南京市4个污水处理厂的活性污泥中细菌的分离鉴定和抗生素耐药性分析-论文 6页

第33卷第5期环境科学Vo1．33．No．52012年5月ENVIRONMENTALSCIENCEMay，2012南京市4个污水处理厂的活性污泥中细菌的分离鉴定和抗生素耐药性分析葛峰，郭坤，周广灿，张会娟。，刘济宁，戴亦军(1．江苏省微生物与功能基因组学实验室，江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心，南京师范大学生命科学学院，南京210046；2．环境保护部南京环境科学研究所，南京210042)摘要：通过16SrDNA序列分析对南京CN、CE、JN和JM这4个污水处理厂的活性污泥中分离的细菌进行鉴定，采用Kirby—Bauer纸片琼脂扩散法分析细菌的抗生素耐药性，目的是阐明该地区污水处理厂活性污泥中细菌抗生素耐药性现状，探索污水及污泥的潜在环境风险．4个污水处理厂分别分离到7、9、8和11株菌落形态不同的细菌，上述35株细菌分属25个种，17个属．抗生素耐药性分析显示，97．1％的菌株具有抗生素耐药性，80％菌株具有多重耐药性．分离菌株对氨苄西林、卡那霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉索、四环素、红霉素和大观霉素的耐药率分别为71．4％、37．1％、37．1％、57．1％、34．3％、68．6％、94．3％和65．7％．结果表明活性污泥中细菌耐药性严重；不同菌株间的耐药性分析显示，危害水产养殖业的病原菌气单胞菌具有严重的多重耐药性，所有芽孢杆菌对氯霉素、链霉素和庆大霉素敏感；污水处理厂应加强出水的消杀工作，避免二次污染．关键词：活性污泥；菌种鉴定；抗生素耐药性；气单胞菌；芽孢杆菌中图分类号：x172；X501文献标识码：A文章编号：0250．3301(2012)05．1646．06IsolationandIdentificationofBacteriaintheActivatedSludgefromFourSewageTreatmentPlantsinNanjingCityandItsAntibioticResistanceAnalysisGEFeng’，GUOKun‘，ZHOUGuang—can，ZHANGHui-juan，LIUJi—ning，DAIYi-jun(1．JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics，JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources，CollegeofLifeScience，NanjingNormalUniversity，Nanjing210046，China；2．NanjingInstituteofEnvironmentalSciences，MEP，Nanjing210042，China)Abstract：BacteriawereisolatedfromtheactivatedsludgeofCN，CE，JNandJMSewageTreatmentPlants(STPs)inNanjingcityandidentifiedby16SrDNAsequenceanalysis．TheantibioticresistanceanalysisoftheisolatedbacteriawasconductedbyKirby—BauerDiscAgarDiffusionMethod．TheobjectiveofthisstudyistoclarifythecurrentstateofbacteriaantibioticresistancefromthefourSTPsandanalyzethepotentialenvironmentalriskoftheproducedwastewaterandthesludge．The7，9，8and11bacterialstrainswithdifferentmorphologywererespectivelyisolatedfromtheabovefoursamplesites，whichbelongedto25speciesand17genera．Antibioticresistanceanalysisindicatedthat97．1％ofisolateshadantibioticresistanceand80％ofisolateshadmulti—antibioticresistance．Thedrugresistancerateswere71．4％，37．1％，37．1％，57．1％，34．3％．68．6％，94．3％and65．7％ofampicillin(AM)，kanamycin(KAN)，chloromycetin(CHL)，streptomycin(STR)，gentamicin(GEN)，tetracycline(TET)，erythromycin(EM)andspectinomycin(SPE)，respectively．ItindicatedthattheactivatedsludgefromthefourSTPshadhighantibioticresistance．ThedrugresistanceanalysisbetweendifferentbacteriaindicatedthatthegenusAeromonas，anaquacuhuralpathogen，hadmulti—antibioticresistance，whileallofBacillusweresensitivetoCHL，STRandGEN．TheSTPsshouldenhancethesterilizationofefluentwatertoavoidthesecondpollutions．Keywords：activatedsludge：bacterialidentification；antibioticresistance；Aeromonas；Bacillus医疗、畜牧和水产养殖行业中大量使用抗生素究表明从重庆市医院污水污染的地表水和农业流域后，未被完全代谢的抗生素通过医院污水、城市生活地表水中分离的耐热大肠菌群中98．1％菌株具多污水、畜禽粪便等多种途径进入水环境造成污染，导重耐药性’．张新英等的调查显示南宁市生活致水环境中的微生物群落产生抗生素耐药性．目前污水中大肠菌群对青霉素、红霉素和氨苄西林具有国外一些研究表明，污水处理厂的进水、出水及活性不同程度的耐药性．污泥中均含有抗生素耐药菌株．由于畜牧水产养活性污泥法是处理生活污水和工业废水最常用殖业和医药卫生行业滥用抗生素，我国已成为抗生收稿日期：2011—07．05；修订日期：2011-08—1O素耐药性发展最快的国家之一．虽然我国对水环境基金项目：环境保护部环保公益性行业科研专项(200809092)作者简介：葛峰(1981一)，男，博士研究生，助理研究员，主要研究方中的抗生素耐药性和耐药菌株研究较少，但现有的向为环境生物，E—mail：gefeng@nies．org报道显示水环境中抗生素耐药情况非常严重，有研通讯联系人，E—mail：daiyijun@njnu，edu．1713\n5期葛峰等：南京市4个污水处理厂的活性污泥中细菌的分离鉴定和抗生素耐药性分析方法之一，污泥中的细菌是主要生物类群．含抗链霉素(Streptomycin，STR)，庆大霉素(Gentamicin，生素的污水很容易造成持续的抗生素选择性压力并GEN)，四环素(Tetracycline，TET)，红霉素导致活性污泥中的细菌产生耐药性，同时污水进水(Erythromycin，EM)，大观霉素(Spectinomycin，中的耐药菌株的耐药基因传递给活性污泥中的细SPE)购于上海生工生物工程公司．菌，因而可能导致活性污泥变成一个巨大的耐药菌抗生素敏感性测定用MuellerHinton(M—H)培株和耐药基因储存库¨’．随着我国城市化的快速养基(g·L)：酸水解酪蛋白17．5，可溶性淀粉发展和污水处理厂的增加，污水处理后的剩余污泥1．5，牛肉膏20．0，琼脂17．0，pH7．4．量有较大幅度的增长，剩余污泥处置压力也随之增细菌培养用Luria—Bertani(LB)培养基大，如南京市污水处理厂每天需要处置的总污泥量(g·L)：酵母粉5．0，蛋白胨10．0，NaC110．0，琼脂达到了893t．污泥处置方式主要是混合填埋、焚20．0，pH7．2．烧和资源化再利用．因节能减排和发展循环经1．2菌落总数测定济，我国污泥资源化再利用受到了高度关注．由活性污泥中的菌落总数的测定按照GB／T于活性污泥可能是一个巨大的耐药菌株和耐药基因4789．2-2OLO(中华人民共和国国家标准食品卫生储存库，因此在污泥回用于土壤过程中，不仅要求重微生物学检验菌落总数测定》和SN0168．92《中华金属和病原菌不得超标，还需要对活性污泥中的微人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌生物及其耐药性状况进行分析，研究污泥中耐药菌落计数》的标准进行．菌落计数以菌落形成单位和耐药基因是否会造成土壤环境的二次传播和(colony一~rmingunits，CFU)计数．污染．1．3活性污泥中可培养细菌鉴定近年来，对各类水体中微生物对抗生素的耐药从上述细菌生长的LB平板上挑取菌落形态和性开展了部分研究工作，然而有关污水处理厂活性颜色等有明显差异的菌株，重新划线纯化后，采用污泥中的微生物的耐药性鲜见报道．本研究开展了16SrDNA序列分析进行菌种鉴定．从平板上挑取单南京市CN、CE、JN和JM这4个污水处理厂的活性菌落，加入20．0L无菌水，100℃加热10min．轻微污泥中的细菌检测及8种抗生素的抗药性分析和比离心后，取5．0L作为菌落PCR扩增的模板．对菌较分析，了解活性污泥中细菌及其耐药情况的严重落PCR未扩增出条带的细菌样品提取基因组作为程度，以期为活性污泥的综合处理、污泥资源化冉利扩增模板．基因组DNA的提取和16SrDNA片段的用的风险评估及控制技术提供参考．扩增按照文献[11]的方法进行，采用的一对通用引物K1(5一AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC一3)和1材料与方法K2(5一TACGGTTACCTTGTTACGACTT一3)，分别对1．1材料应于大肠杆菌16SrDNA的2～25nt和1479～1500活性污泥样品分别采集于南京市的CN、CE、JNnt．PCR扩增体系为：10×Taq聚合酶反应缓冲液和JM这4个污水处理厂，采样时间为2010年115．0L，MgC12(25．0mmol·L)5．0L，dNTP(2．5月．4个污水处理厂的污水处理量和处理工艺见mmol·L)5．0L，弓I物K1(2O．0I~mol·L)1．0表1．L，弓I物K2(20．0I~mol·L一)1．0L，模板5．0txL，表1南京市4个污水处理厂的基本情况TaqDNA聚合酶(5．0U·L)0．5L，灭菌双蒸Table1BasicinformationoffoursewagetreatmentplantsinNanjing水27．5L反应体系的体积共50．0L．PCR扩增程序为：95℃预变性120s，95℃60S，55℃90S，72℃120S，共29个循环，72℃10min，4℃保温．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，送由上海生工生物T程公司测序．测得16SrDNA序列通过Internet在美国生物技术信息中心(NCBI)核酸数据1)Unitanks：交替式生物处理池T艺；A／O：Anaerobic—Anoxic．Oxic，生物脱氮除磷；A／O：Anoxic／Oxic，厌氧好氧库中进行Blastn搜索．系统发育树采用Mega5．0软件进行构建，用Neighbor．Joining法构建系统发生抗生素氨苄西林(Ampicillin，AMP)，卡那霉素树，1000次随机抽样，计算自引导值(Bootstrap)以(Kanamycin，KAN)，氯霉素(Chloromycetin，CHL)，评估系统发生树的置信度．\nl648环境科学33卷1．4抗生素敏感性试验OCN．3JF496523药物敏感性采用Kirby—Bauer纸片琼脂扩散法，97jEnterobacterasburiaeEU221358兀JN一5JF4965446DIEnterobactercloacaeGU549440选择8种常用的抗生素进行敏感性试验．抗生素浓日oIICE一12JF496540l西cherichiacoliEF560783度(Ixg／片)分别为：AMP10．0，KAN30．0，CHL3F4琴。。。30．0，STR10．0，GEN10．0，TET30．0．EM15．0，SPE厂—-1lICE一10JF496539lI19KluyveraintermediaNR028802100．0．革兰氏阳性细菌的质控菌株采用金黄色葡萄．CE．1JF4965321SerratiaProteamac“lansEU327084ll98rJN．1JF496541球菌ATCC25923，革兰氏阴性细菌的质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC29522．结果判定按NCCL2003版lIlllAeromonasveroniiGU735964niiFJ940849执行．耐药性分为三层次：敏感(S)、中介(I)、耐药l，lJM．1JF49655071lllAeromonashydrophilaX60404o0]JM．3JF496532(R)．为便于统计，耐药性处于中介(I)并入耐药l1～IderomonaspunctataHM172499(R)计算]．一CN．4JF496524IlfPseudomonasaeruginosaGU384228：2DlGu广—2结果与分析llLJM一6JF496555I厂——_l_O1qJM-4JF496553EnhydrobacteraerogaccusNR029005rCN一1J154965212．14个污水处理厂活性污泥中细菌总数L～咖活性污泥的净化污水功能主要取决于栖息在活袁ICE一9JF4965381O0IJM-10JF496558性污泥上的微生物．活性污泥上的微生物以好氧细ILNeisseriasp．AJ586614—9：8{1oorJN。2JF496543菌为主．采自CN、CE、JN和JM这4个污水处理I厂__1ComamonasdenitrificansAF2338761ooL—_JJM-13JF496561100lcidovoraxtemperansHQ25969l厂的活性污泥巾的细菌总数(以湿污泥计)分别为lCE．2JF496533——PseudochrobactrumsaccharotyticumAM180484‘3．8×10、4．2×10、6．3×10和1．5×10100．CE．6JF496536CFU·g～．4个污水处理厂的活性污泥中的细菌数l00ChryseobaeteriumindologenesAS517708量上的差异可能与各个污水处理厂所采用的处理工——MicrobacteriumketosireducensNRO24638l00．CN．6JF496526100r_1EnterococcusfaeciumEUOO3447艺和污泥泥龄不同有关．厂-1IJM一7JF496559l丽EnterococcusinusitatusAM0505642．2菌种鉴定J1【】【JIJ'N．6JF496545l厂_1BacillusmegateriumGQ870260来自于CN、CE、JN和JM污水处理厂的活性污lllcN一10JF496530口fcereusGQ148914～llIJN-7JF496546泥中分别分离到7、9、8和11株形态各异的细菌，83广——一CE-3JF49653462Ir1BacilluspumilusFJ999558共计35株．将测得的35株细菌的16SrDNA序列在IBacillUSsubtilisGQ305125捌LlCN-2JF496522NCBI核酸数据巾进行Blastn比对并构建系统发育—cE．7JF496537树．结果见图1．这35株细菌分属17个属，25个种，分支处数值为1000次抽样分析支持的百分值，菌株拉丁名后字其中革兰氏阳性菌11株，革兰氏阴性菌24株．活性符串为选取菌株的16SrDNA序列在GenBank数据库中的登录号；CE一11和JM-5这2个菌株只测得了600多碱基的rDNA序污泥中最常见的假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌列，未与其他菌株的1400多碱基的16SrDNA序列一起构建系统(Bacillus)、不动杆菌(Acinetobacter)、黄杆菌发育树；这2个菌株的16SrDNA序列比对结果分别与微杆菌(Flavobacteriaceae)、丛毛单胞菌(Comamonas)、气单M．ketosireducens和枯草芽孢杆菌B．subtilis的相似性达到98％胞菌(Aeromonas)和大肠埃希氏菌(Escherichia)等以上并且处于系统发育树的同一个分支上图14种活性污泥中的细菌16SrDNA系统发育树属的菌株均可从4个污水处理厂的活性污泥中分离Fig．1Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequencesof到；奈瑟氏菌(Neisseria)和肠球菌(Enterococcus)selectedstrainsinfouractive~ludge等医学病原菌也能分离到．JM的污泥中还分离到了气单胞菌属的嗜水气单胞菌(A．hydrophila)、点状江，污染长江下游水质以及对长江巾的鱼类生态和产气单胞菌(A．punctata)和维氏气单胞菌(4．养殖产生影响．veronii)以及气囊水柄菌(E．Aerosaccus)(图1)，嗜2．3活性污泥中细菌的多重耐药性分析水气单胞菌和气囊水栖菌是水产养殖业中常见的病对来自于4个污水处理厂的活性污泥中分离到原体．由于JM污水处理厂濒临长江，承担了南的35株细菌进行8种抗生素耐药性检测(表2)．结京市60％的城市污水处理量．其出水量大并且利用果表明4个污水处理厂的活性污泥中普遍存在耐药长江水体稀释自净能力进行深水排放‘．气单胞菌性．多重耐药统计结果如表3所示，除短小芽胞杆菌和气囊水栖菌有可能随污水处理后的出水进人长B．pumilusCE一3对所有测试抗生素敏感外，其他菌\n5期葛峰等：南京市4个污水处理厂的活性污泥中细菌的分离鉴定和抗生素耐药性分析1649表3菌株的多重耐药性统计结果35个菌株对8种抗生素的耐药率的统计结果Table3Muhiresistancestatisticalresultsofstrains见表4．对AMP、KAN、CHL、STR、GEN、TET、EM和SPE的耐药率分别为71．4、37．1、37．1、57．1、34．3、68．6、94．3和65．7．其中EM的耐药率高达94．3％．只有短小芽胞杆菌B．pumilusCE一3和中等食酸菌A．iremperansJM．13对EM没有耐药性．刘株均具有不同程度的抗生素耐药性，比例高达小云等报道取样于重庆市不同水环境中的耐热97．1％．具有多重耐药性(3个和3个以上)的菌株大肠杆菌对EM的耐药率高达99．1％；本次35株的比例达到了80％．甚至微杆菌M．ketosireducens分离菌对AMP的耐药率为71．4％，与刘小云报道CE．11、维氏气单胞菌A．veroniiJN．1和产吲哚金黄的重庆市不同水体分离菌的AMP耐药率为68％的杆菌C．indologenesJM一9对8种抗生素均具有耐结果基本一致．张新英等报道南宁市生活污水中药性．的大肠菌群对EM和AMP具有耐药性．上述3个不2．4分离菌对不同抗生素的耐药率分析同地区的细菌的耐药性检测结果表明，我国水环\n1650环境科学33卷CN77CE98JN88JM1110境中细菌的EM和AMP的耐药性已经非常严重．个菌株对AMP、STR和SPE均具有耐药性；每个菌TET、SPE和STR是畜牧和水产养殖业中广泛使用株的多重耐药的抗生素种类至少为5种，显示该菌的四环素类和氨基糖苷类抗生素，然而这3种抗生具有严重的多重耐药性．芽孢杆菌属中抗生素的耐素在活性污泥分离菌中的耐药率分别达到68．6％、药性主要是EM和SPE，7株菌中均有6株具有耐药65．7％和57．1％．性，但绝大多数耐药性为中介(I)水平．7株菌中只2．5不同细菌种类对抗生素的耐药率分析有两株蜡样芽孢杆菌(B．cereus)对AMP具有耐药35株细菌中，芽孢杆菌属有7株，气单胞菌属性(R)，其他5株均为敏感(S)；所有菌株对CHL、有5株．耐药性分析结果见表5．气单胞菌的所有5STR和GET均为敏感(S)表5气单胞菌和芽孢杆菌的耐药性分析Table5AntibioticresistanceanalysisofAeromonasandBacillus胞菌对STR、KAN、CHL和GEN等抗生素敏感，3讨论但本次分离的5株气单胞菌均对AMP、STR和EMCN、CE、JN和JM这4家污水处理厂的活性污具有耐药性，其中维氏气单胞菌A．veroniiJN一1对泥中的细菌总数分别为3．8×10、4．2×10、6．3×所有8种测试抗生素均具有耐药性；嗜水气单胞菌10和1．5×10CFU·g，结果表明4个污水处理厂JM．1菌株除对CHL敏感外，对其他7种抗生素均的活性污泥均为正常的成熟的污泥．同时从4个污具耐药性．水处理厂活性污泥中分别分离到7、9、8和11株形我国城镇污水处理厂排放出的污泥以每年态各异的细菌，共计35株．这35株细菌分属17个20％的速度递增，产生的污泥面临着巨大的处置压属，25个种，其中革兰氏阳性菌11株，革兰氏阴性力．污泥农用被认为是适合中国国情的污泥处置方菌24株，活性污泥中常用降解菌种均有检出．活性式之一¨．污泥农用前需进行厌氧、好氧消化或好污泥中分离菌株的耐药率达97．1％，多重耐药率达氧堆肥等稳定化处理，其中污泥堆肥是主要方法，通80％．对8种抗生素的耐药率最低的庆大霉素也达过高温以及微生物的拮抗作用来达到使病原菌快速到了34．3％，最高的红霉素的耐药率则达到了死亡的目标，但其中抗生素耐药性状况及迁移规94．3％．上述结果说明活性污泥中分离细菌菌株的律尚不清楚，需要开展更深入的研究．耐药性非常严重，其耐药基因库，将为进人水环境中4结论的致病菌或条件致病菌提供获得大量耐药基因的机会．国内外一些学者建议将抗生素耐药基因列入新(1)南京市4个主要污水处理厂的活性污泥中型环境污染物’．分离出17个属25个种共35株细菌，活性污泥中常气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体．嗜水用降解菌种均有检出，表明4家污水处理厂的活性气单胞菌是其模式菌株，是我国淡水养殖鱼类暴发污泥具有较好的生物降解能力．性传染病的主要病原菌¨．早期研究显示嗜水气单(2)活性污泥中分离出的菌株耐药性严重，耐\n5期葛峰等：南京市4个污水处理厂的活性污泥中细菌的分离鉴定和抗生素耐药性分析1651药率达97．1％，多重耐药率达80％，表明污水处理[J]．EnvironmentalScienceandTechnology，2006，40(23)：7445．7450．厂的污泥及出水存在潜在的生态风险和健康风险．[8]王瑞慧，宋永忠，任兰，等南京市污水处理厂污泥处理处建议加强对污水处理厂出水及污泥中抗生素耐药性置现状[Jj．环境监测管理与技术，2010，22(4)：4-6．及耐药基因的检测并评估其生态影响．[9]张强．南京江心洲污水处理厂污泥处置比较分析[j]．科技资讯，2009，(12)：141．参考文献：[10]陈同斌，郑国砥，高定，等．城市污泥堆肥处理及其产业化[1]ZhangYL，MarrsCF，SimonC，eta1．Wastewatertreatment发展中的几个关键问题[J]．中国给水排水，2009，25(9)：contributestoselectiveincreaseofantibioticresistanceamong10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