流式细胞仪在水处理中的应用现状与展望 5页

第30卷第18期中国给水排水V01．30No．182014年9月CHINAWATER＆WASTEWATERSep．2014流式细胞仪在水处理中的应用现状与展望文刚，王静怡，黄廷林，马军(1．西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西西安710055；2．哈尔滨工业大学市政与环境工程学院，黑龙江哈尔滨150090)摘要：流式细胞仪在医学领域已得到广泛应用，然而在水环境微生物的快速测定方面还处于发展阶段。介绍了流式细胞仪在水处理中的应用现状，并对未来发展进行了展望。目前，流式细胞仪主要用于水中细菌、病毒、特殊病原菌、藻细胞的快速测定以及微生物群落和生理状态的快速分析及其衍生的新方法，包括可同化有机碳、病原菌生长潜能、消毒效能的快速评价以及水处理过程中毒性变化的检测。流式细胞仪在水处理行业的使用将加深对水处理过程的认识。关键词：流式细胞仪；水环境微生物检测；消毒效能评价中图分类号：TU991文献标识码：B文章编号：1000—4602(2014)18—0058—05ApplicationofFlowCytometertoWaterTreatment：StatusandPerspectivesWENGang，WANGJing—yi，HUANGTing—lin，MAJun(1．SchoolofEnvironmentalandMunicipalEngineering，Xi’anUniversityofArchitectureandTechnology，Xi’an710055，China；2．SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering，HarbinInstituteofTechnology，Harbin150090，China)Abstract：Flowcytometeriswidelyusedinmedicaldomain，however，itisstillinthedevelop—mentstageforrapiddeterminationofaquaticmicrobes．Theapplicationstatusofflowcytometerinwatertreatmentwasintroduced，anditsfuturedevelopmentwasforecasted．Themainfunctionsofflowcytome-terareasfollowing：therapiddeterminationofbacteria，virus，specificpathogensandalgae，therapida-nalysisofmicrobialcommunitiesandtheirphysiologicalstatusaswellasthederivednewmethodsinclu．dingtherapidassessmentofassimilableorganiccarbon，pathogengrowthpotential，disinfectioneficiencyandthetestingoftoxicitychangeduringwatertreatment．Theapplicationofflowcytometertowatertreat-mentwouldstrengthentheunderstandingofwatertreatmentprocess．Keywords：flowcytometer；determinationofaquaticmicrobes；assessmentofdisinfectioneffi—ciency水处理过程常涉及微生物问题，微生物总量和24h)且实际水中存在大量具有活性但不能培养的活性的测定方法主要是平板计数法、显微镜观察和细菌，从而限制了其实用性。显微镜观察由于操作PCR定量。传统平板计数法由于所需时间长(大于繁琐且易因观察者的主观判断造成误差。PCR定基金项目：国家自然科学基金资助项目(51308438)；教育部博士点新教师资助项目(20136120120002)；陕西省教育厅重点实验室资助项目(13JS047)；陕西省教育厅专项基金资助项目(2013JK0883)·58·\n文刚，等：流式细胞仪在水处理中的应用现状与展望第30卷第18期量技术对特定微生物的定量和定性具有很好的效与水中非生物颗粒区分，从而快速(约10min)准确果，但在确定细菌总量和细菌活性方面需要时间长、地测定出水中细菌的数量。该方法测定水中细菌的耗费高，另外该方法对模板DNA的质量要求较高。检测范围为(1X10～2×10)cells／mL，当浓度超流式细胞仪(FCM)是20世纪60年代由Parker和过该范围时需要进行稀释。Hammes等采用该方Hutcheon发明用来计数血细胞的装置，逐渐被应用法对瑞士饮用水进行了调查，揭示了常规饮用水处到微生物的测定。理工艺对细菌的去除规律，出厂水细菌浓度约为91流式细胞仪的基本原理X10cells／mL。Siebel等对比了常规平板计数法流式细胞仪是一种将待测颗粒(细菌或者哺乳与流式细胞仪的相关性，发现平板法的测定结果比动物细胞)维持在液流状态，然后依次单个通过激流式细胞仪检测结果低约2个数量级且不存在任何发光源(如488nm)。待测颗粒由于自身的荧光特相关性。水中多数微生物不能用传统平板法培养，性或通过与染料物质相结合，在激光作用下显示出Siebel等发现自来水中的微生物仅有0．001％～荧光特性和散射光特性(前散射光和侧散射光)，从2％的细菌可以通过平板进行培养，所以平板计数法而与非生物颗粒区分。图1为流式细胞仪的基本工并不科学。传统平板计数至少需要24h，而流式细作原理及典型的实验结果。散射光主要提供细胞的胞仪计数仅需要10rain。所以，推荐该方法作为饮物理特性(如颗粒尺寸)，荧光特性提供生物特异性用水厂微生物指标的测定方法。质。流式细胞仪技术的关键在于维持单个细胞依次2．2水中病毒颗粒的快速计数通过激发光源，能分析出某个群落中单个细胞的性水中病毒颗粒数为(1×10～1×10)-'~／mL，质，对群落的分析更加具体和个性化。待检测的细是水中细菌数量的10～100倍。对病毒颗粒的快速胞可以依靠自身的荧光特性进行测定(如叶绿素)，检测将会进一步提高净水工艺的安全性。Brus—也可以通过外加荧光物质的特异性与细胞结合达到saard_6使用流式细胞仪测定了水中的病毒颗粒，主检测的目的。实验结果以单参数的柱状图或双参数要测试过程为水样先用0．5％的戊二醛固定15～3O的散点图来表示(见图1)。流式细胞仪可快速分析min，然后在低温液氮下冷冻，并溶解到pH值为8．0水样的细菌总数J、细胞尺寸大小及表征细胞的的Tris—EDTA溶液中，再用SYBRGreenI进行染生理特性(如细菌的活性和DNA含量等)。色，最后用流式细胞仪测定。通过研究发现，饮用水．'Gt-处理工艺对病毒的去除效果较好，混凝和岸滤对病毒颗粒的去除率分别为58％～81％和44％～69％。Brussaard等对比了流式细胞仪和荧光显微镜定量测定水中的病毒数量，发现这两种方法没有明显的区别，认为流式细胞仪定量检测是一种可靠、重现激光488性好的快速计数水中病毒颗粒的方法。胞内结合2．3水中特殊细菌的快速测定一些病原菌会导致严重的水质安全问题，传统方法检测时间长且检测手段不够灵敏，因此对这一二维参数点图类特殊细菌的快速检测具有极其重要的意义。Ftichslin等l8采用免疫磁珠分离和荧光标记并结合图1流式细胞仪基本原理流式细胞仪的方法成功检测了Legionella，该方法将Fig．1Basicpnncipleofflowc~ometer原来需要10d完成的检测缩短到3h内完成。Vital2流式细胞仪在水处理中的应用等和Keserue等。。使用同样的方法分别成功地2．1水中细菌总数的快速测定检测了水中的Vibriocholerae、Escherichiacoli0157流式细胞仪在水处理中最普通应用就是快速测和Giardialambliacysts。定水中的细菌总数。通过染料(SYBRGreenI，2．4水中藻细胞的快速定量与区分SYTO一9或DAPI)与细菌DNA特异性结合，便可以藻类细胞本身含有叶绿素和藻红蛋白等自发荧·59·\n第30卷第18期中国给水排水光物质，不需染色便可直接采用流式细胞仪进行测通过流式细胞仪能够清楚地区别开来。通过一些特定。对于尺寸<2m的藻细胞均可采用流式细胞异的染色方式，还可以区分细菌的活性¨J，如细仪进行很好的检测。Franklin等使用流式细胞仪胞膜完整性(PI)、膜电位变化[DiBAC(3)]、细胞同时检测了3种海水藻类(Micromonaspusilla、Phae—膜外排泵活性(EB)、细菌的呼吸活性(CTC)和细胞odactylumtricornutum和Heterocapsaniei)和3种淡水膜酯酶活性(CFDA)。如在细菌消毒时，可以利用藻类(Microcystisaeruginosa，Pseudokirchneriellasub—不同染料确定细菌灭活的程度和损伤部位，常用的capitata和Trachelomonassp．)。该过程主要是通过评价细菌活性的染料见表1。藻细胞尺寸不同(散射光)和藻类具有不同的自发表1评价细菌活性的染料荧光物质(藻红蛋白和叶绿素)来检测和区分。Tab．1ListofstainsforbacterialviabiHtyassessment2．5水中微生物活性的快速表征，项目功能机理采用PI测定氯消毒前后的细胞膜完整性，结果碘化丙啶(PI)膜完整性仅能穿过细胞膜不完整细胞如图2所示。可以清楚地看到消毒后一部分细菌向羧基荧光素酯酶活性活细胞酯酶水解FL3荧光信号增加的位置进行转移，这是由于细菌二醋酸(CFDA)CFDA形成绿色荧光的细胞膜受到损伤后PI能够穿过细胞膜与胞内双(1，3一二巴比妥酸)一三次甲基氧烯洛尔膜电位仅能进入去极化DNA结合产生红色荧光。[DiBAC(3)]细胞膜与蛋白结合溴化乙锭(EB)外排泵活性仅能进入无此活性细胞与DNA结合5一氰基一2，3一二一(P一苄基一四唑氯化呼吸活性活细胞还原CTC形物)(CTC)成绿色荧光结晶2．6微生物群落结构的表征除对单个细胞分析外，流式细胞仪还能表征整个微生物群落。微生物群落的结构特性是所有单个细胞特性的组合。deRoy等利用流式细胞仪首次分析了微生物群落的结构特性。该研究首先利用流式细胞仪检测整个群落的流式细胞图谱，然后通过模型来计算群落的变化和特性。该方法能够准确地反映群落结构随环境因子的变化情况。此外，流式细胞仪对水中具有不同物理特性的细菌有很好的区分能力，特别是细胞大小。用SYBRGreenI染色，基于细胞不同的荧光特性(FL1)和侧散射光(SSC)可以将水中的细菌分成两大类：高核酸含量细菌(HNA)和低核酸含量细菌(LNA)。通常认为HNA是水中具有活性的微生物种群，而LNA的作用还不是太清楚。因为天然水体营养贫乏，LNA比图2典型的细菌膜完整性流式细胞仪图Fig．2Picturesofflowcytometerformembraneintegrity例高达50％～80％。before／afterchlorination3基于流式细胞仪的新方法开发与应用流式细胞仪结合不同的染色方法可对细胞的3．1水中AOC的快速测定各种状态和特性进行表征，包括细胞尺寸、活性及细可同化有机碳是表征饮用水稳定性的一个重要菌DNA含量。Wang等¨研究发现自然水体存在指标，传统方法采用P和NOX这两种细菌来利用不同尺寸和DNA含量的细菌群落，在自然环境中有水中的有机物，当达到稳定期后采用平板法测定生约50％的细菌能够穿过0．45m的滤膜，这些细菌长的微生物¨。这种方法耗时(1～2周)耗力，并·60·\n文刚，等：流式细胞仪在水处理中的应用现状与展望第30卷第18期且这两种细菌对底物具有很强的选择性，转换系数NBDG)、总ATP浓度和可培养性(平板法)，发现不受环境条件和操作条件影响很大。Hammes等_l开同功能的失活其要求的强度不同。Arku等使用发了一种新方法(操作流程见图3)，该方法采用天相同方法研究了热处理下的微生物灭活过程，Wei然细菌作为接种液培养至稳定期后用流式细胞仪测等用该方法研究了电灭菌过程。将流式细胞仪定微生物生长量，然后采用统一的转换系数(1×10与传统培养法相结合将是消毒研究的一种趋势。cells／~gAOC)计算AOC含量。该方法易操作，耗3．4水处理过程中毒性变化的检测时短(3d)，不需要特殊的细菌，相对传统方法具有水体的毒性评价也可运用流式细胞仪来进行。明显的优势。Czechowskal21．采用流式细胞仪结合PI和EB染色技术，研究了水中常见低浓度污染物对细菌生长抑制和细胞膜的损伤。实验采用Pseudomonasfluores—celtsSV3作为测试微生物，暴露在含萘溶液中，采用国目一一吉目一卤圄一一PI研究膜损伤和细菌增殖过程。当添加萘后，细菌生长速率常数降低，主要是因为受损细胞数量增加过滤除菌细胞AOC消耗蛩和未受损细胞增殖缓慢造成的。这为评价水处理过程形成的中间副产物的急性毒性提供了新方法。图3可同化有机碳(A0C)的快速测定Ziglio等还应用流式细胞仪评价了活性污泥中微Fig．3DiagramofAOCrapiddetermination生物的存活状态，开发了一种新的污水毒性测试方3．2水中病原菌生长潜能的测定法，该方法先将污泥分散，然后采用SYBRGreenI与AOC测定原理类似，vital等开发了水中和PI结合表征活性污泥的微生物膜完整性，采用病原菌生长潜能(PGP)的测定方法。该方法采用三FDA和BCECF—AM表征微生物的酶活性变化。种代表性病原菌Eseherichiacoli0157、Vibriocholera4展望El—Tor和Pseudomonasaeruginosa为接种液，通过实流式细胞仪在水处理中已经得到一定程度的应验室培养至稳定期后用流式细胞仪测定病原菌的数用和研究。作为一种新兴的研究技术，在线流式细量来评价水体的病原菌生长潜能。该研究调查了实胞仪的开发方面还有很大的研究空间，其将自动采际水处理工艺过程中PGP的变化。研究发现Vibrio集水样进行分析，降低操作强度。另外，短期条件变choleraEl。Tor仅在源水中生长，Escherichiacoli0157化引起的群落变化有望通过流式细胞仪来快速检仅在臭氧处理水中生长，而Pseudomonasaeruginosa测。此外，流式细胞仪作为高效消毒方法的筛选和在所有的水中均生长_1。慢滤处理后PGP大幅度评价也是今后研究的重点内容；各种病原菌的特异降低且保持在很低水平，PGP变化与DOC的变化没性检测还有待进一步研究。目前，流式细胞仪在污有直接联系，与AOC的变化有一定的关系。PGP不水中的应用和开发还相对较少，具有很大的研究和仅与AOC浓度有关还与AOC的组成有关。PGP相发展空间。对AOC能更加直接地预测水体的生物风险。3。3消毒效能的快速评价参考文献：消毒效能的评价常使用平板培养法，但是微生[1]HammesF，BemeyM，WangY，eta1．Flow—cytometric物灭活过程可能存在介于细菌死亡和存活的中间状totalbacterialcellcountsasadescriptivemicrobiological态，在这种状态下微生物是不可以培养的但一段时parameterfordrinkingwatertreatmentprocesses[J]．WaterRes，2008，42(1／2)：269—277．间后微生物会通过修复而复活。流式细胞仪结合多[2]FelipM，AndreattaS，SommarugaR，eta1．Suitabilityof种染色方法可以快速直接地判别微生物的存活状flowcytometryforestimatingbacterialbiovolumeinnatu—态。BerneylJ应用这种方法研究了太阳光消毒过ralplanktonsamples：comparisonwithmicroscopydata程微生物状态的变化，共监测了细菌6种不同功能[J]．ApplEnvironMicrobiol，2007，73(14)：4508—的变化，包括外排泵出活性(EB)、膜电位变化[Di．4514．BAC(3)]、膜完整性(PI)、葡萄糖吸收活性(2～[3]WangY，HammesF，BoonN，eta1．Isolationandeharac-·61·\n第3O卷第18期中国给水排水www．watergasheat．cornterizationoflownucleicacid(LNA)．contentbacteria2012，46(3)：907—919．[J]．ISMEJ，2009，3(8)：889—902．[16]刘文君，王亚娟，张丽萍．饮用水中可同化有机碳[4]HammesF，BergerC，Koster0，eta1．Assessingbiologi—(AOC)的测定方法研究[J]．给水排水，2000，26coOstabilityofdrinkingwaterwithoutdisinfeetantresidu(11)：1—5．alsinafull—scalewatersupplysystem[J]．JWaterSup—[17]HammesFA，EgliT．Newmethodforassimilableorgan—ply，2010，59(1)：31—40．iccarbondeterminationusingflow．cytometricenumera．．[5]SiebelE，WangY，EgliT，eta1．Correlationsbetweento—tionandanaturalmicrobialconsortiumasinoculumstocellconcentration，totaladenosinetri—phosphatecon—[J]．EnvironSciTechnol，2005，39(9)：3289—3294．centrationandheterotrophicplatecountsduringmicrobi—[18]VitalM，StuckiD，EgliT，eta1．Evaluatingthegrowthalmonitoringofdrinkingwater[J]．DrinkingWaterEngpotentialofpathogenicbacteriainwater[J]．ApplEnvi—Sci，2008，(1)：1—6．ronMicrobio1．2010．76(19)：6477—6484．[6]BrussaardC．Optimizationofproceduresforcountingvi—[19]ArkuB，FanningS，JordanK．Flowcytometrytoassessrtlsbyflowcytometry[J]．ApplEnvironMicrobiol，biochemicalpathwaysinheat—stressedCronobacterspp．2O04，70(3)：1506—1513．[J]．JApplMicrobiol，2011，1l1(3)：616—624．[7]BrussaardC，PayerJ，WinterC，eta1．Quantificationof[20]WeiV．ElektorowiczM．OleszkiewiczJA．Influenceofaquaticvirusesbyflowcytometry[J]．ManualofAquaticelectriccurrentonbacterialviabilityinwastewatertreat—ViralEcology，2010，(2004)：102—109．ment[J]．WaterRes，2011，45(16)：5058—5062．[8]FiichslinHP，KOtzschS，KeserueHA，eta1．Rapidand[21]CzechowskaK．vanderMeerJR．AfloweytometryquantitativedetectionofLegionellapneumophilaapplyingbasedoligotrophicpollutantexposuretesttodetectbacte—immunomagneticseparationandflowcytometry[J]．Cy—riogrowthinhibitionandcellinjurylJ]．EnvironSeitometryPartA，2010，77A(3)：264—274．Technol，2011，45(13)：5820—5827．[9]VitalM，HammesF，EgliT．Escherichiacoli0157call[22]CzechowskaK．vanderMeerJR．ReversibleandilTe—growinnaturalfreshwateratlowcarbonconcentrationsversiblepollutant—inducedbacterialcellularstresseffects[J]．EnvironMicrobiol，2008，10(9)：2387—2396．measuredbyethidiumbromideuptakeandefflux[J][10]KeserueHA，FuchslinHP，EgliT．RapiddetectionandEnvironSciTechnol，2012，46(2)：1201—1208．enumerationofgiardialambliacystsinwatersamplesby[23]ZiglioG，AndreottolaG，BarbestiS，eta1．Assessmentofimmunomagneticseparationandflowcytometricanalysisactivatedsludgeviabilitywithflowcytometry[J]．Water[J]．ApplEnvironMicrobiol，2011，77(15)：5420—Res，2002，36(2)：460—468．5427．FranklinNM，StauberJL，LiraRP．Developmentofmuhispeciesalgalbioassaysusingflowcytometry[J]．EnvironToxicolChem，2004，23(6)：1452—1462．[12]WangY，HammesF，BoonN，eta1．Quantificationofthefilterabilityoffreshwaterbacteriathrough0．45，0．22，and0．1Ixmporesizefiltersandshape—dependenten—riehmentoffilterablebacterialcommunitiesJ]．EnvironSciTechnol，2007，41(20)：7080—7086．[13]BerneyM．Flow—cytometricstudyofvitalcellularfunc—tionsinEscherichiacoliduringsolardisinfection(SO—DIS)[J]．Microbiology，2006，152(6)：1719—1729．[14]BerneyM，VitalM，HtilshofI，eta1．Rapid，cuhivation—作者简介：文刚(1983一)，男，四川南充人，博independentassessmentofmicrobialviabilityindrinking士，讲师，主要研究方向为饮用水生物稳water[J]．WaterRes，2008，42(14)：4010—4018．定性和高级氧化技术。[15]deRoyK，ClementL，ThasO，eta1．FlowcytometryforE—mail：hitwengang@163．coinfastmicrobialcommunityfingerprinting[J]．WaterRes，收稿日期：2014—01—23·62·