用双蒸水补至20tkL。引物序列如下，其目的片段长度为495byoslyl：5"000,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TTA3"（1542)sly2：5"GAA,GAT,TGC,GAG,CAT,TTC,CTG3"(2036)5.2.2TaqDNA聚合酶。 GB/T19915.9-20055.2.3琼脂糖：电泳级。5.2.4澳化乙锭。5.2.5酚：Tris饱和。5.2.6三氯甲烷。5.2.7异戊醇。5.2.8异丙醇。5.2.970％乙醇。5.2.10分子量标记：DL-2000.5.2.11十六烷基三甲基澳化按(CTAB）提取液：0.1mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mmol/LEDTA(pH7.5),200CTAB,0.7mmol/LNaCl,1Yo日一琉基乙醇。5.2.12TE缓冲液：10mmol/l.Tris-HCI(PH8.OMmmol/LEDTA(pH8.0),5.2.1310XPCR缓冲液：100mmol/LKCI,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgS04,200mmol/LTris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA,5.2.14电泳缓冲液：242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。5.2.15加样缓冲液：0.25澳酚蓝，40％蔗糖。5.3仪器和设备5.3.1离心机。5.3.2DNA热循环仪。5.3.3核酸电泳仪。5.3.4pH计。5.3.5移液器：10liL,20p.L,100pL,l000tiL,5.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。5.3.7恒温水浴锅。5.4操作步骤5.4.1样品处理和基因组DNA的提取取可疑细菌的培养物1.0ml,,10000r/min离心1min，沉淀用560juLTE缓冲液悬浮，或挑取可疑细菌菌落，用560pLTE缓冲液悬浮，加人30p.L10％十二烷基硫酸钠（(SDS)和3I.L20g/L蛋白酶K,370C水浴60min后，再加人100KL5mol/LNaCl和80IiLCTAB/NaC1,65℃水浴10min，加人体积比为25s24，1的酚十三氯甲烷＋异戊醇混合液770tAL，混匀，40C12000r/min离心5min，取400uL上清液；加人体积比24s1的三氛甲烷＋异戊醇混合液400pL，混匀，40C12000r/min离心5min，取200p.L上清液加人等体积的异丙醇沉淀；40C12000r/min离心15min，弃上清；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入50川超双蒸水溶解沉淀。也可用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板。5.4.2PCR扩增取比待检菌株数多两只的猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物的PCR管，2000r/min离心10s后各加人Taq酶(2.5U/pL)0.3r.1.，分别加人待检菌株DNA提取物和阴性、阳性核酸对照5.0jiL到PCR管中，2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增。扩增条件为：950C预变性5min;941C1min,560C1min,720C1rnin,35个循环；72℃延伸10min,4℃保存。5.4.3PCR扩增产物电泳检测取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取20j.LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后加样，进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm-5V/cm，电泳时间为30min-35min。将电泳好的凝胶 GB/T19915.9-2005放入终浓度为1j.g/mL的澳化乙锭染色缓冲液中染色15min-20min，在紫外线透射仪或凝胶成像系统上观察结果，并做好试验记录和样品位置。6结果及判断6.1试验结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在495by的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立；否则，结果不成立。6.2结果判断6.2.1在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495by的位置上出现一条特异性条带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因。6.2.2在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495by的位置上未出现一条特异性条带，判为该菌株不含有猪链球菌2型溶血素基因。7废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录Ao GB/T19915.9-2005附录A（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121C,15min-20min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要1210,15min-20min灭菌，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在200-250C贮存的试剂中，可加0.025％的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA.A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染。'