DB440300T32.1-2007农业转基因生物食用安全性检验第1部分样品制备.pdf 19页

'免费标准网(www.freebz.net)ICS65.020.01B04DB深圳市农业地方标准DB440300/T32.1—2007农业转基因生物食用安全性检验第1部分：样品制备Ediblesafetydeterminationofagriculturegeneticallymodifiedorganisms—PartI:Methodforsamplepreparation2007-11-12发布2008-02-12实施深圳市质量技术监督局发布免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007目次前言.................................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13术语和定义..........................................................................14DNA样品制备........................................................................15RNA样品制备........................................................................26蛋白质样品制备......................................................................37外源基因表达产物制备................................................................3附录A（规范性附录）DNA样品制备....................................................5A.1DNA样品制备常用试剂及仪器........................................................5A.2DNA提取方法......................................................................6附录B（规范性附录）RNA样品制备.....................................................8B.1RNA样品制备常用试剂及仪器.........................................................8B.2RNA提取方法.......................................................................8附录C（规范性附录）蛋白质样品制备..................................................10C.1蛋白质样品制备常用试剂及仪器.....................................................10C.2蛋白质提取制备方法...............................................................10附录D（规范性附录）外源基因表达产物制备............................................11D.1外源基因表达产物制备常用试剂及仪器...............................................11D.2从转基因生物制备表达产物方法.....................................................12D.3工程菌的构建及培养方法...........................................................14参考文献.............................................................................16I免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007前言DB440300/T32《农业转基因生物食用安全性检验》分成五个部分：——第1部分：样品制备；——第2部分：毒性检验；——第3部分：致敏性检验；——第4部分：抗营养作用检验；——第5部分：非期望效应检验。本部分为DB440300/T32的第1部分。附录A、B、C、D为规范性附录。本部分由深圳市农林渔业局和深圳市卫生局提出。本部分由深圳市农林渔业局和深圳市卫生局负责解释。本部分主要起草单位：深圳市农作物良种引进中心、深圳市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：周向阳邓平建侯红利杨冬燕刘晋杨永存王学林杨小柯李永红吴水清周鹏杜忠II免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007农业转基因生物食用安全性检验第1部分：样品制备1范围本部分规定了农业转基因生物食用安全性检验样品的制备方法。本部分适用于农业转基因生物非期望效应检验的DNA和RNA样品，以及毒性、致敏性、抗营养作用、非期望效应检验的蛋白质样品和外源基因表达产物的制备。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SZJG23农业转基因生物食用安全性要求和评价3术语和定义SZJG23确立的术语和定义适用于本部分。4DNA样品制备4.1材料转基因生物样品、受体生物样品、1.5mL～5mL离心管、滤芯吸头（10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）。4.2常用试剂与仪器常用试剂与仪器见附录A.1。4.3样品前处理4.3.1植物样品称取约50g植物样品，置于经消毒灭菌处理的研钵或合适的粉碎装置中，将样品粉碎至约0.5mm左右。4.3.2动物样品动物组织样品：将新鲜的或–70℃保存的动物组织1g～3g，置于经消毒灭菌处理的研钵中液氮碾成粉末状，然后，加入10mLDNA提取液于50mL的离心管中，混匀，37℃保温1h。细胞培养样品：悬浮培养的细胞可以直接经低温4℃，1500r/min离心10min，收集细胞。对于贴7壁培养细胞，用胰酶消化后再离心收集，细胞数应在5×10左右；将细胞重新悬浮在冰预冷的PBS液或生理盐水中，漂洗1次，再离心，弃上清收集细胞；重复漂洗步骤1次；用10mLDNA提取液将细胞沉淀悬浮，移入50mL离心管中，37℃保温1h。血液样品：将20mL新鲜血液与3.5mLACD抗凝液混匀，0℃下可保存数天或–70℃下长期冻贮，备用。用10mLDNA提取缓冲液将细胞沉淀悬浮，移入50mL离心管中，37℃保温1h。4.3.3微生物样品1免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007细菌：培养5mL的细菌培养物至饱和状态，取1.5mL培养物于2.0mL离心管中，1200r/min离心5min，收集沉淀。酵母：挑选酵母菌单菌落在YEPD完全培养基中30℃培养过夜，取1.5mL培养物于2.0mL离心管中，1200r/min离心5min，收集沉淀。4.4DNA样品提取DNA样品提取方法见附录A.2。商品化试剂盒法：使用时按照相应的操作说明书进行操作。4.5DNA提取质量的评估4.5.1凝胶电泳法4.5.1.1操作方法将DNA样品点样于2%的琼脂糖凝胶上，采用1×TAE（或0.5×TAE）电泳缓冲液，在3V/cm～5V/cm条件下，电泳20min～40min，最后用溴化乙锭溶液染色观察结果。4.5.1.2结果判定凝胶上呈现清晰的DNA条带，可判定DNA的提取符合要求。凝胶上不出现DNA条带，或者凝胶上的条带不清晰，可判定DNA的提取不符合要求，必须重新提取样品DNA。4.5.2吸光度测定法4.5.2.1操作方法用核酸蛋白分析仪分别测定样品DNA提取液的A260nm、A280nm。4.5.2.2结果判定A260nm/A280nm在1.7～2.0之间时，可判定DNA的纯度符合后续检测的要求。A260nm/A280nm小于1.7，或者大于2.0时，可判定DNA的纯度不符合后续检测的要求。必须对样品DNA作进一步的纯化，或者重新提取DNA，防止检测出现假阴性结果。5RNA样品制备5.1材料转基因生物新鲜组织或细胞、受体生物新鲜组织或细胞、DNA分子量标记物、0.5mL～5mL离心管、滤芯吸头（10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）及寡聚(dT)—纤维素。5.2常用试剂与仪器常用试剂与仪器见附录B.1。5.3RNA样品制备5.3.1总RNA制备5.3.1.1准备工作用0.05%DEPC室温预处理50mL离心管1h，然后高压灭菌30min，去除残留的DEPC；从试剂盒中取出水饱和酚在室温下放置15min，让各相分离。5.3.1.2样品制备8悬浮培养细胞：取悬浮培养细胞300g，4℃离心收集1×10个细胞，用25mL预冷的1×PBS漂洗细胞，离心收集，去上清，加15mL预冷的变性液，高速匀浆15s～30s。8贴壁培养细胞：计算好1×10个细胞所需培养瓶数后，用胰酶消化，离心收集细胞，细胞裂解方法同上。植物组织或动物组织：将1g新鲜或液氮冻冰组织置于陶瓷研钵中，加入液氮研磨成细粉末，转移至含有12mL变性液的容器中匀浆。5.3.2RNA提取RNA提取方法见附录B.2。2免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20075.3.3mRNA分离与纯化寡聚(dT)—纤维素层析柱的制备及mRNA分离纯化试验方法见附录B的表B.2。5.4RNA提取质量的评估5.4.1蛋白质或酚污染的检测分别在230nm、260nm、280nm处测定提取物溶液的吸光值，计算A260nm/A280nm及A260nm/A230nm的比值；纯净的RNA样品A260nm/A280nm的比值应在1.7～2.0之间。若小于1.7，则表明有蛋白质或酚试剂污染；应用等体积的酚/氯仿重新抽提去除蛋白质。5.4.2异硫氰酸胍污染的检测A260nm/A230nm的比值应大于2.0。如小于2.0，则表明RNA被异硫氰酸胍污染。应通过乙醇或异丙醇重新沉淀（可反复多次），去除异硫氰酸胍。5.4.3RNA含量的检测纯净的RNA样品（无DNA及核苷酸杂质）260nm的吸光度等于1.0时，RNA的含量为37μg/mL。RNA含量（μg/mL）=A260nm×稀释倍数×37μg/mL6蛋白质样品制备6.1材料转基因生物样品、受体生物样品、1.5mL～5mL离心管、滤芯吸头（10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）。6.2常用试剂与仪器常用试剂与仪器见附录C.1。6.3蛋白质提取蛋白质提取见附录C.2。6.4蛋白质提取质量评估6.4.1操作方法用核酸蛋白分析仪分别测定样品蛋白质提取液的A280nm和A260nm。6.4.2结果判定1.5A280nm/0.75A260nm大于5时，蛋白质的纯度符合要求。1.5A280nm/0.75A260nm小于5时，蛋白质的纯度不符合要求。必须对样品重新提取蛋白质。7外源基因表达产物制备7.1常用试剂与仪器常用试剂与仪器见附录D.1。7.2材料转基因生物样品、受体生物样品、含所需质粒载体的大肠杆菌、商品化的质粒载体、含外源结构基因的工程菌样品、受体菌样品、外源基因表达产物标准品、透析袋、色谱柱（离子交换色谱柱、凝胶过滤色谱柱、反相层析色谱柱、疏水层析色谱柱、亲和层析色谱柱）。7.3从转基因生物制备表达产物7.3.1蛋白质提取按本部分6.3执行。7.3.2蛋白质提取质量评估按本部分6.4执行。7.3.3表达产物的分离、复性、复性率检测、纯化及蛋白脱盐按附录D.2进行实验。7.3.4表达产物的测定3免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20077.3.4.1表达产物等同性的鉴定采用生物活性、分子量和氨基酸序列测定方法，鉴定上述蛋白纯品与外源基因表达产物标准品的等同性。7.3.4.2表达产物浓度的测定测定方法：取适量蛋白溶液，置于比色杯中，用溶解蛋白的缓冲液为对照，在280nm和260nm处测量吸光度。计算方法：蛋白质溶液的浓度按下式计算：蛋白质浓度（mg/mL）=1.5A280nm－0.75A260nm7.4从构建工程菌制备外源基因表达产物7.4.1工程菌的构建及培养按附录D.3的方法进行试验。7.4.2工程菌鉴定7.4.2.1制备含相应抗生素（此抗生素为所用质粒载体的选择标记，抗生素浓度一般为50mg/L）的固体平板。7.4.2.2取200μL菌液与4μLIPTG及40μLX-gal（200mg/mL）混匀。7.4.2.3用无菌吸头将混合液移至LB平板上，再用无菌三角头玻璃棒将菌液均匀涂满整个平板表面。7.4.2.4平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿，于37℃培养12h～16h，挑选白色菌落用于工程菌的鉴定。鉴定可采用质粒DNA分子大小、质粒DNA限制性酶切和外源基因片段扩增等方法。7.4.3菌种保存7.4.3.1固体LB培养基高温灭菌后冷却至50℃左右，加入适量对应的抗生素，轻摇使混匀。7.4.3.25mL/支分装至30mL试管中，塞上试管塞。7.4.3.3立即将试管倾斜放置在一支持物上，使培养基的前沿位于试管长度的1/2处，静置使培养基凝固。7.4.3.4用火焰灭菌的接种环取菌种在抗性LB平皿上划线分离单菌落。7.4.3.5平皿倒置于30℃或37℃（带温敏启动子的菌种应在30℃培养，其他菌种可用37℃培养）恒温培养箱中培养24h～28h，至单菌落大小为3mm左右。7.4.3.6用火焰灭菌的接种环挑选单一菌落，在固体LB斜面上划线接种。7.4.3.730℃（或37℃）培养箱培养24h～48h。7.4.3.8用无菌橡皮塞代替试管塞，4℃冰箱保存。7.4.4发酵培养7.4.4.1根据工程菌生长和产物合成的需要，选择和配制相应的培养基。7.4.4.2在合适的培养条件下，对工程菌进行发酵培养，并诱导其中的外源基因进行表达。7.4.5蛋白质提取按本部分6.3执行。7.4.6蛋白质提取质量评估按本部分6.4执行。7.4.7表达产物的分离、复性、复性率的检测、纯化及蛋白脱盐按本部分7.3.3执行。7.4.8表达产物的测定按本部分7.3.4执行。4免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007附录A（规范性附录）DNA样品制备A.1DNA样品制备常用试剂及仪器类型样品制备及DNA提取试剂仪器①1.5×CTAB提取液［1.5%（w/v）CTAB，75mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LNaCl，15mmol/LEDTA］；②10%CTAB溶液［10%CTAB，可以加入0.7mol/LNaCl］；植物③沉淀液［1%CTAB，50mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA］；a)电子天平（感量④高盐TE［1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA］；为0.001g）；⑤TE溶液［0.01mol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA］；b)恒温孵育装置；⑥RNaseA溶液［10mg/mL］。c)普通离心机；①磷酸盐缓冲液（PBS）；d)低温冷冻高速离②DNA提取缓冲液［0.01mol/LTris-HCl(pH8.0），0.1mmol/LEDTA（pH8.0），心机；20μg/mL胰RNA酶，0.5%SDS］；e)微型离心机；③蛋白酶K；动物f)研钵及粉碎装④酚［用0.5mol/LTris-HCl（pH8.0）饱和］；置；⑤TE溶液［0.01mol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA］；g)低温冰箱；⑥无水乙醇；h)普通冰箱；⑦ACD抗凝液［柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，右旋葡萄糖1.47g，加水至100mL］。i)旋涡震荡器；①TE溶液［0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）,1mmol/LEDTA］；j)高压灭菌器；②CTAB提取液［2%（w/v）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.0），1.4mol/LNaCl，k)高温干燥箱；20mmol/LEDTA］；l)核酸蛋白分析③20mg/mL蛋白酶K；仪；④5mol/LNaCl；m)微量移液器；微生物⑤氯仿/异戊醇（24:1）；n)超净工作台；⑥酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）；o)电泳仪；⑦4mol/L乙酸铵；p)凝胶成像系统；⑧90%乙醇；q)酸度计；⑨10%（w/v）SDS；r)实验用水制备装⑩YEPD完全培养基。置。①溴化乙锭（EB）（10mg/mL）或其他的染色剂；②琼脂糖：电泳纯；凝胶③50×TAE缓冲液［242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）电泳加水至1000mL］；④上样缓冲液。注1：除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。注2：实验用水按GB/T6682的规定执行。5免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007A.2DNA提取方法A.2.1植物（CTAB法）1）液氮研磨至粉末状，每份称取约100mg样品，加入1.5mL或2.0mL离心管。2）加入400μLCTAB提取液（预热至80℃），摇匀，56℃水浴保温15min～20min或更久（常摇）。3）加入300μL氯仿/异戊醇（24:1），将离心管上下翻转，充分混匀约5min，12000r/min离心5min～6min。4）取上清，加1/10体积的10%CTAB液，摇匀。5）加入300μL氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀约5min，12000r/min离心5min。6）取上清，加等量CTAB沉淀液，轻轻摇匀，室温放置至少10min～15min，12000r/min,离心10min。7）弃尽上清，加100μL高盐TE和5μL10mg/mLRNase，55℃轻摇至完全溶解（约10min）。8）加入2倍体积冷无水乙醇，摇匀，12000r/min离心10min。9）加入至少200μL的70%乙醇洗涤1～2次，12000r/min离心沉淀。10）弃乙醇，风干，30μL～50μLTE溶解。A.2.2动物（酚提取法）1）上述样品加入20mg/mL的蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，边加边用玻棒轻轻搅拌，使溶液至粘稠状。2）50℃保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时轻轻摇匀反应液。3）将反应液冷却至室温，加入等体积已饱和的酚溶液，温和地上下转动离心管混匀两相，反复该动作10min，直至水相与酚相混匀成乳状液，若没有达到这种效果，可用多角度摇荡混匀器温和地混匀1h。4）室温5000r/min离心15min，使用大口径（0.3cm）吸管小心吸出上层粘稠水相，移至另一离心管中，重复③、④，用酚抽提2次。5）在第三次酚抽提后，将上层水相移入新离心管中，加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积95%乙醇，室温下轻慢摇动混匀，当即可见到乳白色丝状DNA沉淀出现，用自制前端为钩状的玻璃棒捞出DNA纤维，立即放入70%乙醇中漂洗2次，室温5000r/min离心5min，弃上清，室温挥发迹量乙醇，不6要使DNA沉淀完全干燥，按每5×10个细胞DNA提取物加入1mLTE溶解DNA，一般需要12h～24h。A.2.3微生物A.2.3.1细菌样品的CTAB法1）在含有沉淀物的离心管中加入567μLTE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μL10%SDS和3μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。2）加入100μL5mol/LNaCl，充分混匀，再加入80μLCTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。3）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，高速离心5min，将上清液移入另一离心管中，如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质。4）加入等体积酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀，高速离心5min，将上清液移入另一离心管中。5）加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来。6）高速离心5min，弃上清，用1mL70%乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于100μLTE缓冲液。A.2.3.2酵母样品的CTAB法1）在含有沉淀物的离心管中加入200μL酚/氯仿/异戊醇溶液重悬。2）加0.3g玻璃珠及200μL酚/氯仿/异戊醇溶液，在旋涡混合器上高速振荡3min。6免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20073）加入200μLTE缓冲液，快速振荡，高速离心5min，室温下将水相转移至一个干净的离心管中，加1mL无水乙醇，颠倒混匀。4）室温下高速离心3min，去上清，沉淀用400μLTE缓冲液重悬。5）加30μLRNaseA酶溶液，混合，37℃温育5min。6）加10μL4mol/L乙酸铵和1mL无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清，干燥沉淀，DNA用100μLTE缓冲液重悬。7免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007附录B（规范性附录）RNA样品制备B.1RNA样品制备常用试剂及仪器类型样品制备及RNA提取试剂仪器①RNA提取试剂盒［50g异硫氰酸胍（2×25g）、75mLCBS（柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/β-巯基乙醇）缓冲液、10mL2mol/LNaAc（pH4.0）、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、100mL异丙醇、25mL无RNase水］；②75%冰冷乙醇；总RNA提③10×PBS溶液［11.5gNaHPO4，2gKH2PO4，80gNaCl，2gKCl溶于1L灭菌去离子取试剂水中。1×PBS溶液的pH为7.4］；④变性液［加33mLCSB缓冲液于25g异硫氰酸胍中，充分混匀直至所有成分完全溶同附录A.1仪器解，65℃加热有助于溶解，配好后可贮存于4℃］。的规定⑤0.05%DEPC(二乙基焦碳酸盐)。①0.1mol/LNaOH；mRNA分②1×上样缓冲液［20mmol/LTris-HCl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA离与纯化（pH8.0），0.1%十二烷基肌氨酸钠（SLS）］；试剂③洗脱缓冲液［10mmol/LTris-HCl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS］；④3mol/LNaAc（pH5.2）；⑤无水乙醇。注1：除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。注2：实验用水按GB/T6682的规定执行。B.2RNA提取方法B.2.1RNA提取1）匀浆后的组织细胞移至50mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL2mol/LNaAc（pH4.0），加盖并反复颠倒离心管。2）加入12mL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，混匀，强力振荡10s，冰浴15min。3）4℃，12000r/min离心20min沉淀RNA。4）小心吸取上层水相（含RNA）至一个新的50mL离心管（经DEPC处理）中，注意不要吸出中间层，该层富含蛋白质和DNA。5）加等体积异丙醇与样品混匀置–20℃沉淀RNA30min。对于RNA含量极少的样品可沉淀过夜提高回收率。6）4℃，12000r/min离心15min沉淀RNA。7）弃上清，将RNA沉淀重新悬浮于5mL变性溶液中，置旋转摇床上多角度摇晃直至RNA溶解，也可加热至65℃促进溶解（时间尽可能短）。8）加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)重新抽提1次，即重复2）～4）步骤。9）重复5）、6）步骤。10）离心后，弃上清，加75%预冷乙醇10mL，漂洗沉淀，离心，弃上清。11）真空干燥去除样品中的乙醇，不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解。12）将RNA溶于1mL～3mL无RNase的去离子双蒸水中，–20℃保存备用。B.2.2mRNA分离与纯化B.2.2.1寡聚(dT)—纤维素层析柱的制备1）将0.5g～1.0g寡聚(dT)—纤维素悬浮于0.1mol/LNaOH溶液中。8免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20072）用DEPC处理的1mL注射器或适当的吸管，再高压消毒，将寡聚(dT)—纤维素装柱0.5mL～1mL，用3倍柱床容积的消毒水洗柱。3）用1×上样缓冲液洗柱，直到洗出液pH值小于8.0。B.2.2.2分离与纯化1）将总RNA溶于消毒水中，65℃加热5min，用水将其冷却至室温，加入等体积2×上样缓冲液，混匀后直接上柱，马上收集流出液，当总RNA上样液全部进入柱床后，再用1柱床容积的1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。2）所有液体流出后，将收集液65℃加热5min，冷至室温后重新上柱，再收集流出液。3）用5～10倍柱床容积的1×上样缓冲液洗柱，除去rRNA和tRNA，每管1mL分部收集，A260测定RNA含量。前部分收集管的A260较高，其内容物为poly(A)尾的RNA，后部分收集管中洗脱液的A260较低或无吸收。+4）用2～3柱床容积的洗脱缓冲液洗脱poly(A)RNA，分部收集，每部分为1/3～1/2柱容积。++5）用A260测定poly(A)RNA的分布，合并含poly(A)RNA的收集管，加入1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2）混匀后，加2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，–20℃沉淀RNA30min。+6）4℃，10000r/min离心15min，小心吸弃上清，poly(A)RNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，室温，10000r/min离心5min，弃上清，室温蒸发乙醇。7）用适量无RNase的去离子双蒸水溶解RNA，加入3倍体积的乙醇混匀后，–70℃长期保存。使+用前，加入0.1倍体积的3mol/LNaAc（pH5.2）混匀，4℃，12000r/min离心5min，收集poly(A)RNA。9免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007附录C（规范性附录）蛋白质样品制备C.1蛋白质样品制备常用试剂及仪器类型样品制备及DNA提取试剂仪器植物细胞裂解60mmol/LTris-HCl（pH6.8），2%SDS，1.44mmol/Lβ-巯基乙醇，25%甘油，0.1%溴缓冲液酚蓝，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中，4℃保存。50mmol/LTris-HCl（pH8.0），150mmol/LNaCl，0.1%SDS，1μg/mL抑蛋白酶肽动物细胞裂解（Aprotinin），1%非离子去污剂（NonidetP-40，NP-40）或1%TritonX-100，1%去氧缓冲液胆酸钠，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中，4℃保存。同附录A.150mmol/LTris-HCl（pH7.5），150mmol/LNaCl，1%非离子去污剂（NonidetP-40，NP-40）仪器的规定酵母细胞裂解或1%TritonX-100，0.5%去氧胆酸钠，0.1%SDS，用去离子水配制，避光贮存于棕色缓冲液瓶中，4℃保存。细菌裂解100mmol/LTris-HCl（pH6.8），200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）（用前现加），4%SDS，缓冲液0.2%溴酚蓝，20%甘油，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中，4℃保存。注1：除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。注2：实验用水按GB/T6682的规定执行。C.2蛋白质提取制备方法C.2.1植物细胞取约1g的新鲜样品，液氮研磨，移至15mL离心管中，在冰浴条件下加入1mL植物细胞裂解缓冲液（预冷至0℃），充分混匀。冰浴20min。4℃，12000r/min离心10min。收集上清液，冷冻干燥或4℃保存。C.2.2动物细胞悬浮培养的细胞可以直接经低温4℃，1500r/min离心10min，收集细胞。对于贴壁培养细胞，用7胰酶消化后再离心收集，细胞数应在5×10左右。在冰浴条件下加入1mL动物细胞裂解缓冲液（预冷至0℃），充分混匀。冰浴20min；4℃，12000r/min离心10min。收集上清液，冷冻干燥或4℃保存。C.2.3酵母挑选酵母菌落在YEPD完全培养基中30℃培养至A600达5～10，1.5mL的培养物，在2.0mL离心管中1500r/min离心2min，去除上清。在冰浴条件下加入1mL酵母细胞裂解缓冲液（预冷至0℃），充分混匀。冰浴20min。4℃，12000r/min离心10min。收集上清液，冷冻干燥或4℃保存。C.2.4细菌培养5mL的细菌培养物至饱和状态，取1.5mL的培养物，在2.0mL离心管中15000r/min离心2min，去除上清。在冰浴条件下加入1mL细菌裂解缓冲液（预冷至0℃），充分混匀。冰浴20min。4℃，12000r/min离心10min。收集上清液，冷冻干燥或4℃保存。10免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007附录D（规范性附录）外源基因表达产物制备D.1外源基因表达产物制备常用试剂及仪器试剂名称组分仪器植物细胞裂解同附录C表C.1相应规定。缓冲液动物细胞裂解同附录C表C.1相应规定。缓冲液酵母细胞裂解同附录C表C.1相应规定。缓冲液细菌裂解同附录C表C.1相应规定。缓冲液①STE［STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0），高压蒸汽灭菌后于4℃贮存］；②溶液Ⅰ［50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），高压蒸汽灭菌，于4℃贮存］；大肠杆菌质粒③溶液Ⅱ［0.2mol/LNaOH，1%SDS（新鲜配制）］；载体DNA提取a)中压液相色谱仪；④溶液Ⅲ［5mol/LKAc60mL，冰乙酸11.5mL，dH2O28.5mL（pH和纯化b)自动部分收集器；4.8）。也可以按KAc29.4g，冰乙酸11.5mL，加蒸馏水至100mL配c)中压液相色谱系统；制］；d)抽滤装置：配0.45μm滤膜，⑤RNaseA溶液(10mg/mL)；抽滤瓶体积为5L；⑥Tris平衡酚，酚/氯仿溶液。e)其他仪器同附录A表A.1仪①限制酶及相应的缓冲液；器的规定。②T4DNA连接酶及缓冲液；③碱性磷酸酶（CIP）及缓冲液；④DNA聚合酶Ⅰ大片段及缓冲液；外源基因与载⑤T4DNA聚合酶及缓冲液；体限制酶酶切⑥1mol/LTris-HCl（pH7.6），100mmol/LTris-HCl（pH8.3）；与连接反应⑦100mmol/LMgCl2；⑧200mmol/LDTT；⑨10mmol/LATP；⑩10mmol/LZnCl2。①0.1mol/LCaCl2溶液；重组质粒转化②20mg/mLX-gal：溶于二甲基甲酰胺，分装，避光保存；大肠杆菌③200mg/mLIPTG：溶于水，0.22μm滤膜过滤，分装，–20℃贮存。11免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007（续表D.1）①流动相［8mol/L尿素，1mmol/LDTT，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）］；外源基因表达②稀释用变性液［0.6mol/L盐酸胍，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，产物分离0.9mmol/L还原型谷胱甘肽，20mmol/LTris-HCl（pH8.0）］；③TE缓冲液［20mmol/LTris-HCl（pH7.0），使用前抽滤脱气］。①流动相A［0.1%TFA+超纯水］；外源基因表达②流动相B［0.1%TFA+乙腈］；产物复性检测③流动相C［20mmol/LBP，pH7.0，0.6mol/L盐酸胍］。①TE缓冲液［20mmol/LTris-HCl（pH7.0），使用前抽滤脱气］；②B溶液［NaCl，20mmol/LTris-HCl（pH7.0），使用前抽滤脱气］；外源基因表达③C溶液［1mol/LNa2SO4，20mmol/LTris-HCl（pH7.0），使用前产物纯化抽滤脱气］；④1mol/LHCl。注1：除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。注2：实验用水按GB/T6682的规定执行。D.2从转基因生物制备表达产物方法D.2.1表达产物的分离1）根据需要制备的表达产物的数量，收集蛋白质提取物，用流动相配制含蛋白(5～10)mg/mL的样品溶液。2）根据待分离表达产物的性质，选用适当的离子交换色谱柱。3）液相色谱仪装上交换柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器，平衡色谱柱。4）用注射器将25mL样品溶液注入进样环。5）用流动相以流速9mL/min洗脱。6）进样后1.5h开始，用分步收集仪，20μL/管收集洗脱液。7）取各洗脱峰对应的收集管样品20μL/管，作SDS-PAGE分析。8）将含表达产物的收集管的收集液合并，用作蛋白复性的样品。D.2.2表达产物的复性1）将5mL蛋白复性样品溶液加入到245mL稀释用变性液中，搅拌均匀。2）稀释后的蛋白复性样品溶液装入预先处理过的3只透析袋中两端用透析袋夹夹紧。3）将透析袋放入一只装有5L复性液的烧杯中，4℃，搅拌透析5h。4）将透析袋取出，放入另一装有5L复性液的烧杯中，4℃，搅拌透析10h～15h。5）将透析袋取出，放入另一装有5LTE缓冲液的烧杯中，4℃，搅拌透析10h～15h。6）将透析袋溶液合并。用低温高速离心机，4℃，15000r/min离心30min。7）上清用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液即可用于蛋白复性的检测。D.2.3蛋白复性率的检测D.2.3.1反相高压液相色谱法1）液相色谱仪装上反相色谱柱或者C18柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器。在色谱仪的A、B通道，分别放流动相A和流动相B，冲洗A、B通道。2）开紫外检测器，设定检测波长为280nm。3）以100%A，0.5mL/min的流速平衡柱，至基线平稳。4）设定洗脱程序：0min，100%A，0%B；5min，100%A，0%B；65min，10%A，90%B。12免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20075）分别进20μL0.1mg/mL、0.06mg/mL、0.03mg/mL、0.01mg/mL目标蛋白标准溶液，启动洗脱程序，测定目标蛋白标准样品的峰面积。以目标蛋白浓度对峰面积作标准曲线。6）取蛋白复性检测样品20μL进样，启动洗脱程序。测定与目标蛋白标准同一保留时间的峰面积，代入标准曲线计算复性蛋白含量。并根据蛋白复性样品中目标蛋白的含量，计算目标蛋白的复性率。需要时，对样品作进一步复性处理，或者改用其他方法对样品作复性处理。D.2.3.2凝胶高压液相色谱法1）液相色谱仪装上凝胶层析柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器。在色谱仪的A通道，放流动相C，冲洗A通道。2）开紫外检测器，设定检测波长为280nm。3）以100%C，0.5mL/min的流速平衡柱，至基线平稳。4）设定洗脱程序：100%A，45min。5）分别进20μL0.1mg/mL、0.06mg/mL、0.03mg/mL、0.01mg/mL目标蛋白标准溶液，启动洗脱程序，测定目标蛋白标准样品的峰面积。以目标蛋白浓度对峰面积作标准曲线。6）取蛋白复性检测样品20μL进样，启动洗脱程序。测定与目标蛋白标准同一保留时间的峰面积，代入标准曲线计算复性蛋白含量。并根据蛋白复性样品中目标蛋白的含量，计算目标蛋白的复性率。需要时，对样品作进一步复性处理，或者改用其他方法对样品作复性处理。D.2.3.3表达产物的初步纯化1）以上述经复性的表达产物溶液为样品，可根据需要制备的表达产物的数量，将同一样品多个复性表达产物溶液合并为一个样品。2）1.5L蛋白提取物中边搅拌边滴加1mol/LHCl，并用酸度计测定溶液的pH值，至pH7.0，继续搅拌30min。3）蛋白提取溶液用0.45μm滤膜的抽滤装置抽滤。4）液相色谱仪装上阴离子交换柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器，平衡色谱柱。5）以流速6mL/min上样。上样后将通道进液口溶液换回TE缓冲液，流速2mL/min冲洗30min。6）梯度洗脱，流速2mL/min，4mL/管收集洗脱液。7）每个收集管取20μL样品，作SDS-PAGE分析。将含有表达产物，且纯度较高的收集管溶液合并，用于进一步纯化。D.2.4表达产物的进一步纯化1）样品准备：上一步蛋白样品中加入硫酸钠至浓度为1mol/L。2）溶液用0.45μm滤膜的抽滤装置抽滤。3）液相色谱仪装上疏水层析柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器，平衡色谱柱。4）用注射器将样品溶液注入进样环。5）流速4mL/min冲洗柱30min。6）梯度洗脱，流速4mL/min，4mL/管收集洗脱液。7）每个收集管取20μL样品，作SDS-PAGE分析。将含有目标蛋白，且纯度≥95%样品收集管溶液合并。D.2.5蛋白脱盐1）液相色谱仪装上凝胶层析柱，按液相色谱仪操作说明开启仪器，平衡色谱柱。2）以流速15mL/min上样。上样后将通道进液口溶液换回B溶液，流速15mL/min洗脱。3）收集第一峰即为蛋白纯品。注：反相高压液相色谱法和凝胶高压液相色谱法常用于目标蛋白复性过程中复性速度和复性终点的检测。反相高压液相色谱法利用不同构型蛋白的疏水性不同，在反相色谱柱上会有不同的保留时间，从而分析蛋白不同复性状态的含量；凝胶高压液相色谱法利用不同构型蛋白的水化半径不同，在凝胶色谱柱上会有不同的保留时间，从而分析蛋白不同复性状态的含量。根据目标蛋白的性质，可选择下述反相高压液相色谱法或凝胶高压13免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007液相色谱法检测目标蛋白的复性率。D.3工程菌的构建及培养方法D.3.1外源基因DNA片断的制备1）方法一：采用PCR扩增方法，从转基因生物细胞的DNA提取物中扩增所需的外源基因DNA片段，经凝胶电泳分离后，回收外源基因DNA片段。2）方法二：采用PCR扩增方法，从含有所需外源基因的质粒中扩增所需的外源基因DNA片段，经凝胶电泳分离后，回收外源基因DNA片段。3）方法三：根据所需的外源基因的核酸序列，合成相应的DNA片段。D.3.2质粒载体DNA的制备1）从LB平板上挑选含所需质粒的大肠杆菌单菌落，接种于5mL附加相应抗生素的LB液体培养基中，37℃条件下250r/min振荡培养过夜（至对数生长后期）。2）取1.2mL～1.5mL菌液移至1.5mL无菌Eppendorf管中，12000r/min离心30s，弃上清。3）加入1mLSTE溶液，涡旋振荡重悬菌体，12000r/min离心30s，弃上清，用无菌吸水纸条吸去管壁上的液滴。4）重复3）操作1次。5）向离心管内加入100μL冰冷的溶液Ⅰ，涡旋振荡悬浮菌体。6）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，迅速盖严离心管盖，快速颠倒（千万不要振荡）离心管5次，室温放置5min。7）向离心管内加入150μL溶液Ⅲ，颠倒离心管10次，冰浴5min～10min，12000r/min离心10min。8）将上清液转入1.5mL无菌Eppendorf管中，加入1/10体积RNaseA溶液，37℃保温1h至过夜。9）分别用1倍体积的Tris平衡酚、酚/氯仿、氯仿各抽提1次，每次抽提后均于12000r/min离心5min，仔细吸取上层水相。10）将氯仿抽提后的上层水相转入无菌Eppendorf管中，加入1倍体积的水饱和乙醚，颠倒混匀，12000r/min离心5min，取下层水相，转入无菌Eppendorf管中，打开离心管盖，68℃水浴5min，以除去残留的乙醚。11）冷至室温，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min（或加入2/3体积异丙醇，混匀，立即离心）。12）4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用无菌吸水纸条吸去管壁上的液滴。13）用500μL70%乙醇洗沉淀1～3次，空气中干燥。14）加入适量（10μL～20μL）TE溶解质粒DNA。15）按本标准7.4的DNA提取质量评估方法，检测提取DNA的纯度和含量。D.3.3外源基因与载体的限制酶酶切及连接D.3.3.1不对称相容末端的酶切及连接1）在A、B两个Eppendorf管中分别加入以下试剂：A管：ddH2O11μL、10×buffer2μL、外源基因片段（1μg/μL）5μL、限制酶Ⅰ1μL、限制酶Ⅱ1μL；B管：ddH2O15μL、10×buffer2μL、载体DNA（1μg/μL）1μL、限制酶Ⅰ1μL、限制酶Ⅱ1μL。2）各管分别混匀，瞬时离心。3）37℃保温3h。4）65℃保温10min，灭活限制酶。5）加入适量的加样缓冲液，混匀，离心5s，分别上样于已制备好的1%琼脂糖凝胶两个样品槽中，同时于最外侧的样品槽中加入1μg分子质量标准DNA样品。6）3V/cm电泳1h～2h。7）回收：按DNA回收试剂盒说明进行。14免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—20078）在1.5mLEppendorf管中加入以下试剂：ddH2O12μL、酶切后回收的外源基因片段（0.1μg/μL）4μL、酶切后回收的载体DNA（0.1μg/μL）1μL、10×连接酶缓冲液2μL、T4DNA连接酶（1U/μL）1μL。9）混匀，瞬时离心。10）14℃连接4h～16h。11）检测连接产物或直接用于转化。D.3.3.2对称性粘性相容末端及平末端的酶切及连接1）限制酶切：外源基因片段和载体DNA的酶切操作步骤与本附录D.3.3.1相同。2）对质粒载体酶切产物进行脱磷酸处理：A.于Eppendorf管中分别加入以下试剂：质粒载体酶切产物20μL、ddH2O24μL、10×buffer5μL、CIP1μL。B.混匀，于37℃保温30min。C.用1倍体积的酚/氯仿抽提2～3次。D.上清液中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc（pH7.0），2倍体积的冷无水乙醇，–20℃放置1h，12000r/min离心10min，回收沉淀。E.将沉淀溶于适量TE缓冲液，测定浓度，分装，贮于-20℃，供连接用。3）在1.5mLEppendorf管中依次加入以下试剂：ddH2O14μL、酶切后回收的外源基因片段（0.15μg/μL）2μL、酶切后回收并经脱磷酸处理的载体DNA（0.1μg/μL）1μL、10×连接酶缓冲液2μL、T4DNA连接酶（1U/μL）1μL。4）混匀，14℃连接4h至过夜。5）检测连接产物或直接用于转化。D.3.3.3不相容粘性末端的酶切及连接1）限制酶切：外源基因片段和载体DNA的酶切操作步骤与本部分D.3.3.1相同，但酶切样品需加大。′2）5突出平端补平：A.于Eppendorf管中分别加入以下试剂：DNA酶切片段（0.1μg/μL～0.2μg/μL）20μL、10×buffer3μL、10mmol/LDTT3μL、dNTP（各0.5mmol/L）3μL、DNA聚合酶Ⅰ大片段1μL。B.37℃保温15min。C.70℃保温10min。D.酚/氯仿抽提，乙醇沉淀离心，沉淀吹干，溶于TE供连接用。′3）3突出平端删除：A.于Eppendorf管中分别加入以下试剂：DNA酶切片段（0.1μg/μL～0.2μg/μL）20μL、10×buffer3μL、10mmol/LDTT3μL、dNTP（各0.5mmol/L）3μL、T4DNA聚合酶1μL。B.37℃保温15min。C.70℃保温10min。D.酚/氯仿抽提，乙醇沉淀离心，沉淀吹干，溶于TE供连接用。′′4）连接：经5突出平端补平或3突出平端删除修饰的外源基因片段和载体DNA的连接操作步骤与本附录D.3.3.2相同。D.3.4连接产物导入大肠杆菌细胞1）将单菌落接入5mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日按1%（v/v）转入新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至A600为0.3。2）将50mL～100mL的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，4℃下500r/min离心10min，去上清液。3）离心管中各加入10mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬菌体，冰浴30min。4）4℃，3500r/min离心10min。5）去上清液，将菌体悬于2mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，即为感受态细胞。6）于4℃冰箱保存，1周内使用。也可加入300μL无菌甘油或7%DMSO，混匀，分装于无菌Eppendorf管中，用液氮速冻后置-70℃保存。使用时取出置冰中融化。7）用无菌吸头取100μL感受态细胞置于1.5mL预冷的Eppendorf管中，加入10ng～1000ng连接产物DNA，轻轻混匀（用手弹管壁几下），立即置冰上30min。8）将管置42℃恒温水浴中热激90s，立即放回冰上15min。放入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养45min～60min。15免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB440300/T32.1—2007参考文献[1]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术（第二版）.北京：中国协和医科大学出版社，1999，101-126、136-154、372-374、404-429[2]GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法[3][美]F.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等著.颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南，北京：科学出版社，1998，22-24、35-40、120-130、329-394、522-523[4][美]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.金冬燕，黎孟枫等译.分子克隆实验指南（第二版），北京：科学出版社，1999，34-68、822-848、870-877[5]王关林，方宏筠主编.植物基因工程.北京：科学出版社，733-767，16免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载'