城市污水处理工艺对宿主特异性标记物和肠道病原菌的去除效果 4页

第8卷第3期环境工程学报Vo1．8．No．32014年3月ChineseJournalofEnvironmentalEngineeringMar．2014城市污水处理工艺对宿主特异性标记物和肠道病原菌的去除效果程艳艳张崇淼王晓昌周远涛(1．西安建筑科技大学环境与市政工程学院，西北水资源与环境生态教育部重点实验室，西安710055；2．西安创业水务有限公司，西安710077)摘要采用自制小型反应器模拟实验和实时荧光定量PCR检测方法，针对指示人类、犬类粪便污染的宿主特异性标记物，以及病原性大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌等典型的肠道病原菌，分别考察了序批式活性污泥法(SBR)、混凝、过滤工艺对它们的去除效果。研究结果表明，SBR工艺的去除效果优于混凝和过滤工艺，对标记物和病原菌毒力基因的去除率都在93．5％以上。SBR工艺中初期短时间的搅拌即可去除大部分标记物和病原菌。在这3种处理工艺中，宿主特异性标记物与肠道病原菌毒力基因的去除率具有显著相关性，这说明宿主特异性标记物能够在一定程度上反映污水处理过程中肠道病原菌的含量。关键词宿主特异性标记物肠道病原菌序批式活性污泥法混凝过滤中图分类号X703．1文献标识码A文章编号1673-9108(2014)03-0887-04Removaleficiencyofhost．specificmarkersandentericpathogenicbacteriabymunicipalwastewatertreatmentprocessesChengYanyanZhangChongmiaoWangXiaochangZhouYuantao(1．KeyLabofNorthwestWaterResources，EnvironmentandEcology，MinistryofEducation，SchoolofEnvironmentalandMunicipalEngineeringXi’anUniversityofArchitectureandTechnology，Xi’an710055，China；2．Xi’anCapitalWaterCompanyLimited，Xi’an710077，China)AbstractThesmallexperimentalreactorsandreal-timePCRdetectionmethodwereusedtoinvestigatetheremovaleficiencyofhost-specificmarkersforhumananddog，andentericpathogenicbacteriaincludingpatho-genicEscherichiacoil，SalmonellaandShigellabysequencingbatchreactoractivatedsludgeprocess(SBR)，CO—agulationandfiltration，respectively．Theresultsshowedthattheremovalefficienciesofhost—specificmarkersandentericbacteriabySBRprocessreachedabove93．5％．whichweresignificantlyhigherthancoagulationandfiltration．InSBRprocess，theremovalofhost—specificmarkersandentericbacteriamainlyoccurredinstageofpreliminarymixing．Intheseprocesses，significantcorrelationswerefoundbetweenhost—specificmarkersandbacterialvirulencegenes，whichindicatedthatthehost-specificmarkerscouldtosomeextentreflecttheconcen-trationofpathogenicbacteriainwastewatertreatmentprocess．Keywordshost—specificmarkers；entericpathogenicbacteria；sequencingbatchreactoractivatedsludgeprocess；coagulation；filtration近几年，水环境污染现象越来越严重，而非点源特异性标记物进行粪便污染来源追踪的方法得到了粪便污染对城市河流、人类身体健康以及人类赖以各国研究者的青睐。这些标记物主要是一些大量存生存的环境有着重大的影响。人类和其他动物的粪在于粪便中的微生物的特定核酸片段，具有明显的便可能含有大量的肠道病原菌，例如，沙门氏菌、志宿主特异性，即能够直接反映粪便污染的来源。例贺氏菌、病原性大肠埃希氏菌等。因此，倘若此基金项目：国家自然科学基金资助项目(50908185)；陕西省教育厅类粪便排入水体，病原菌就会随之传播，危害人类科研计划项目(11JK0765)的健康。收稿日期：2012—12—03；修订日期：2013一O1—0220世纪80年代起，欧美等发达国家率先开展作者简介：程艳艳(1987一)，女，硕士，主要从事环境污染物的分子了微生物来源追踪(microbialsourcetracking，MST)检测。E—mail：smilechengyan@163．corn方法的研究，并取得一定的发展。特别是利用宿主通讯联系人，E—mail：zhangchongmiao@163．COB\n888环境工程学报第8卷如来自拟杆菌和双歧杆菌的16SrRNA基因’、牛1．2．3过滤工艺肠道病毒以及人类腺病毒等。与其他MST方采用自制有机玻璃滤柱对实验水样进行过滤。法相比，利用宿主特异性标记物的方法的优点在于滤柱直径10am，滤柱总高1．5m，滤料采用单层石其不受微生物培养的限制，能够充分顾及到样品中英砂，粒径0．4mm和1．0mm2种，不均匀系数小完整的微生物类群，无需依赖比对数据库，从而操作于0．2，滤料层高度65am¨。使用实验水样直接更为方便快捷，通常能够在几个小时内完成分析。作为进水，进行过滤。取进水和出水进行检测。了解宿主特异性标记物的存活特性及其与肠道1．3实时荧光定量PCR检测方法病原菌的联系，对于发展MST技术有非常重要的意本研究选用了2种宿主特异性标记物Bia．义，但目前在这方面的研究报道很少。本研究利用hum¨和Bac—dog，前者来源于双歧杆菌，指示人小型反应器来模拟城市污水二级处理工艺，通过实类粪便污染；后者来源于拟杆菌，指示犬类粪便污染，时荧光定量PCR技术进行定量检测，分别考察了几根据其来源菌株16SrRNA基因的保守性选用合适的种常见的污水处理工艺对宿主特异性标记物和典型引物进行PCR扩增。对于肠道病原菌，分别针对其肠道病原菌的去除效果，并研究了两者之间的关系。特定的毒力基因进行检测，包括病原性的大肠埃希氏1材料与方法菌的eaeA和EAgg基因’，志贺氏菌的ipaH基因，沙门氏菌的invA基因。宿主特异性标记物1．1实验用水和病原菌毒力基因及其扩增引物如表2所示。本研究使用的实验水样是采集自西安市某污水表2宿主特异性标记物和病原菌毒力基因的引物处理厂曝气沉砂池出水与等体积模拟生活污水的混Table2Primerpairsforhost-specificmarkers合水样。模拟生活污水的组分及浓度见表1。andbacterialvirulencegenes表1模拟生活污水组分蒯(5'-3')扩增片段Table1Compositionofsimulatedomesticsewage长度(bp)(mg／L)基质名称浓度基质名称浓度葡萄糖750H3BO30．05NH4Cl150CoC12·6H2O0．05K2HPO4‘3H2O29CuC1，0．03KH2PO418MnSO40．05CaC12·2H2O20A1C10．05FeSO4·7H2O20ZnC120．05MgSO4·7H2O30NiC1，0．O51．2污水处理工艺1．2．1SBR工艺SBR反应周期为8h，包括瞬时进水、搅拌、曝气、静置沉降4个阶段。其中搅拌2h，曝气7h，静沉1h，曝气阶段溶解氧保持在3～4mg／L。使用实验水样作为进水驯化1个月之后，反应器达到稳定状态，二级出水COD<50mg／L、TN<15mg／L、TP取水样250—500mL，经水样浓缩提取DNA(北京<0．5mg／L。百泰克生物技术有限公司)，使用iQ5实时荧光定量当反应器运行稳定之后，取各阶段水样的静沉PCR仪(美国Bio—rad公司)进行定量PCR检测。反上清液，进行检测。应体系总体积为25，其中2×SYBRPremixDimer．1．2．2混凝沉淀工艺Eraser(大连宝生物工程有限公司)12．5，上下游以实验水样作为进水直接进行混凝沉淀。投加弓I物(10I~mol／L)0．75L，模板2L。硫酸铝和聚丙烯酰胺，终浓度分别为27mg／L和实时荧光定量PCR反应程序为95℃30S；401mg／L。先快速搅拌(300～400r／min)，30S；然个循环：95℃10S，退火30S，72~(260S，读板采集荧后慢速搅拌(60～80r／min)，15～20min；最后静沉光信号。其中Bia—hum退火温度55℃，读板温度30min[。。84℃；Bac-dog退火温度58cI=，读板温度80℃；eaeA取进水和出水进行检测。基因退火温度63℃，读板温度81℃；EAgg基因退火\n第3期程艳艳等：城市污水处理工艺对宿主特异性标记物和肠道病原菌的去除效果889温度63℃，读板温度74~C；ipaH基因退火温度60~C，读板温度82~C；invA基因退火温度65％，读板温度84~(2。为保证扩增产物的特异性，在65～95℃测定熔解曲线。2结果与分析2．1污水处理工艺对标记物和病原菌毒力基因的进水出水去除图1显示了SBR工艺的进水、出水以及搅拌和图2混凝对宿主特异性标记物和曝气阶段水样中宿主特异性标记物和肠道病原菌毒病原菌毒力基因浓度的影响Fig．2Effectofcoagulationontheconcentrations力基因的浓度。标记物和毒力基因的浓度随着工艺ofhost—specificmarkersandbacterialvirulencegenes流程不断降低，Bia—hum和Bac—dog的浓度分别从2．2X10copies／100mL和1．3X10copies／100mLlOE+07降低到2．3X10copies／100mL和1．7X10copies／lOE+06100mL，而各种毒力基因浓度则从为2．2×10～自1OE+05g1．2X10cop^ie目s／001一00ld0m3L降低到1．4×10～3．3X1OE+04邑10copieEs／1E00EmLE。EEEE81OE+03++++++++l0E7+0765432lO越1OE+02l0E+O61OE+01基1OE+05g1OE+042分1OE+0310E+021OE+0l1OE+00进水搅拌曝气出水图1SBR工艺对宿主特异性标记物毒力基因的去除率为50．7％～69．O％。由此可见，和病原菌毒力基因浓度的影响过滤和混凝工艺对微生物的去除效果明显劣于以Fig．1EffectofSBRprocessontheconcentrationsSBR为代表的生物处理工艺。ofhost—specificmarkersandbacterialvirulencegenes在SBR工艺中，第1阶段2h的搅拌就能使有效的去除标记物和肠道病原菌毒力基因。例如Bia．实验水样直接经过混凝工艺处理后，出水中hum的浓度降低89．2％，ipaH的浓度则下降Bia—hum和Bac-dog的浓度分别为7．3X10copies／90．3％。这主要是由于活性污泥的生物吸附作用。100mL和6．9X10copies／100mL，毒力基因浓度范活性污泥是由大量微生物构成的生物絮体，不仅表围为5．3X10。～3．4X10copies／100mL(图2)。实面积巨大，且其中的细菌多以菌胶团的形式存在，能验水样直接经过滤工艺之后的出水中Bia—hum和分泌出多糖类粘性物质。因此，活性污泥具有很强Bac—dog的浓度分别为5．6X10copies／100mL和的吸附能力，能够在短时间内出去污水中的悬浮颗6．3X10copies／100mL，毒力基因浓度范围为6．7×粒物，从而使上清液中的标记物和肠道病原菌毒力10～4．9×10copies／100mL(图3)。基因浓度都显著降低。从以上实验结果可以看出，SBR工艺对标记物2．2标记物和肠道病原菌去除率的相关性和肠道病原菌的去除效果较好，对Bia．hum和Bac-利用SPSS软件，计算在SBR各阶段、混凝和过dog的去除率分别为99．9％和98．7％，对各种毒力滤工艺对宿主特异性标记物与肠道病原菌毒力基因基因的去除率也均在93．5％以上。混凝过程能够去除率的Spearman秩相关系数，来考察它们在污水去除66．5％的Bia-hum和46．1％的Bac．dog，以及处理过程中的变化是否具有相关性。从表3可以看62．3％～86．2％的毒力基因。单独使用过滤工艺，出，2种标记物分别与4种毒力基因都有显著的相能够去除74．3％的Bia-hum和50．4％的Bac-dog，关性。这说明了宿主特异性标记物能够在一定程度\n890环境工程学报第8卷上反映污水处理过程对肠道病原菌的含量。LiYuan，ShenYaoliang，SunLizhu．CultivationofaerobicgranuleslugewithdomesticwastewaterinSBR．Chinese表3宿主特异性标记物与病原菌毒力基因的相关性JournalofEnvironmentalEngineering，2010，4(7)：1537—Table3Correlationofhost-specificmarkers1540(inChinese)[8]周玉芬，郑祥，雷洋，等．活性污泥对病毒的生物吸附特andbaterialvirulencegenes性．环境科学，2012，33(5)：1621—1624ZhouYufen，ZhengXiang，LeiYang，eta1．Biosorptionchar—acteristicsoff2bacteriophageontoactivatedsludge．Environ—mentalScience，2012，33(5)：1621．1624(inChinese)[9]杨开明，张建强，杨小林．混凝沉淀过程中最佳混凝剂投量的研究．工业水处理，2005，25(9)：49—51YangKaiming，ZhangJianqiang，YangXiaolin．Researchonoptimaldosageofcoagulantintheprocessofcoagulatingsedimentation．IndustrialWaterTreatment，2005，25(9)：3结论49—51(inChinese)[10]周慧芳，吴彩斌，罗威年，等．水厂混凝剂最佳投加量烧杯实验模拟方法研究．江西农业大学学报，2005，27(1)与混凝和过滤工艺相比，SBR工艺对宿主(6)：930—933特异性标记物和肠道病原菌的去除效果更显著。因ZhouHuifang，WuCaibin，LuoWeinian，eta1．Astudyon此在城市污水二级处理流程中，生物处理阶段对病simulationmethodofcoagulation—flocculationjartestofoptimumdosageforwaterplant．ActaAgricuhuraeUniveri—原菌的去除发挥了主要作用。tatisJiangxiensis，2005，27(6)：930—933(inChinese)(2)SBR工艺初期的搅拌阶段可以在短时间内[11]严煦世，范瑾初．给水工程(第4版)．北京：中国建筑工去除大部分标记物和病原菌，这可能主要是通过活业出版社，1999性污泥的生物吸附作用来实现的。[12]MatsukiT．，WatanabeK．，TamakaR．，eta1．Rapideiden—tificationofhumanintestinalbifidobacteriaby16SrRNA(3)在污水处理过程中，宿主特异性标记物与病targeted—speciesandgroup—specificprimers．FEMSMicro—原菌毒力基因的去除率具有显著相关性。通过定量bio1．Lett．，1998，167(2)：113—121检测标记物，能够在一定程度上反映病原菌的含量。[13]DickL．K．，SimonichM．T．，FieldK．G．，eta1．Micro—platesubtractivehybridizationtoenrichforbacteroidales参考文献geneticmarkersforfecalsourceidentification．AppliedandSavichtchevaO．，OkabeS．AhernativeindicatorsoffecalEnvironmentalMicrobiology，2005，71(6)：3179—3183pollution：Relationswithpathogensandconventionalindi—l14lAhmedaW．，TuckerJ．，BettelheimbK．A．，eta1．De—cators，currentmethodologiesfordirectpathogenmonitoringtectionofvirulencegenesinEscherichiacoliofanexistingandfutureapplicationperspectives．WaterResearch，2006，metabolicfingerprintdatabasetopredictthesourcesof40(13)：2463-2476pathogenicE．coliinsurfacewater．WaterResearch，2007，[2]PayanA．，EbdonJ．，TaylorH．．eta1．Methodforisolation41(16)：3785—3791ofbacteroidesbacteriophagehoststrainssuitablefortrack—[15]谢润欣，张崇淼，王晓昌，等．城市污水中病原性大肠埃ingsourcesoffecalpollutioninwater．AppliedandEnvi—希氏菌毒力基因eaeA和帕E的实时荧光定量PCR检ronmentalMicrobiology，2005，71(9)：5659-5662测．环境科学研究，2012，25(8)：922—926[3]BonjochX．，BallesteE．，BlanchA．R．PCRwith16SXieRunxin，ZhangChongmiao，WangXiaochang，eta1．rRNAgene—targetedprimersofbifidobacteriumspp．toiden—QuantitativedetectionofvirulencegeneseaeAandrfbEoftifysourcesoffecalpolhion．AppliedandEnvironmentalpathogenicEscherichiacoilwastewaterbyreal—timePCR．Microbiology，2004，70(5)：3171—3175ResearchofEnvironmentalSciences，2012．25(8)：922—[4]LeyV．，HigginsJ．，FayerR．Bovineenterovirusesasindi-926(inChinese)catorsoffecalcontamination．AppliedandEnvironmental[16]张崇淼．水环境中肠道病原体的PCR检测方法与健康Microbiology，2002，68(7)：3455—3461风险评价研究．西安：西安建筑科技大学博士学位论[5]AhmedW．，GoonetillekeA．，GardnerT．Humanandbo—文，2008vineadenovirusesforthedetectionofsource—specificfecalZhangChongmiao．StudyonthePCRdetectionmethodandpollutionincoastalwatersinAustralia．WaterResearch，healthriskassessmentofentericpathogensinwaterenvi—2010，44(16)：4662-4673ronment．Xi’an：DoctoralDissertationofXi’anUnivversi—[6]张鉴达．好氧颗粒污泥的培养及其工艺研究．济南：山东tyofArchitectureandTechnology，2008(inChinese)大学硕士学位论文，2006[17]曾颂，张崇淼，王晓昌，等．城市污水二级处理出水中沙门ZhangJianda．Cultivationandtechnicalstudyofaerobic氏菌的PCR检测．环境科学研究，2010，23(3)：361—365granularsludge．Jinan：Master’sDegreeThesisofShan—ZengSong，ZhangChongmiao，WangXiaochang，eta1．dongUniversity，2006(inChinese)PCRdetectionofsalmonellainsecondaryefluentinmu—[7]李媛，沈耀良，孙立柱．SBR处理生活污水好氧颗粒污泥nicipalwastewatertreatmentsystem．ResearchofEnviron—的培养研究．环境工程学报，2010，4(7)：1537—1540mentalSciences，2010，23(3)：361—365(inChinese)