DB13T1238-2010 速冻机削（切）牛、羊肉片.pdf 17页

'ICS67.120.10X22DB13J卜、竺竺，.，r月﹄}Pi省地方标准DB13/T1238-2010速冻机削(切)牛、羊肉片2010-05-10发布2010-05-25实施河北省质量技术监督局发布 DB13/T1238-2010月Ij舀本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由邢台市质量技术监督局提出。本标准由河北省食品标准化技术委员会归口。本标准起草单位:邢台市标准化协会、邢台市质量技术监督局桥东区分局。本标准主要起草人:谢群英、田文阁、郭少英、范淑敏、傅锋、刘荣琴。 DB13/T1238-2010速冻机削(切)牛、羊肉片范围本标准规定了速冻牛、羊肉片的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。本标准适用于以速冻生牛、羊肉为原料，经过切片、整理、速冻、包装制成的速冻牛、羊肉片(以下简称肉片)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB2707鲜(冻)畜肉卫生标准GB2762食品中污染物限量GB2763食品中农药最大残留限量GB/T5009.11食品中总砷及无机砷的测定GB/T5009.12食品中铅的测定GB/T5009.15食品中锅的测定GB/T5009.17食品中总汞及有机汞的测定GB/T5009.33食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定GB/T5009.44肉与肉制品卫生标准的分析方法GB/T5009.123食品中铬的测定GB/T6388运输包装收发货标志GB/T6543运输包装用单瓦楞纸箱和双瓦楞纸箱GB7718预包装食品标签通则GB/T9695.19肉与肉制品取样方法GB/T9961鲜、冻胭体羊肉GB/T17238鲜、冻分割牛肉GB18394畜禽肉水分限量GB18406.3农产品安全质量无公害畜禽肉产品安全要求GB/T20940肉类制品企业良好操作规范NY1165羔羊肉JJF1070定量包装商品净含量计量检验规则《定量包装商品计量监督管理办法》国家质检总局(2005)第75号令(食品标识管理规定》国家质检总局(2007)第102号令《动物性食品中兽药残留最高限量》农业部2002年第235号公告3要求3.1原料要求3.1.1原料肉应来自非疫区，并持有当地动物防疫监督机构出具的检疫证明。3.1.2原料肉的污染物限量应符合GB2762的规定。 DB13/T1238-20103.1.3原料肉的水分应符合GB18394的规定。3.1.4原料羊肉的卫生标准应符合GB2707规定的要求，原料质量应符合GB/T9961规定的要求。羔羊肉应符合NY1165规定的要求。3.1.5原料牛肉的卫生标准应符合GB2707规定的要求，原料质量应符合GB/T17238中胭体牛肉各种部位品种的要求。3.2感官要求感官要求应符合表1的规定。表1感官要求项目要求形状色泽肌肉呈红色，有光泽，脂肪呈白色或淡黄色。组织形态片与片的间无粘连、肌纤维致密。粘度切面光滑、不粘手。气味具有牛、羊肉固有的气味，无异味。煮沸后肉汤澄清透明，脂肪团聚集于表面，具有该品种固有的味道。肉眼可见异物无脆骨、硬骨及血管、脏器、淋巴、毛、绒。其他杂质不得检出。3.3理化指标理化指标应符合表2的规定。表2理化指标项目指标解冻失水率毛10%包装中心温度〔一巧℃挥发性盐基氮/(mg/100g)(总汞(以Hg计)/(mg/kg)〔铅(以Pb计)/(mg/kg)〔应符合GB2707的规定无机砷(以As计)/(mg/kg)锡(以Cd计)/(mg/kg)铬(以Cr计)/(mfg)应符合GB2762的规定亚硝酸盐(以NaNO2计)/(m留g/kgg)<-3.4微生物指标微生物指标应符合GB18406.3的规定。3.5农药残留农药残留应符合GB2763的规定。3.6兽药残留 DB13/T1238-2010兽药残留应符合动物源性食品中兽药残留最高限量的规定。3.7肉片动物性成分肉片不得添加任何牛、羊肉以外的禽畜肉制品。3.8净含量负偏差应符合《定量包装商品计量监督管理办法》。3.9工厂加工条件应符合GB/T20940规定的条件。4试验方法4.1取样取样方法按GB/T9695.19的规定执行。4.2感官要求4.2.1形状、色泽、组织形态、气味和肉眼可见异物将样品置于白色磁盘内，观察冻结、颜色和肌肉组织状态，嗅其气味。采用直尺测量肉片的尺寸，用镊子检查异物。4.2.2粘度将样品置于白色磁盘内，用手触、目测。4.2.3煮沸后肉汤称取20g绞碎试样，置于200ml烧杯中加100ml水，用表面皿盖上加热500C一600C，开盖检查气味，继续加热煮沸20min-30min，检查肉汤的气味、滋味和透明度，以及脂肪的气体和滋味。4.3解冻失水率4.3.1抽样在成品中随机抽取样品1000g，精确到0.01go500g做试验，另500g留作备样保存。4.3.2样品处理将样品置于洁净、干燥的容器中，采用室温自然解冻方法解冻，解冻中样品不应受挤压。解冻时间视室温环境而定，待样品完全解冻完毕后，称取样品重量。4.3.3结果计算:按下式计算失水率X(%)=(Ml一M2)/M1x100...............······⋯⋯(1)式中:x一解冻失水率(%);Mi一解冻前样品质量(g);M2一解冻后样品质量(g)。4.4包装中心温度使用士1℃的非水银温度计，插入包装中间部分2min，读取温度计度数。 DB13/T1238-20104.5理化指标4.5.1挥发性盐基氮:按GB/T5009.44的规定执行。4.5.2铅:按GB/T5009.12的规定执行。4.5.3无机砷:按GB/T5009.11的规定执行。4.5.4总汞:按GB/T5009.17的规定执行。4.5.5锅:按GB/T5009.15的规定执行。4.5.6铬:按GB/T5009.123的规定执行。4.5.7亚硝酸盐:按GB/T5009.33的规定执行。4.6微生物指标按GB18406.3的规定执行。4.7农药残留指标按GB2763的规定执行。4.8兽药残留按GB18406.3的规定执行。4.9肉片动物性成分掺伪试验按附录A的规定执行。4.10净含量按JJF1070的规定执行。5检验规则5.1组批同一班次、同一规格、同一品种的产品为一批。5.2出厂检验5.2.1产品出厂前，应由本厂检验部门逐批进行检验，检验合格后，出具合格证书，并在包装箱内(外)附有合格证，经检验合格后产品方可出厂。5.2.2抽样方法和数量每批随机抽取2吨。1雌用于检验，1吨保留样品。5.2.3出厂检验项目5.2.4净含量、感官、菌落总数为每批必检项目，其它项目做不定期抽检。5.3型式检验5.3.1正常生产时型式检验为半年，有下列情况的一时亦应进行:—原料、工艺有较大改变，影响到产品性能时;—产品停产三个月以上恢复生产时;—出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时; DB13/T1238-2010—国家质量监督机构提出进行型式检验要求时。5.3.2型式检验的抽样方法和数量5.3.3从任一批产品中，随机抽取2kg。1kg用于检验，1kg留样备用。5.3.4型式检验项目:包括本标准3.2-3.8中的项目。5.4判定规则5.4.1出厂检验结果判定5.4.1.1出厂检验项目全部符合本标准，判为合格品。5.4.1.2出厂检验项目有一项不符合本标准，可以加倍抽样复检。复检后仍不符合本标准则判为不合格品。5.4.1.3微生物指标一项不符合本标准，判为不合格品，不应复检。5.4.2型式检验结果判定5.4.2.1型式检验项目全部符合本标准为合格品。5.4.2.2型式检验项目不超过3项不符合本标准，可以加倍抽样复检。复检后有一项不符合本标准，判为不合格品。超过3项不符合本标准，不应复检，判为不合格品。5.4.2.3微生物指标不符合本标准，判为不合格品，不应复检。6标签、标识与标志6.1标签销售包装的标签应符合GB7718的规定的要求。应标明:产品名称、净含量、厂名、厂址、产地、生产日期、保质期、产品标准代号、食用方法、贮存方法等。产品最小包装应标明动物检验检疫合格标」;,moo6.2标识产品的标识应符合《食品标识管理规定》的要求。6.3标志产品的运输标志应符合GB/T6388的规定。7包装、运输、销售和贮存7.1包装内包装材料应符合国家卫生标准和有关规定，外包装箱应符合GB/T6543的规定。7.2运输运输工具应符合卫生要求，运输时不得与有毒有害、有异味、有腐蚀性的货物混装、混放。运输车辆应采用机械制冷冷藏车在一巧℃环境下运输。运输中防止挤压、雨淋，装卸时轻搬轻放。7.3销售应在冷冻条件下销售，低温陈列柜内产品的温度不得高于一180C，产品的储存和陈列应与未包装的冷冻产品分开。 DB13/T1238-20107.4贮存7.4仓库要求;库温应达到一180C，温度升降幅度不超过2"C，并且保持卫生洁净。7.4.2码垛要求:不高于5层。7.4.3保质期:在一18℃产品密封的条件下保质期为6个月。 DB13/T1238-2010附录A(规范性附录)食品中动物性成分检验方法一定性筛选检验A.1原理聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)方法及即时聚合酶链反应(real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)方法。A.2工作环境工作平台需宽敞、洁净、光线良好。检体前处理、检体DNA抽取、PCR试剂配制及PCR等实验过程皆需有区隔空间，避免交叉污染。PCR试剂的配制应于无菌操作台内进行。A.2.1装置(注，，A.1.1.1分光光度计:具波长260nm.280nm,^.1.1.2旋涡混合器(Vortexmixer)。A.1.1.3真空干燥装置:供DNA干燥用。A.1.1.4真空冷冻干燥装置:温度可达一40℃以下，真空度可达133mBar以下，供检体干燥用。A.1.1.5加热震荡器:具55℃温控及震荡功能。A.1.1.6微量冷冻离心机:可达20,000Xg，并具4℃温控功能。A.1.1.7离心机:供各式离心管离心用。^.1.1.8聚合酶链反应器:ABIPRISM9700SequenceDetector，或同级品。^.，.1.9即时聚合酶链反应器‘注”:ABIPRISM7700SequenceDetector或RocheLightCycler，或同级品。A.1.1.10电泳槽:供DNA电泳用。A.1.1.11震荡型粉碎机:RetschMM200，或同级品。^.1.1.12照相装置:供拍摄电泳胶片用。A.1.1.13紫外灯箱:具波长312nm.365nm紫外灯。A.1.1.14冷冻设备:具冷藏及冻结功能。A.1.1.15高压灭菌釜。A.1.1.16pH测定仪A.1.1.17水浴装置:温差在士1℃以内者。A.1.1.18天平:最大秤重量为2,000g，灵敏度为0.1g;最大秤重量为100g，灵敏度为1mgoA.1.1.19无菌操作台。注1:本方法所使用或提及的产品品牌不代表为同类产品中最好者;反的，未使用或提及的产品品牌亦不代表为同类产品中较差者。注2:确认试验用。A.1.2试剂A.1.2.1DNA抽取用:RNase、乙醇(96-100%)均采分子生物分析级试剂，DNeasyTissue套组。 DB13/T1238-2010A.1.2.2PCR用A.1.2.2.1鉴别试验用引子‘注3)A.1.2.2.2动物类(标的基因:16SribosomalRNA)引子F:SF,5"-AAGACGAGAAGACCCT(A/G)TGGA(A/G)CTTTA-3"引子R:S民5"-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3"PCR增幅产物大小234-265bpA.1.2.2.3哺乳类及家禽类(标的基因:myostatin)引子F:MYF,5"-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3"引子R:MYR,5"-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3"PCR增幅产物大小97bpA.1.2.2.4焦类(标的基因:16SribosomalRNA)引子F:FSF,5"-CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3"引子R:FSR,5"-TCGGTAGGTTTGTCACCTCTACTC-3"PCR增幅产物大小234bpA.1.2.3确认试验用引子及探针‘a4)A.1.2.3.1动物类(标的基因:16SribosomalRNA)引子F:SF,5"-AAGACGAGAAGACCCT(A/G)TGGA(A/G)CTTTA-3"引子R:SR,5"-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3"探针P:SP,5’一(FA峋-TT(C/T)GGTTGGGGTGACCTCGG(A/G)GT-(TAMRA)-3"PCR增幅产物大小234-265bpA.1.2.3.2哺乳类及家禽类(标的基因:myostatin)引子F:MYF,5"-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3"引子R:MYR,5"-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3"探针P:MYP,5"一(FAM)-CCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTG-(TAMRA)-3"PCR增幅产物大小97bpA.1.2.3.3焦类(标的基因:16SribosomalRNA)引子F:FSF,5"-CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3"引子R:FSR,5"-TCGGTAGGTTTGTCACCTCTACTC-3"探针P:FSP,5’一(FAM)-TCCCACTCTTTTGCCACAGAGACGG-(TAMRA)-3"PCR增幅产物大小234bp注3:合成的引子，拆封后，以无菌纯水稀释成适当浓度，分装后置于一20℃贮存备用。注4:合成的探针，拆封后，以无菌纯水稀释成适当浓度，分装后置于一20℃贮存备用，探针需避光保存。探针5"端采用6-carboxy-fluorescein(FAM)标记，3’端采用6-carboxytetramethyl-rhodamine(TAMRA)标记。^.1.2.4去氧核糖核昔三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP)含去氧腺昔三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate,dATP)，去氧胞昔三磷酸(deoxycytidinetriphosphate,dCTP)，去氧鸟嘿吟普三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate,dGTP)及去氧胸昔三磷酸(deoxythymidinetriphosphate,dTTP)各2.5mM的溶液。A.1.2.5聚合酶TaqDNApolymerase(2U/gL)。A.1.2.6TaqManUniversalPCRMasterMix(确认试验用，适用于ABIPRISM7700)内含PCR所需去氧核糖核昔三磷酸、聚合酶等试剂，使用者仅需自行添加引子、探针及待测检体DNA即可。 DB13/T1238-2010A.1.2.7LightCycler-FastStartDNAMasterHybridizationProbes(确认试验用，适用于RocheLightCycler)内含PCR所需去氧核糖核普三磷酸、聚合酶等试剂，使用者仅需自行添加引子、探针及待测检体DNA即可。A.1.2.8电泳用:嗅化乙锭(ethidiumbromide)、琼脂(agarose)、澳酚蓝(bromophenolblue)、二甲苯蓝(xylenecyanolFF)、乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,Nat-EDTA)、三经甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane(iris))、甘油、硼酸，均采分子生物分析级试剂。DNA分子量标记物质(DNAmolecularweightmarker):100-bpDNALadderMarkeroA.1.2.9对照用物质:肉类、血液及其组织器官等皆可，或使用行政院卫生署药物食品检验局提供编号pIDM2及pIDM3的参考质体作为对照用物质。A.1.3器具及材料‘注5)A.1.3.1吸管(Pipette):105L.205L.1005L,2005L及10005L0A.1.3.2电泳胶片制作盘。A.1.3.3吸管尖头(Pipettetips):105L,205L,200gL及10005L0A.1.3.4离心管:2005L.6005L,1.5mL及2mL。^.1.3.5PCR反应管:200.tL及5005L0^.1.3.6PCR玻璃毛细管‘a6):RocheLightCycler专用。A.1.3.7玻璃或塑料瓶:50mL,100mL.250mL,500mL.1000mL及2000mLaA.1.3.8塑料离心管:50mLoA.1.3.9过滤膜:孔径为0.455m，材质为nitro-celluloseo注5:使用的塑胶或玻璃器皿均为无DNase污染。注6:仪器使用RocheLightCycler时，才需使用。A.1.4试剂的配制A.1.4.15倍TBE(Tris-borate-EDTA)缓冲溶液称取三轻甲基氨基甲烷54g、硼酸27.5g及0.5MpH8.0EDTA溶液20mL，加水溶解后定容至1000mL，供作5倍TBE缓冲溶液。临用前以水稀释为0.5倍。A.1.4.22%胶片称取琼脂2g，加入0.5倍TBE缓冲溶液100mL，加热搅拌至琼脂完全溶解，适当冷却后，倒入电泳胶片制作盘，并置入适当的尺梳，待胶片凝固后，即可使用。A.1.4.36倍载入胶片缓冲溶液(6Xgelloadingbufer)称取澳酚蓝25g、二甲苯蓝0.25g及量取甘油30mL，加入无菌纯水使成100mL，并置于40C冰箱贮存备用。A.1.4.4胶片染液称取澳化乙锭0.1g，加水10mL溶解，供作原液(含澳化乙锭10mg/mL)，使用前需以水稀释成含澳化乙锭15g/mL澳化乙锭为致癌物质，配制时应注意安全。A.1.4.5PCR溶液‘注7)A.1.4.5.1鉴别试验用 DB13/T1238-201010倍PCR缓冲溶液(含15mMMgC12).............................⋯⋯2.55LTaqDNApolymerase(2U/5L).....................................⋯⋯1.0pL2.5mMdNTP·........................⋯⋯，....................⋯⋯4.05L105M引子F...................................................⋯⋯1.05L105M引子R...................................................⋯⋯1.05L模版DNA溶液(总量100ng).....................................⋯⋯5.0pL无菌纯水.......................................................⋯⋯10.55L总体积.........................................................⋯⋯25.05LA.1.4.5.2ABIPRISM7700SequenceDetector确认用55M引子F....................................................⋯⋯1.25gL5pM引子R..........................................................1.255L3.35M探针P....................................................⋯⋯1.75LTaqManUniversalPCRMasterMix..................................⋯⋯12.55L模版DNA溶液(总量100ng).....................................⋯⋯5.05L无菌纯水⋯⋯，.................................................⋯⋯3.35L总体积..........................................................⋯⋯25.0gLA.1.4.5.3RocheLightCycler确认试验用55M引子F....⋯⋯，...........................................⋯⋯1.55L55M引子R...........................................................1.55L3.35M探针P...................................................⋯⋯1.55LLightCycler-FastStartDNAMasterHybridizationProbes...................⋯⋯2.05L25mmMgC12溶液.....................................⋯⋯，....⋯⋯2.45L模版DNA溶液(总量100ng).....................................⋯⋯5.05L无菌纯水........................................................⋯⋯6.15L总体积.........................................................⋯⋯20.05L注7:PCR溶液应置于冰浴中配制。A.1.5检体DNA的制备A.1.5.1检体的处理检体为干燥肉干或粉(碎)状者，可直接以粉碎机研磨成细粉。检体为湮状肉块或肉加工品，经冷冻干燥处理后，再以粉碎机研磨成细粉备用。检体需贮存于干燥及冷藏或冷冻环境中。A.1.5.2DNA的抽取采用DNeasyTissue套组及内附试剂、材料(ATL试剂、proteinaseK试剂、AL试剂、离心管柱(DNeasyspincolumn)、收集管、AW1.AW2与AE试剂)，亦可采用其他市售套组。A.1.5.2.1称取检体约25mg`tee"，置入2mL离心管。A.1.5.2.2加入ATL试剂1805L以及proteinaseK205L，以旋涡混合器混合均匀。A.1.5.2.3于55℃振荡反应直到检体溶解。A.1.5.2.4加入AL试剂200.tL，以旋涡混合器混合均匀。A.1.5.2.5水浴700C，10分钟。A.1.5.2.6加入乙醇(96-100%)2005L，以旋涡混合器混合均匀。A.1.5.2.7取混合液注入离心管柱，以>_6,000Xg(8,000rpm)离心1分钟，并将收集管及滤液丢弃。 DB13/T1238-2010A.1.5.2.8将离心管柱套入新的收集管，注入AW1试剂5005L到离心管柱，以>6,000Xg(8,000rpm)离心1分钟后，将收集管及滤液丢弃。A.1.5.2.9将离心管柱套入新的收集管，注入AW2试剂500gL到离心管柱，以20,000Xg(14,000rpm)离心3分钟后，将收集管及滤液丢弃。A.1.5.2.10将离心管柱套入新的1.5mL离心管。A.1.5.2.11加入AE试剂1005L至离心管柱，于室温下静置1分钟后，再以>_6,000Xg(8,000rpm)离心1分钟，再重复此溶出步骤一次。A.1.5.2.12将溶出液(约200pL)收集至己灭菌的1.5mL离心管，为萃取DNA原液。A.1.5.2.13依2.6.3.2.节测量DNA浓度并记录后，置于一20℃冷冻保存。注8:抽取脾脏等含细胞数量呆多的组织DNA，称取量不可超过10mg。抽取肝脏或肾脏等含丰富RNA的组织DNA,于步骤2.6.2.4.的后加入RNase(100mg/mL)45L,混合均匀后于室温下静置2分钟。A.1.5.3DNA浓度测定及纯度判断A1.5.31检体DNA溶液于使用前自冷冻库中取出，于室温下进行溶解。A1.5.32取适当量的DNA溶液以无菌纯水做适当倍数的稀释，分别测定260nm及280nm的吸光值(0.D.)。计算DNA浓度系以O.D.260吸光值乘50n留5L即为DNA溶液浓度。DNA溶液纯度则以0.D.260/0.D.:，。比值作判断，其比值应介于1.7-2.0间。A.1.6鉴别试验‘注9)PCR操作步骤以无菌纯水适当稀释DNA溶液、引子备用。取PCR反应管，并依照2.5.5.1.节配制PCR溶液，依序加入无菌纯水、10倍PCR缓冲溶液、dNTP、引子、DNApolymerase及DNA溶液，混合均匀后，将反应管置于离心机瞬间离心，使混合液聚集于反应管的底部。移入PCR反应器，依据引子类别并参照节设定反应条件，进行反应，结束后，取出PCR增幅产物，进行电泳分析。A.1.6.2PCR条件表PCR条件步骤温度时简1.最初变性95℃5min2.变性950C30sec3.接测试动物类基因600C30sec测试哺乳类及家禽类基因540C30sec测试焦类基因600C30sec4.延展720C30sec5.最终延展720C7min步骤2至步骤4，共进行40个循环反应。胶片电泳分析取适量的6倍载入胶片缓冲溶液，分别与无菌纯水(空白组)及PCR增幅产物混合均匀，注入2%胶片孔中，以50或100伏特电压进行电泳。同时，必须取DNA分子量标记物质进行电泳，作为PCR增幅产物大小的判别与计算依据。经电泳后的胶片置入胶片染液中进行染色约15分钟，续置入水中漂 DB13/T1238-2010洗及褪染，再置于紫外灯箱上，以波长365am的紫外光照射观察是否有明显的DNA荧光判，并判读桔果。每次实验必须同时测试正反应及负反应对照组。A.1.6.4鉴别A.1.6.4.1Al试动物类基因:检体DNA的PCR增幅产物电泳结果，须与正反应对照组及DNA分子量标记物质的电泳结果进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组DNA二者皆出现PCR增幅产物，且经由DNA分子量标记物质估算PCR增幅产物大小介于234-265bp者‘a10)，即判定该检体含有动物性成分。A.1.6.4.2测试哺乳类及家禽类基因:检体DNA的PCR增幅产物电泳结果，镇与正反应对照组及DNA分子量标记物质的电泳结果进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组DNA二者皆出现PCR增幅产物，且经由DNA分子量标记物质估算PCR增幅产物大小为97bp者，即判定该检体含有哺乳类或家禽类动物性成分。A.1.6.4.3测试焦类基因:检体DNA的PCR增幅产物电泳结果，须与正反应对照组及DNA分子量标记物质的电泳结果进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组DNA二者皆出现PCR增幅产物，且经由DNA分子量标记物质估算PCR增幅产物大小为234bp者，即判定该检体含有焦类动物性成分。注9:PCR鉴别试验结果的判读系以PCR增幅产物大小判定，当测试结果判读困难时，建议进行确认试验。本PCR定性反应条件系采ABIPRISM9700设定的，当使用其他机型时，应自行检讨反应条件。注10:动物类基因的PCR增幅产物大小介于234-265bp者，皆为正反应。A.1.7确认试验:本实验视需要而操作的。A.1.7.1RT-PCR操作步骤A.1.7.1.1RT-PCR-ABIPRISM7700SequenceDetector以无菌纯水适当稀释检体DNA溶液、引子及探针备用。取适量无菌纯水，并依照2.5.5.2.节配制PCR溶液，依序加入MasterMix、稀释过的引子及探针，混合均匀后，分装205L入PCR反应管中，再各别加入稀释过的检体DNA溶液55L，最后将PCR反应管置于离心机中，以200Xg(1,500rpm)瞬间离心，移入RT-PCR反应器，依下列条件进行反应。每次实验皆镇制作负反应及正反应对照组。表2R下一PCR操作步骤步骤温度时r-71.热活化500C2min2.最初变性950C10min3.变性950C15sec4.接、延展测试动物类基因600C1min测试哺乳类及家禽类基因540C1min测试焦类基因600C1min5.冷却350C45sec步骤3至步骤4，共进行45个循环反应。A.1.7.1.2RT-PCR-RocheLightCycler以无菌纯水适当稀释检体DNA溶液、引子及探针备用。取适量无菌纯水，并依照2.5.5.3.节配制PCR溶液，依序加入LightCycler-FastStartDNAMasterHybridizationProbes、稀释过的引子及探针，混合均匀后，分装155L于玻璃毛细管中，再各别加入稀释过的检体DNA55L，最后将毛细管置于 DB13/T1238-2010离心机中，以800Xg(3,000rpm)瞬间离心，移入RT-PCR反应器，依下列条件进行反应。每次实验皆须制作负反应及正反应对照组。表3RT-PCR一RocheLightCycler步骤温度时简1.最初变性950C10min2.变性950C5sec3.薪接测试动物类基因600C25sec测试哺乳类及家禽类基因54℃25sec测试焦类基因600C25sec4.延展720C8sec5.冷却350C45sec步骤2至步骤4，共进行45个循环反应。A.1.7.2RT-PCR荧光分析检体DNA经RT-PCR后，直接从RT-PCR反应器上的荧幕观察探针所产生的荧光增幅曲线，即可判读反应结果。每次实验必须同时测试正反应及负反应对照组。A.1.7.3确认A.1.7.3.1测试动物类基因:检体DNA的RT-PCR增幅产物荧光分析图须与正反应对照组荧光分析图进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组的RT-PCR荧光分析图，皆出现经由探针所产生的荧光增幅曲线，即确认该RT-PCR增幅产物为动物物种的基因片段，可确认该检体中含有动物性成分。A.1.7.3.2测试哺乳类及家禽类基因:检体DNA的RT-PCR增幅产物荧光分析图须与正反应对照组荧光分析图进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组的RT-PCR荧光分析图，皆出现经由探针所产生的荧光增幅曲线，即确认该RT-PCR增幅产物为哺乳类或家禽类动物物种的基因片段，可确认该检体中含有哺乳类或家禽类动物性成分。A.1.7.3.3测试焦类基因:检体DNA的RT-PCR增幅产物荧光分析图须与正反应对照组荧光分析图进行相互比对，当检体DNA与正反应对照组的RT-PCR荧光分析图，皆出现经由探针所产生的荧光增幅曲线，即确认该RT-PCR增幅产物为焦类动物物种的基因片段，可确认该检体中含有焦类动物性成分。A.1.7.4判定(附图)1.以PCR或RT-PCR测试为动物类负反应，表示不含动物性成分2.以PCR或RT-PCR测试为动物类正反应，及以PCR或RT-PCR测试亦为哺乳类及家禽类正反应，且以PCR或RT-PCR测试亦为焦类正反应，表示含哺乳类或/及家禽类及焦类动物性成分，及可能尚含其他类动物性成分。 DB13/T1238-20103.以PCR或RT-PCR测试为动物类正反应，及以PCR或RT-PCR测试亦为哺乳类及家禽类正反应，且以PCR或RT-PCR测试为焦类负反应，表示含哺乳类或/及家禽类动物性成分，及可能尚含其他类动物性成分。4.以PCR或RT-PCR测试为动物类正反应，及以PCR或RT-PCR测试为哺乳类及家禽类负反应，且以PCR或RT-PCR测试为焦类正反应，表示含焦类动物性成分，及可能尚含其他类动物性成分。5.以PCR或RT-PCR测试为动物类正反应，及以PCR或RT-PCR测试为哺乳类及家禽类负反应，且以PCR或RT-PCR测试为焦类负反应，表示含其他类动物性成分。备注:1、本检验方法最低检测浓度为0.1%(以干重计)。2、本检验方法的测试范围系指能够抽取出DNA者的食品，经过高度加工或不含DNA的食品不适用于本检验方法。附图食品中动物性成分的定性筛选检验流程哺乳类及家禽类(RT)PCR+}鱼类(RT)PCR一}+含哺乳类、家禽类含哺乳类、家禽类含鱼类含其他类动物性成分及鱼类(可能还含其他类)(可能还含其他类)(可能还含其他类) 0一0闪一8仍闪一1的一国0'