水处理生物学第三章细菌的生长和遗传变异 67页

第三章细菌的生长和遗传变异\n主要内容3-1细菌的生长及特性3-2细菌的遗传与变异\n一、生长与繁殖的概念二、细菌生长的测定方法三、细菌的生长特性四、微生物膜的生长特性\n3-1-1生长与繁殖同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。生长一定程度后细胞分裂，这就是繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。群体生长＝个体生长＋个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才有意义，因此“生长”一般指群体生长。\n3-1-2细菌的生长测定方法计数法直接计数法——借助显微镜间接计数法——平板计数生长量测定法测定重量、体积、含氮量来反映细菌的生长\n（一）计数法1、直接计数法（显微镜）①涂片染色法：一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。②滤膜染色法：一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。③比例计数法——将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。\n①涂片染色法1视野菌液(ml)＝(0.1ml／1cm2)*视野面积(cm2)\n\n计数器(血球计数板）测定法1×10-4ml菌液\n数了80个小格中有120个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(120个÷80)×400/1×10-4ml=600×104个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数16×5=80个小格），折算样品细菌浓度；\n②滤膜染色法一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。需要知道滤液的体积和滤膜的面积。在显微镜下计数，方法相同。\n③比例计数法比例——样品菌液与等体积（或成一定比例）的血液混合，观测二者比例如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5×400万个/ml=2.2×107个/mL样品红血球数已知(男性400~500万个／mL，女性350~450万个／mL)，平均400万个/mL细菌红血球比例计数法——将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（特点：不要求记体积）\nDAPI:4'6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride4,6-二脒基-2苯基吲哚DNA2Cl-H2N+NH2CNHH2N-CNH2Measurementoftotalcellcounts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAFDAPI:无毒性荧光染料，能够与DAN双链强力结合并产生荧光。采用358nm紫外光照射能发射明亮的蓝色荧光。\n5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinDNAOOHOOHOOHNHNNClNClMeasurementoftotalcellcounts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF\n有必要区分细菌的死活吗？饮用水中卫生细菌学标准是TBC<100个/mL（平板计数的标准），如果我们采用染色显微镜检测技术对刚刚加氯消毒的饮用水进行检测，可能会发现细菌数量会远远超过100个/mL，是不是饮用水就是不合格的饮用水呢？\n美蓝染色法（酵母活细胞计数）活细胞：无色死细胞：蓝色活菌直接计数（DVC，DirectViableCounts）吖啶橙（AO）染色直接计数BacLight染色直接计数法N.A.法CTC染色直接计数\n吖啶橙（AO）染色直接计数（AODC）吖啶橙染色直接计数法（AODC）：水样采集后迅速加入甲醛固定，甲醛最终浓度2%；取10mL固定后水样加入0.5mL0.2%吖啶橙（AcridineOrange，Sigma公司）染色1~2min.；将染色水样经滤膜（孔径0.2µm，直径25mm，黑色聚碳酸脂滤膜，Nuclepore公司）过滤；过滤后将滤膜置于载玻片上，用落射荧光显微镜（日本Nikon，EF-D型）计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体；显微镜光源为200W汞灯，激发光滤光片为450~490nm，光束分离滤光片510nm，阻挡滤光片520nm。吖啶橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光活细胞：橙色荧光死细胞：绿色荧光AODC\nBacLight染色直接计数法(一种核酸探针)BacLight染色直接计数法：将试剂按照产品要求配制后，取2mL固定后水样加入60µL所配BacLight染色试剂，避光培养15~20分钟；然后按照AODC处理方法制片，观察计数视野中发红色或绿色荧光的菌体。所用滤光片波段同AODC相同。镜检计数视野中发绿色荧光的菌体为活菌。BacLight\nN.A.法向水样中加入0.002%萘啶酮酸（NA，NalidixicAcid，Fluka公司）和0.025%酵母膏（均为最终浓度），避光，25℃培养6h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数。视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌。N.A.\nCTC染色直接计数——活菌计数将0.2mL1.67%的CTC加入10mL水样中（CTC最终浓度1mM），避光室温培养4h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数视野中的红色菌体。CTC\n双重染色10µmDTAF和CTC双重染色法\nrRNA核糖体核酸Oligonucleotideprobe核酸探针FluorescenceFISH（荧光原位杂交法）FluorescenceInsituhybridization16sRNA的碱基组成—设计特异的探针（probe）\nFISH法的步骤rRNA萤光标示探针(Probe)渗透Hybridization萤光显微镜观察、计数細胞\n10µmFISH法DTAF染色土壤中微生物的测定细菌同视野\n2、间接计数法——一种活菌计数法①平板计数法：描述：CFU（colonyformationunit）/mL将一定体积的菌液，均匀涂布在固体培养基上（例如水中细菌总数采用的营养琼脂培养基），一定温度下培养，计数平板形成的菌落，一个菌落代表一个细菌。计数活细菌，死细菌不能够生长注意：一般可培养的微生物很少，计数结果与采用显微镜直接计数的结果差几百倍，甚至千、万。\n\n稀释平板计数法—固体培养法菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图\n无菌水稀释平板计数法—固体培养法第一步：菌样巧妙稀释得到不同稀释度（10-x）菌液\n10-210-310-410-5各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。\n第四步：计数细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定。注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差\n\n2、间接计数法——一种活菌计数法②滤膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养），然后把滤膜贴到培养基上，细菌获得营养而生长，形成菌落。——大肠菌群测定\n2、间接计数法——一种活菌计数法③液体计数法（MPN法，mostprobablenumber法）最可能数法特点：液体培养、统计学查表计数主要用于不能在平板培养基上形成菌落的菌（硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）将菌接种于液体培养基，经过一段时间培养，采用一定的技术来检测是否有细菌生长。例如硫酸盐还原菌的检测是利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行检测，按MPN法进行计数。\n332010-410-510-6310-10-210-310-410-5（1）稀释（2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气恒温37℃培养14天记录变黑的试管情况（3）培养1ml+9ml培养基提问：为什么有些试管变黑有些没有？稀释程度、取样概率\n(4)统计－查表－计算①统计数量指标的确定根据不同稀释度变黑试管，得到三位数及其中最低稀释度取重复管数都有菌生长的最高稀释度的生长管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数提问：上例情况而言统计数量是几？32010-4\nMPN三管法测数统计表（个菌/毫升）水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。上面例子中数量指标“320”对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为9.5x104个菌/毫升。②查MPN表\n（二）测生长量法（1）测体积：粗放的方法，离心或自然沉降后观察体积；（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种；105~110ºC下干燥后称重（干重约为湿重的10~20%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixedliquidsuspendedsolid）混合悬浮固体MLVSS（mixedliquidvolatilesuspendedsolid）550ºC、2h、马福炉\n细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比（3）比浊法/光密度法OD（opticaldensity）Λ＝450~660nm,可见光\n①制标准曲线（OD~No）②测菌液浊度，查图表得出细菌数量浊度仪或721分光光度仪\n（5）细胞含氮量细菌含氮量12.5%、酵母为7.5%粗蛋白量＝6.25×N量（6）DNA、蛋白质同一细菌所DNA和蛋白质的量相对稳定，所以可以测DNA、蛋白质。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物醌类1g细胞平均含1μmol醌类。（4）测细胞含碳量POC（particulateorganiccarbon）POC＝12Xmg/l特点：快、低浓度也可测TOC（totalorganiccarbon）：总有机碳DOC（dissolvedorganiccarbon）：溶解性有机碳\n3-1-3细菌的生长特性间歇培养（Batchcultivation）和生长曲线（growthcurve）将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。接种\nFig.1Bacteriagrowthwithdifferentphosphorus(0～3µg/L)and10µgAOC/L\n总细胞数细菌典型生长曲线活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数\n时间活细菌重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段细菌生长曲线（按细菌重量绘制）\n细菌生长曲线（按细菌数目的对数绘制）00时间细菌数对数生长速度缓慢期对数期稳定期衰老期活菌数总菌数\n延滞期、缓慢期（lagphase）细菌特点：生长速率常数近于零细胞形态变大，但基本不分裂rRNA含量增高合成代谢较活跃影响延滞期长短的因素：接种龄：种子（inoculum）处于什么生长期。Ⅰ、Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ接种量：特别是X0/S0，即初期微生物浓度与基质浓度的比。产生延滞期的原因：缺乏分解新环境中有关基质的酶；缺乏充足的代谢中间产物。总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数底物特点：底物充足\n2）指数期（exponentialphase）对数期、生长率上升阶段细胞数（量）以指数形式增加的时间段。细菌特点：生长速率最大，世代时间（generationtime）最短酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀底物特点：底物充足，大量被细菌消耗，降解速率最高总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数\n指数期数学描述世代时间n世代数\n3）稳定期（stationaryphase）：恒定期、静止期、生长下降期细菌特点：净增长速度为零繁殖与死亡速度相等正生长与负生长相等底物特点：底物被大量消耗，不能够维持对数期细菌高生长速率所需要的有机物质，导致细菌生长率下降出现稳定期的原因：营养物尤其是生长因子耗尽营养物比例失调pH、DO、氧化还原电位的变化总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数\n数学表达生长下降阶段S很低，其浓度对微生物影响大即有机物分解速度与其浓度成正比\n4）衰亡期（declinephase,deathphase）内源呼吸期（endogenousrespirationphase）内源呼吸：体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化。细菌特点：细胞会发生自溶现象（autolysis），蛋白质水解酶活力往往产生芽孢出现死亡期的原因：营养物不足外界条件恶化底物特点：底物被微生物大量耗尽，微生物因得不到营养而进行内源呼吸总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数\n细菌生长的数学描述生长与基质浓度的关系微生物比增长速度：单位时间，单位微生物量的增加量基质浓度s\nKs:饱和常数，与的s值相等Ks>>S时sKsMonod公式（莫诺特公式）经验公式（微生物增长）\n对于像活性污泥这样的混合微生物群，也有类似的生长曲线。细菌生长期与废水生物处理：水处理中如何避免缓慢期接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化微生物维持到对数期可获得高的处理能力，即分解速度高，但处理效果不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质\n处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。故传统的活性污泥法常运行在这个范围。衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合，如延时曝气及污泥消化，出水水质好。\n食料/微生物代谢速率内源呼吸阶段生长率下降阶段生长率上升阶段（沉降性能好）（沉降性能差）大多数活性污泥处理系统运行范围延时曝气，污泥消化微生物代谢速率与食料/微生物的关系注意：各个阶段的食物/菌量比发生变化，相当于活性污泥中的负荷。F/M（食稀比）\n连续培养（continuouscultivation）是一种连续进料又连续出料的培养方式根据控制因素的不同分为恒浊连续培养（turbidostat）：培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长，通过控制进料流速保持细菌浊度一定，使其处于对数生长期。恒化连续培养（chemostat）：固定恒定的进料流速，同样的流速排出，反应器中营养物质浓度不变，为限制性营养因子控制生长。3.半连续培养（semi-batchcultivation）、半间歇式Fillanddraw\n4.分批补料式培养（fedbatch）以低速把高浓度的营养物质连续加入培养器中，但不出料。体积是随时间变化的特点：能任意控制培养液中的底物浓度，所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡，所以能保持一定的浓度。主要用于：有抑制作用的底物生长因子添加高浓度菌体培养\n3-1-4微生物膜的生长特性1.生物膜的生长液体培养基中加入固体物质（载体），微生物在其表面吸附、生长、繁殖形成形成膜，这种膜叫微生物膜。微生物膜的生长膜厚的增加，密度也将发生变化从单位固体表面积上的微生物量（mg/cm2）上看可分为6个阶段延滞期、加速增长期、恒速增长期、减速增长期、安定期、脱落期\n延滞期加速增长期恒速增长期减速增长期安定期脱落期\n\n（1）延滞期：细胞吸附在固体表面上的过程（沉降）影响吸附速度的因子：材质、表面性质、形状、细胞的性质、操作条件（2）加速增长期：还没有形成完整的膜（3）恒速增长期：活性细胞量达到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。\n（4）减速增长期：恒速增长期与安定期的过渡期，持续时间短。（5）安定期：增长速度与脱落速度相平衡，膜量及膜厚达到最大值。（6）脱落期：外因：流体的剪切力内因：细菌的死亡、气泡的形成，细胞外高分子量的变化。\n2.生物膜的特性（1）有效膜厚并不是全部有活性基质的扩散细胞的死亡70～200μm（平均100μm），并不是越厚越好。（2）密度（与膜厚有关）微生物膜的湿密度：密度有时小于水，一般接近于1。（因为有气泡的存在）\n湿生物膜组成（体积比）：细胞5-15%，气泡2-18%，水70－90%（3）组成：（g-/g-生物膜）COD：0.47TOC：0.46T-N：0.11T-P：0.22生物膜干组成：（g-/g-生物膜）\n膜厚＝膜体积/载体表面积＝生物膜湿重/表面积生物膜湿重＝（载体＋膜）－载体生物膜生物量的测定方法：超声波脱落，按照细菌数量测定。生物膜的测量方法\n第一次作业请绘制间歇培养模式下的细菌生长曲线并说明各个生长阶段底物和细菌生长的特点。