GBT25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法.pdf 6页

'ICS65．020．30B43雪亘中华人民共和国国家标准GB／T25165—2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Protocolofidentificationofbovine，caprine，ovineandporcinederivedmaterialsingelatin--RealtimePCRmethod2010-09-26发布2011-05-01实施宰瞀鹊鬻瓣訾矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪19 前言GB／T25165—2010本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法GB／T25165—20101范围本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。该方法的检出限为0．1％。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB6783食品添加剂明胶GB／T14699．1饲料采样GB／T27403--2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1实时荧光PeRrealtimePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3．2Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。5检测用引物和探针内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1。 GB／T25165—2010表1检测用引物和探针名称序列目的基因内参照5’端引物5r_CCTGAGAAACGGCTACCAT一3’内参照3’端引物5t_CGTGTCAGGATTGGGTAA●37真核生物18SrRNA基因内参照探针5"-(FAM)一TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)37牛5’端引物51_CCGATGGATGTGTTCAGAGCT_3’牛3’端引物5j_GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’生长激素基因牛探针5’一(FAM)一TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)一3’羊57端引物51ACACAACTTCTACCACAACCC一3’羊3’端引物51_AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3’线粒体细胞色素b基因羊探针51_(FAM)一ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA(TAMRA)一3’猪5’端引物5"-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3’猪3’端引物5’C"I叮GGTGGTCGTGGTCACTGT-3’朊蛋白基因猪探针5’一(FAM)一CACCGTCAAGCAGc_(NFQ)(MGB)一3’6试剂苯酚(Tris饱和酚，pH8．0)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70％乙醇。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB／T6682中二级水的要求。7配制溶液7．1裂解液成分包括：2％(质量浓度)CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，i00mmol／I。Tris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1．4mol／LNaCl，20mmol／LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCI调至pH8．0。7．2实时荧光PCR反应混合液12．5“L反应体系包括：1u～2U(Unit，酶学单位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2．5mmol／L～4．0mmol／L的Mg”、0．2u～1U的UNG酶、0．2mmol／L的d(A，C，G)TPs、0．2mmol／I，～0．4mmol／LdUTP、400nmol／LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。8仪器设备8．1实时荧光PCR仪。8．2恒温水浴锅。8．3离心机：离心力不小于30009。8．4微量移液器：o．5pL～10pL，10pL～100pL，20pI。～200卜L，200pL～1000PL。8．5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8．6pH计。8．7天平：感量0．01g。9样品采集按照GB6783对食用明胶采样，按照GB／T14699．1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。2 GB／T25165—201010检验步骤10．1DNA提取称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mL裂解液，室温过夜后置于65℃恒温箱中温育1h～2h，取出后迅速加入与裂解液等体积的室温酚一三氯甲烷一异戊醇(25：24t1)(注意；如果样品因温度下降凝固而无法获得上清，可将样品再次放人65℃恒温箱中使其重新液化)，颠倒混匀，室温下120009离心10rain，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷一异戊醇(24z1)，颠倒混匀，室温下120009离心10rain，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入0．8倍异丙醇或2倍体积的预冷无水乙醇混匀，--20℃放置0．5h～lh，4℃下120009离心10min～15mln，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀一次，4℃下120009离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50止双蒸水，溶解沉淀，一20℃保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照，并置于每个提取系列中的最后。10．2实时荧光PCR扩增反应体系的体积为25“L，体系组成见表2。表2实时荧光PCR检测反应体系组成试剂名称贮备液浓度加入PCR反应体系的体积／”L反应混合液12．55’端引物10／1mol／L137端引物10tLmol／L1探针10Vmol／L1模扳5双燕水朴足至总体积为25实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min；95℃10rain；95℃15s，60℃1rain45个循环。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和提取空白对照。用分别含牛、羊，猪成分的样品作阳性对照，用不含牛、羊、猪成分的样品作阴性对照。样品设3个重复，对照设2个重复，以ct平均值作为最终结果。11结果判定11．1PCR有效性判定空白对照：无FAM荧光信号，相应ct值>40．0。阴性对照：无FAM荧光信号，相应ct值>40．0。阳性对照：有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，ct值≤36．0。否则判定为PcR无效。11．2DNA．提取有效性判定在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现明显的扩增曲线，ct值≤40．0。否则DNA提取无效，应重新提取DNA，直至ct值≤40．0。11．3检测结果判定在符合11．1和11．2的情况下，使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测： GB／T25165—2010如有FAM荧光检出，且ct值≤36．0，则判定样品含有相应的动物源性成分；如ct值>40．0，则判定为不含相应的动物源性成分；如36．o