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- 2023-01-01 08:30:51 发布
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JSHANXIAGRICUNIV(NaturalScienceEdition)学报(自然科学版)2011,31(2)002774絮凝剂产生菌的筛选鉴定及其在废水处理中的应用罗平,智芳芳,黄锃峰,贺蛟(重庆大学化学化工学院,重庆400044)摘要:从污泥中分离并筛选出一株具有较高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌,命名为Be-3。为了取得絮凝剂的最大活性并使其得到充分利用,对其培养条件进行了单因素优化,考察了微生物絮凝剂产生菌的特征和性质,实验结果-1-1-1表明,该菌产生絮凝剂的最佳培养条件为:碳源10gL乳糖和10gL蔗糖的混合物,氮源05gL尿素、02gL-1酵母膏和05gL-1硝酸钾的混合物,无机盐为2gL-1磷酸二氢钾、5gL-1磷酸氢二钾和01gL-1氯化钠的混合物,培养基初始pH为65,培养温度为30,在摇床转速为120~140rmin-1的培养箱中培养42h时,絮凝活性可达9804%。通过生理生化实验分析,该絮凝剂产生菌为革兰氏阳性菌,主要成分为多糖。用Be-3所产絮凝剂处理不同废水后,废水中的CODcr、NH3-N和浊度的去除率都比较高,说明该絮凝剂在废水处理中具有很好的应用前景。关键词:微生物絮凝剂;优化;絮凝率;污水处理中图分类号:X52文献标识码:A文章编号:16718151(2011)02018805ScreeningandIdentifyingofFlocculentproducingStrainandApplicationforWastewaterTreatmentLUOPing,ZHIFangfang,HUANGZengfeng,HEJiao(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China)Abstract:Thestrainofhighefficiencybioflocculantproductingbacteria,whichwasnamedBe3,wasscreenedfromthesludge,inordertogetthehighestflocculatingactivitiesandmakefulluseoftheflocculent,theircharacteristicsandoptimalculturingconditionwerestudiedinthepaper.Theresultsoftheexperimentshowedthattheoptimalculturing-1-1conditionwasasfollows:thecarbonsourcewasthecompositionof10gLcanesugarand10gLlactose,theni-1-1-1trogensourcewasthecompositionof05gLurea,02gLyeastextractand05gLpotassiumnitrate,theinorganicsaltwasthecompositionof2gL-1potassiumdihydrogenphosphate,5gL-1potassiumphosphatedibasicand01gL-1sodiumchloride.WhentheBe3wasculturedat30withtheinitialpHbeing65andtherota-1tionspeed140rminfor42h,theflocculatingactivitiesachieved9804%,thestrainwasgram-positive,andthemaincomponentsofflocculantswaspolysaccharideinphysiologicalbiochemicaltest.Whenthestrainwasappliedtowastewatertreatment,theremovalrateofCODcr,NH3Nandturbiditywerecomparativelygood.Theresultssuggestedthatthestrainhadgoodapplicationprospectinpractice.Keywords:Microbialflocculent;Optimization;Flocculatingactivity;Wastewatertreatment絮凝沉淀法由于其操作简单、经济,已广泛应且为强烈的致癌原,对人体有害,而无机絮凝剂中[1~3]用于污水处理、食品和发酵工程中。絮凝剂一的铝能引起老年痴呆。所以开发一种安全、高效、[4~5]般可以分为三类:无机絮凝剂、有机高分子絮无二次污染的絮凝剂具有很重要的意义。凝剂、天然高分子絮凝剂。有机高分子絮凝剂因其微生物絮凝剂是一种与微生物有关的絮凝剂,低成本和高效性而被广泛应用,但研究表明人工合是微生物在生长过程中产生的有絮凝活性的代谢成的絮凝剂如聚丙烯酰胺单体具有神经毒害性,并产物,主要有糖蛋白、多糖、纤维素和DNA等,是收稿日期:20110104修回日期:20110221作者简介:罗平(1975),女(汉),重庆人,副教授,博士,主要从事环境科学和水质监测技术方面的研究。基金项目:重庆自然科学基金项目(CSTC,2008BB7180)\n31(2)罗平等:絮凝剂产生菌的筛选鉴定及其在废水处理中的应用189一种无毒无害、安全高效,易降解、无二次污染的高便携式分光光度计,HACH公司;HACH-4560分子絮凝剂,对色度和有害成分具有良好的去除效密闭加热器,HACH公司;XSZ-3G型光学显微果。能够分泌絮凝剂的这种微生物叫做絮凝剂产镜等。生菌,主要包括:细菌、霉菌和放线菌等,广泛分布12试验方法于淤泥和土壤中,所以,微生物絮凝剂的提取比较121菌种的分离与纯化方便。目前,微生物絮凝剂的研究工作已经进入了以112所述的培养基为分离培养基,采用稀[6]能利用较低成本获得高效絮凝率的研究阶段,但释法和划线分离法对菌种进行分离和纯化。只适用于实验室,不能很好地应用于工业生产中。122活性的测定方法-1因此,有必要对絮凝剂的特性及培养条件进行基础于150mL烧杯中加入1gL的高岭土溶性研究,以期提高絮凝剂的产量和稳定性,使其能液100mL,吸取1mL菌体发酵液置于烧杯中,并更好地应用于工业生产。加入1mL1%的CaCl2溶液,在磁力搅拌器上快-1-1搅(120rmin)1min,慢搅(60rmin)31材料与方法min,室温下静置10min后,取液面下2cm处的上11实验材料清液,用722型分光光度计测试光密度值OD550,111土壤来源同时以同等条件下不加发酵液的空白液作为对照。重庆大学民主湖[4]112培养基絮凝率=(A-B)/A100%(1)分离培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(分离细菌),高氏一号培养基(分离放线菌),查氏培养基其中:A空白液的OD550(分离霉菌)。B待测样品的OD550(2)发酵培养基:葡萄糖20g,(NH4)2SO402123培养条件的优化g,尿素05g,KH2PO42g,K2HPO45g,NaCl01改变发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐离子g,酵母膏05g,水1000mL。pH70,1123的种类,以及pH、培养时间、通气量,进行单因素灭菌30min。实验,通过测定絮凝率对培养条件进行优化。培养条件:在50mL三角瓶中装入20mL发124絮凝剂成分定性分析-1酵液,无菌操作下接种,(301)、140rmin显色反应取50mL微生物絮凝剂发酵液,-1恒温摇床培养72h。5000rmin离心25min,取上清液进行Molish[7](3)生化试验培养基:根据文献[7]配制明胶反应,蒽酮反应,seliwanoff反应,双缩脲反应,蛋培养基、淀粉琼脂培养基、蛋白胨水培养基(糖发白黄反应和茚三酮反应。酵,吲哚实验用)、磷酸盐-葡萄糖-蛋白胨水培养絮凝剂稳定性取适量的菌体发酵液置于试管基(甲基红-VP实验用)。中,并于开水浴中分别加热0、5、10、15、20、30、40、(4)实际废水:次甲基蓝模拟废水、腐植酸模拟50min时取出,通过比较絮凝率的变化分析絮凝废水、污泥废水、垃圾渗滤液剂的热稳定性。[7]113实验仪器和试剂125菌体的生理生化实验(1)主要试剂:蒽酮(上海嶅稞实业有限公司,取指数生长期新鲜菌液,按文献[7]方法作革分析纯)、茚三酮(美瑞泰克科技有限公司,分析兰氏染色、糖发酵实验、明胶液化实验、淀粉水解实纯)、-萘酚(重庆品誉化工有限公司,分析纯),甲验、吲哚实验、甲基红实验、V-P实验、触酶实验。基红(中西远大科技有限公司,分析纯),高岭土(重126絮凝剂对不同废水的处理庆展扬化学工业有限公司,分析纯)等。用不同的废水代替高岭土悬浊液,比较处理前[8](2)主要仪器:GB40271-83型煤电手提式压后废水中CODcr、NH3-N和浊度等指标变化。力蒸汽消毒器,贵州省开阳医疗器械厂;JJ-1型2结果与讨论磁力搅拌器,中外合资深圳天南海北有限公司;THZ-C型恒温培养箱,江苏太仓市实验设备厂;21菌体的分离筛选及初步确定722A型分光光度计,四川分析仪器厂;DR-890经多次划线分离从污泥中分离筛选出一株具\n190山西农业大学学报(自然科学版)2011有较高絮凝活性且性能比较稳定的菌株,编号为:活性比较高,主要是由于双糖的混合物更容易被微Be-3。该菌株生长特征为乳白色的不透明小颗生物生长吸收,更能够提供细胞代谢所需的能量,粒,表面凸起,边缘光滑,有粘性,易与培养基分离。提供细胞的碳架。形态及生理特征为:革兰氏阳性菌。222氮源的优化22最佳培养条件的优化以不同物质为氮源时,所培养出的微生物絮凝221碳源的优化剂的活性是不同的,如表1显示,无机氮较有机氮碳源不仅可以提供微生物细胞所必需的碳元更有利于Be-3生长繁殖的吸收,但絮凝活性都[9]素,有些碳源还可以作为微生物生长的能量,如不高,当无机氮和有机氮混合使用时,活性则大大-1-1表1所示,当Be-3以双糖作为碳源时,絮凝活性提高,其中以05gL尿素+05gL硝酸-1-1明显高于多糖,但却等同于单糖,当以10gL钾+02gL酵母膏为氮源时絮凝活性最大。-1蔗糖和10gL乳糖的混合物作为碳源时,絮凝表1培养基成分对絮凝活性的影响Table1Effectofmediumcompositiononflocculatingactivity碳源絮凝率/%氮源絮凝率/%无机盐絮凝率/%CarbonFlocculatingNitrogenFlocculatingInorganicFlocculatingsourceactivity/%sourceactivity/%saltactivity/%葡萄糖7778牛肉膏482KH2PO46491果糖7215蛋白胨701NaCl499麦芽糖7730酵母膏058K2HPO45521蔗糖7779KNO32803MgSO481602gL-1KH2PO4+01gL-1NaCl+乳糖7794(NH4)2SO4435085505gL-1K2HPO4淀粉5015尿素1095Cu2+792乙醇749205gL-1(脲+N)+02gL-1酵5298Fe3+6060蔗+果398505gL-1(脲+K)+02gL-1酵8650Al3+5101葡+乳629006gL-1脲+06gL-1酵4435Zn2+6094蔗+乳851605gL-1(脲+K)+02gL-1N5675Ca2+6403葡+果529606gL-1(脲+蛋白胨)2968N:(NH4)2SO4;K:KNO3223无机盐的优化低;pH为65时,Be-3产生的微生物絮凝剂活性如表1所示,当加入磷酸二氢钾,氯化钠和磷和密度达到最高,所以将pH为65定为最适pH。酸氢二钾时,絮凝活性最大,这三种无机盐不仅提供了微生物生长所需要的大量元素磷,磷酸二氢钾和磷酸氢二钾本身还是微生物中核酸和辅酶的重+要组成元素,它们和Na可以维持细胞内的电位[10]差和渗透压,所以选择这三种物质作为无机盐。224初始pH的优化微生物絮凝剂的活性及产量与pH值密切相关,初始pH对微生物絮凝剂活性的影响由图1可以看出,Be-3对pH有较宽的适应范围,在pH为5~9时有较高的絮凝活性,这说明此微生物絮凝剂是一种两性分子的结构,是一种稳定性很高的图1培养基pH对絮凝活性的影响絮凝剂;当pH达到9以后,絮凝活性和菌体密度Fig1EffectofmediumpHonflocculatingactivity迅速下降,这主要是由于过高的碱性改变了微生物225培养时间的优化表面的电荷性,导致其不能很好地吸收营养物,阻在Be-3发酵的过程中,每隔6h取样对其絮止了微生物絮凝剂的产生,使得活性和密度迅速降\n31(2)罗平等:絮凝剂产生菌的筛选鉴定及其在废水处理中的应用191凝活性及菌体密度进行一次测定,菌体密度和絮凝表3絮凝剂活性的分布活性随时间呈增长趋势,如图2所示,12h时Be-Table3Distributiononflocculatingactivity3开始产生微生物絮凝剂,并且在42h时絮凝活菌液上清液菌体BacterialiquidSupernatantliquidPrecipitation性达到最大,42~72h活性变化不大,但菌体仍在絮凝率/%996298115499生长,60~72h期间,微生物生长速度最快,72h后菌体的活性和密度迅速减退,说明此时营养物基24微生物絮凝剂的特性本被耗尽,因此最佳培养时间为42h。与其他絮241热稳定性凝剂相比,此絮凝剂培养时间较短,是一种较好的由图3可以看出,微生物絮凝剂对温度的要求微生物絮凝剂,在工业中具有很好的应用前景。不高,在沸水中加热50min后与在室温下相比,活性几乎不变,由于高温会导致蛋白质变性,使某些基团失活,不能与悬浮颗粒絮凝,导致活性降低,而糖类则具有耐高温性,由此可见,该微生物絮凝剂属于糖类絮凝剂。图2培养时间对絮凝活性的影响Fig2Effectofculturetimeonflocculatingactivity226通气量的优化图3微生物絮凝剂的热稳定性从表2可以看出Be-3为兼性厌氧菌,偏向于Fig3Thermalstabilityoftheflocculantsactivity厌氧,在有氧气存在的情况下,依靠呼吸产能,无氧时则依靠发酵和无氧呼吸产生能量。242显色反应从表4可以看出,微生物絮凝剂产生菌Be-3表2通气量对絮凝活性的影响为革兰氏阳性菌,显色反应结果显示,糖的特征反Table2Effectofaeratingconditiononflocculatingactivity应比较明显,可以判断微生物絮凝剂主要成分为多八层纱布棉塞单层纱布木塞糖,这与241的结果相吻合。EightfoldCottonSinglelayerStoppergauzetampongauze表4显色反应活性/%895596296887856密度/OD057806490654056Table4Chromomericreaction显色反应现象ChromomericreactionPhenomenon23絮凝剂活性的分布Molish反应紫色不同的微生物产生的絮凝剂在菌体发酵液中蒽酮反应不变色的分布是不同的,有的是由菌体细胞自溶产生的,seliwanoff反应变红有的则附着于细胞表面,或分布在发酵液中。微生双缩脲反应不变色蛋白黄反应不变色物絮凝剂产生菌Be-3产生的絮凝剂的分布如表茚三酮反应不变色3所示,表3表明,菌体发酵液和上清液的絮凝活革兰氏反应阳性性接近。由此可见,该微生物絮凝剂是Be-3发酵生长时生物合成,并分泌到体外的代谢产物,而243生理生化实验并非菌体本身,这有利于絮凝剂产品的分离提纯。生理生化实验结果显示,Be-3进行葡萄糖、\n192山西农业大学学报(自然科学版)2011蔗糖、麦芽糖和乳糖发酵试验时,颜色均变黄,这是表5絮凝剂处理废水结果由于Be-3可以分解利用这4种糖,其代谢产物为Table5Resultsoftreatingwastewaterwithbioflocculant酸性,但在产酸过程中没有气体产生。实验还表明CODcrNH3-N浊度去除率/%去除率/%去除率/%絮凝率/%Be-3在代谢过程中没有产生明胶酶,但能够分泌废水RemovalRemovalRemovalFlocculantingWasterwater淀粉酶和触酶,Be-3不具有分解蛋白质的能力,rateofrateofrateofactivityCODcrNH3-Nturbidity不可以将培养基中的色氨酸分解为吲哚,由以上实次甲基蓝693955084976667验现象可初步判断Be-3菌属于大肠杆菌菌属。污泥废水445941647644375244絮凝剂对不同废水的处理效果高岭土751427399826809用Be-3菌产生的絮凝剂处理不同的废水腐植酸779465658745389垃圾渗滤液887453714738722后,垃圾渗滤液中CODcr的去处率比较高,可达8874%,但污泥废水中CODcr的去除率比较低,(1)从污泥中提取出一株活性较高的细菌Be该微生物絮凝剂对各种废水中氨氮的去除率都比较-3作为微生物絮凝剂产生菌,以乳糖、蔗糖以及低,但腐植酸模拟废水和垃圾渗滤液中氨氮的去除脲、酵母膏和硝酸钾为最佳碳氮源,以磷酸二氢钾,率相当,说明垃圾渗滤液中含有大量的腐植酸。表磷酸氢二钾和氯化钠为无机盐时,在初始pH为5表明,该微生物絮凝剂对浊度有很好的去除效果,-165,温度为30,振速为140rmin的恒温箱絮凝率都比较高,用絮凝剂处理后,废水都比较澄中培养42h,产生的微生物絮凝剂活性最高,可达清,说明该絮凝剂对废水处理有很好的应用前景。到9804%。3结论(2)Be-3为革兰氏阳性菌,其产生的微生物絮凝剂主要成分为多糖,主要分布在发酵液的上清液中,本文通过对微生物絮凝剂产生菌Be-3的筛具有很好的热稳定性,可广泛应用于工业生产中。选及优化的实验,研究了微生物絮凝剂产生菌的特(3)用Be-3菌产生的絮凝剂处理不同的废征和最佳培养条件,为高效絮凝剂的工业生产及污水后,废水中CODcr、氨氮以及浊度的去除率都比水处理奠定了一定的基础。本文的研究主要得到较高,有良好的应用前景。以下结论:参考文献[1]YUELixi,MAChunling,CHIZhenming.Bioflocculantproducedbyklebsiellasp.MYCanditsapplicationinthetreatmentofoil-fieldproducedwate[J].JournalofOceanUniversityofChina,2006,5(4):333338.[2]SBDeng,RBBai,XMHu,etal.CharacteristicsofabioflocculantproducedbyBacillusmucilaginosusanditsuseinstarchwastewatertreatment[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,60:588593.[3]芦艳,孟丽丽,乔富珍.高效微生物絮凝剂对造纸废水的应用研究[J].水处理技术,2009,35(7):912.[4]DaolunLFeng,ShihongHXu.CharacterizationofbioflocculantMBF3-3producedbyanisolatedBacillussp[J].WorldJMicrobiolBiotechnol,2008,24:16271632.[5]ZhangTong,LinZhe.Microbialflocculantsanditsapplicationinenvironmentalprotection[J].JournalofEnvironmentalSciences,1999,11(1):112.[6]罗平,罗固源,陈晓霞.垃圾渗滤液模拟废水中低分子量脂肪酸产生的新型絮凝剂[J].水处理技术,2007,33(3):1719.[7]周长林.微生物实验与指导[M].北京:中国医药科技出版社,2004:95115.[8]魏复盛.水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社.2002:99,216,279.[9]周德庆.微生物学教程[M].北京:高等教育出版社,1993:99102.[10]郑怀礼.生物絮凝剂与絮凝技术[M].北京:化学工业出版社,2004:109184.(编辑:武英耀)
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