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'GB4143—84牛冷冻精液Frozensemenofbovine1984-01-271984-09-01 中华人民共和国国家标准牛冷冻精液GB4143—84Frozensemenofbovine本标准适用于奶牛、兼用牛、肉牛和黄牛的冷冻精液产品。1规格与质量1.1剂型细管、颗粒和安瓿。1.2剂量a.细管：中型0.5毫升；微型0.25毫升。b.颗粒0.1±0.01毫升。c.安瓿0.5毫升。1.3精子活力解冻后活力，指呈直线前进运动的精子百分率（下限）30％（即0.3）；精子复苏率（下限）50％。1.4每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数细管：每支（下限）1000万个。颗粒：每粒（下限）1200万个。安瓿：每支（下限）1500万个。1.5解冻后的精子畸形率（上限）20％。1.6解冻后的精子顶体完整率（下限）40％。1.7解冻后的精液无病原性微生物，每毫升中细菌菌落数（上限）1000个。1.8解冻后的精子存活时间在5～8℃贮存时（下限）为12小时；在37℃贮存时（下限）4小时。牛冷冻精液（以下简称“冻精”），必须符合上述各项指标。否则，不得使用。2制作程序2.1采精2.1.1种公牛的质量 用于制作冻精的种公牛，其体型外貌和生产性能，均应合乎本品种的种用公牛特等、一等标准。在目前尚未建立国营种畜后裔测定站的地区，主力公牛必须经过种畜繁育场，进行后裔测定，由省、市、自治区级畜牧科研部门把关。未经后裔测定的种公牛的冻精，必须经过上级主管部门审批，严格控制使用。2.1.2种公牛的体质种公牛必须体质健壮，新引进的公牛，应在隔离场所经过检疫。种公牛须经正式兽医机构和兽医师证明，无下列传染病者，如牛肺疫、布鲁氏杆菌病、牛结核病、牛副结核病、牛白血病、钩端螺旋体病、传染性鼻气管炎、病毒性腹泻病、胎儿弧菌病和阴道滴虫症等。才允许使用。上述各种疫病的检查方法，可按中华人民共和国农牧渔业部颁布的有关规定执行。2.1.3成年种公牛每周可采精两次；每次也可根据具体情况和需要，连续排精两回。采精前，应先用温水清洗公牛阴筒和包皮，然后再用灭菌生理盐水冲洗干净。2.1.4种公牛的新鲜精液，应符合下列质量标准。不具备其中任何一项者，不得用于制作冻精。a.新鲜精液的色泽应呈乳白稍带黄色。b.直线前进运动精子（下限）60％。c.精子密度每毫升（下限）6.0亿。d.精子畸形率（上限）15％。2.2精液的稀释2.2.1稀释保护剂的配制2.2.1.1配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。2.2.1.2所用器具，必须达到牛冷冻精液人工授精技术操作规程的标准，保证清洁、无菌。2.2.1.3推荐下列配方，作为冻精用稀释保护剂a.细管用：第一液蒸馏水100毫升，柠檬酸钠2.97克，卵黄10毫升。第二液取第一液41.75毫升，加入果糖2.5克，甘油7毫升。脱脂奶82毫升，卵黄10毫升，甘油8毫升。b.颗粒用：12％蔗糖液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。12％乳糖液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。2.9％柠檬酸钠液73毫升，卵黄20毫升，甘油7毫升。c.安瓿用：可参照以上各配方酌情使用。上述各类稀释保护剂，在每100毫升中，应加青霉素、链霉素各5～10万单位。 稀释保护剂要现配现用；亦可配后放入4～5℃冰箱中备用，但不应超过一周。2.2.2稀释比例不做具体规定，但必须保证每一剂量（细管、颗粒、安瓿）中，解冻后所含直线前进运动精子数的规定。2.3降温和平衡（预冷）稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1～1.5小时内，使稀释精液的温度降到4～5℃；然后再在同温的恒温容器内平衡2～4小时。2.4冷冻2.4.1制备冻精的操作室，应符合牛人工授精技术操作规程。2.4.2冻精的器具2.4.2.1细管冻精，应采用与细管配套的器具进行。2.4.2.2颗粒冻精，采用聚四氟乙烯板（简称氟板）、铜纱网、尼龙网或铝板均可。2.4.2.3安瓿冻精，采用净容量为0.5毫升的硅酸盐中性玻璃安瓿。以上各种用具，在冻精时，精液容器与液氮面的距离，一般保持1～1.5厘米，初冻温度-80～-120℃。精液在冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。细管精液，不论是用聚乙烯醇封口、钢珠封口，还是超声波塑料热合，都必须将口封严。颗粒精液，每毫升稀释精液，滴冻10±1粒，滴管应事先预冷。操作要准确、规整，每冻完一头公牛精液之后，必须更换滴管、氟板等用具。安瓿精液，用酒精喷灯火焰封口。在制作冻精时，不论是细管、颗粒和安瓿，均应始终注意防止精液温度回升。每冻完一批（头）精液，应立即放入液氮中浸泡，然后计数，取样检查和包装。3检查方法3.1精子活力检查3.1.1颗粒冻精，应先取2.9％二水柠檬酸钠液1～1.5毫升，加温到38±2℃，投放冻精一粒，轻轻摇荡，使之迅速溶化，用压片法，立即在显微镜下检查。3.1.2细管、安瓿冻精，解冻后均应混匀，用压片法在显微镜下检查。3.1.3评定精子活力的显微镜放大倍数，以150～600倍为宜。3.1.4精子死活百分率检查，可采用染色法或升温血球计计算法。3.1.5检查用的显微镜载物台温度，应保持38～40℃；也可用显微镜和闭路电视的连接装置，在荧光屏上检查。3.1.6每批冻精，应随机取样两份，分别解冻检查。每个样品应观察三个以上的视野，注意不同液层内 的精子运动状态，进行全面评定。3.1.7检查次数，应在冷冻后当时一次（或间隔24小时再做一次），合格者贮存。冻精发放前再抽样检查，合格者方准予发放。3.2精子密度检查3.2.1检查用具：以用血球计算器为准；用光电比色计或其他电子仪器检查，都必须用血球计算器做出可靠的校正值。3.2.2每批冻精应进行密度检查，以确定稀释比例。3.3精子畸形率定期抽样检查取新鲜和解冻后的精液样品，放在载玻片上，按常规方法制成抹片，风干后在显微镜下检查畸形精子数，每个精液样品应观察精子总数500个，计算其中畸形精子百分率。不合格者，不得制作冷冻精液和贮存使用。3.4解冻后精子顶体完整率的定期抽样检查采用姬姆萨染色法镜检或用干扰相差（湿样品）镜检，每个样品观察精子总数500个。3.5冻精中细菌的定期检查取0.2毫升解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24小时，统计出现的菌落数。3.6解冻后的精子存活时间定期检查细管、安瓿冻精解冻后不再稀释；颗粒冻精以2.9％二水柠檬酸钠液解冻，在5～8℃或37℃下贮存，在38～40℃下镜检。上述定期抽样检查，每头公牛每月（下限）1次。4使用方法4.1解冻4.1.1细管、安瓿冻精，可用38±2℃温水直接浸泡解冻。4.1.2颗粒冻精，应一次一粒，用38±2℃1～1.5毫升解冻液解冻；多于两粒时，应分别解冻。4.1.3解冻液配制a.配制2.9％二水柠檬酸钠液，用2毫升灭菌安瓿封装，解冻液净容量（下限）1.5毫升。b.蒸馏水100毫升，葡萄糖3.0克，柠檬酸钠1.4克。c.蒸馏水100毫升，柠檬酸钠1.7克，蔗糖1.15克，氨苯磺胺0.3克，磷酸二氢钾0.325克，炭酸氢钠0.09克，青霉素、链霉素各10万单位。4.1.4解冻后的使用时间细管和安瓿精液（上限）为1小时；颗粒精液（上限）为2小时。如解冻后的精液需要外运时，应采取低温（10～15℃）解冻，然后用脱脂棉或多层纱布包裹，外边用 塑料袋包好，置4～5℃下贮存。其使用时间（上限）为8小时。4.2输精4.2.1每头发情母牛，每次输精应用解冻精液一个剂量（细管、颗粒或安瓿）。输精之前，必须再进行一次精子活力评定，不够标准者不许使用。4.2.2应推行直肠把握子宫颈深部输精法。4.2.3每一情期输精1～2次。要做到输精适时和输精器适深、慢插、轻注、缓出、防止精液逆流。5包装、标记、贮存和运输5.1包装5.1.1细管冻精应封闭良好。5.1.2颗粒冻精必须用无菌容器包装。每一容器以装冻精50～100粒为一个单位。5.1.3安瓿冻精可放在液氮生物容器的提筒中，应防止碰撞。5.2标记5.2.1细管、安瓿表面和盛装颗粒冻精的容器外面，均应有鲜明的标记。注明站名代号〔按国家统一规定的省、市、自治区的代号〕、公牛品种、名号、精液制冻日期（年月日或批号）以及该批冻精的精子活力和份数。5.2.2不同品种公牛的冻精，可用不同颜色包装加以区别；其包装颜色和公牛品种、品种代号见表。冻精包装容器颜色公牛品种品种代号（细管、颗粒、安瓿）奶牛白色中国黑白花HB沙西瓦SX兼用牛粉红色西门塔尔XM苏系S-XM德系D-XM奥系A-XM瑞系R-XM兼用短角JD草原红牛CH新疆褐牛XH三河牛SH肉牛草绿色肉用短角RD夏洛来XL海福特HF安格斯AG 利木赞LM莫累灰ML肉牛草绿色圣格特鲁迪斯SG抗旱王KH辛地红XD婆罗门PM婆拉福PL黄牛浅黄色南阳牛NY秦川牛QC延边牛YB鲁西黄牛LX晋南牛JN复州牛FZ朝鲜牛CX蒙古牛MG5.3贮存5.3.1用干冰贮存时，应根据贮存容器的大小，及时补充干冰，包装的精液不得外露。5.3.2用液氮生物容器贮存时，容器内液氮必须浸没冻精。5.3.3应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，应立即将冻精转移到其他完好的容器内。5.3.4取放冻精之后，应及时盖好容器塞，防止液氮蒸发或异物浸入。5.3.5液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清理，清洗时，先用中性洗涤剂洗刷，再用40～45℃温水冲洗干净，在室温下放置48小时以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清理和洗刷。5.3.6取放冻精时，提筒只许提到容器的颈下，严禁提到外边，停留时间（上限）10秒。如向另一容器转移冻精时，盛冻精的提筒离开液氮面的时间（上限）5秒。5.3.7大型液氮生物容器，应有冻精分类存放位置的详细图表，分别注册，登记清楚，并应备有足够的液氮生物容器，严防不同品种和不同个体公牛的冻精混淆。无继续贮存价值的冻精，应及时报请上级主管部门批准，妥善销毁。5.4运输5.4.1移动液氮生物容器时，应把握其手柄、轻拿轻放，防止冲撞。5.4.2贮精和贮液氮的生物容器，均不可横放、叠放或倒置。装车运输时，应在车箱板上加防震胶垫、毡垫或泡沫塑料垫。容器加外套，并根据运输条件，用厚纸箱或木箱装好，牢固地系在车上，严防冲击倾倒。5.4.3运输冻精时，应有专人负责，办好交接手续（应附带精液运输、交接卡片）。途中应及时检查和补充冷源。5.4.4用干冰运输冻精时，液氮生物容器必须盖严，干冰必须敷过冻精。 附录A评定受胎效果的方法（补充件）A.1对授精的母牛，应通过直肠触模卵巢和子宫法，确定其受胎与否。亦可根据最末一次输精后30～60天或60～90天不返情头次，计算不返情率，但必须做好试情工作，防止漏情错配或失配。有条件的场所，可采用放射免疫测定法（RIA）或超声波探测法做早期妊娠诊断。A.2计算方法A.2.1第一次授精情期受胎率＝（第一次授精受胎母牛数／第一次受配母牛数）×100…………（1）注：第一次受配未受胎母牛，再度受配时，不计算在内。A.2.2平均情期受胎率＝（受胎母牛总数／受配情期总数）×100…………………………………（2）A.2.3总受胎率＝（受配母牛总数／受配情期总数）×100…………………………………………（3）A.2.4不返情率＝（不返情数／受配母牛头数）×100………………………………………………（4）注：计算不返情率时，应注明输精后的天数。评定冷冻精液受胎效果（技术水平），主要以A.2.1为标志；生产指标（生产水平），以A.2.3为依据。'