干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响 6页

云南农业大学学报JournalofYunnanAgricuhuralUniversity．2014http：／／xb．ynau．edu．anISSN1004—390X；CODENYNDXAXE—mail：xb@ynau．edu．cnDOI：10．3969／j．issn．1004—390X(n)．2014．01．008干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响术宋丽梅，代微然，任健，马向丽，欧阳青，毕玉芬(云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201)摘要：以栽培型和野生型百脉根(Lotuscorniculatusl|．)为试验材料，对干旱胁迫4，8，12，16d和复水处理下4，8d百脉根的部分生理生化指标的变化进行了研究。结果表明：随着干旱胁迫时间的延长，叶片相对含水量逐渐下降，叶绿素含量、MDA含量、SOD活性和POD活性呈先升高后降低的变化趋势。复水后，各指标得到了不同程度的恢复，但POD的活性明显仍低于对照(P<0．05)；从MDA含量变化来看，复水后细胞膜受到的伤害仍然没有修复。于旱胁迫处理下，栽培型和野生型材料的生理生化变化具有一定的差异性，说明来自湿润环境中的野生百脉根的耐旱性相对较差。关键词：百脉根；干旱胁迫；复水；抗氧化酶系统中图分类号：S541．603．4文献标志码：A文章编号：1004—390X(2014)叭一0037—06EffectofProgressiveDroughtandSubsequentWaterRecoveryonMDAAccumulationandAnti-oxidantEnzymeActivityinLeavesofBirdsfootTrefoilSONGLimei，DAIWeiran，RENdian，MAXiangli，OUYANGQing，BIYufen(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniwersity，Kunming650201，China)Abstract：Inourstudy，twopopulationofLotuscorniculatusL．wereselectedasexperimentalmateri—alinordertostudyphysiologicalresponseofplantssubjectedto4，8，12，16ddroughtstressandsubsequent4d，8dre—wateringtreatments．Resultsindicatedthatleafrelativewatercontent(RWC)decreasedwiththeprogressionofdroughtwhereasthechlorophyllcontent，ma10ndialdehydecontent(MDA)，aswellasactivitiesofsuperoxidedismutase(SOD)andperoxidase(POD)increasedfirstlyandthendeclined．Afterre—wateringtreatments，mostparameterswererecoveredincertaindegree，however，PODactivitiesweresignificantlylowerthanthecontrolandcellmembranedamagedwasnotreducedassessedbytheMDAaccumulation．Differenceswerealsoobservedbetweentwopopulationswhensubjectedtodroughtstress．Basedonthesedifferences，itisconcludedthatthewild—typedpopu—lation，whichadaptedtowetenvironment，showedalowertolerancetodrought．Keywords：LotuscorniculatusL．；droughtstress；re—watering；antioxidantenzymesystem收稿日期：2013—07—07修回日期：2013—08—14网络出版时间：2014一叭一O710：l7基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目子课题(2011BAD17B02)；国家自然科学基金项目(31260167)。作者简介：≠}对本文贡献同等，为并列第一作者。宋丽梅(1988一)，女，山东潍坊人，在读硕士研究生，主要从事牧草种质资源的研究。E—mail：songlimei2007@163．corn；代微然(1974一)，女，四川乐山人，实验师，主要从事牧草种质资源的研究。E—mail：yau—iced@sohn．corn通信作者Correspondingauthor：任健(1971～)，男，四川乐山人，博士，副教授，主要从事草地生态的研究。E—mail：renjian@ynau．edu．cn网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detaiL／53．1044．S．20140107．1017．008．html\n38云南农业大学学报第29卷在众多的非生物因子中，干旱是影响植物生1．2试验设计长的最主要的因子之一_1J。据统计，在全世界干试验地点位于云南农业大学草业科学系实习旱缺水引起的农业和社会损失相当于其他各种自基地，2012年5月将种子直播到塑料盆(直径然灾害造成损失的总和。世界干旱和半干旱地40cm，高30cm)中，播种前对种子进行擦皮处区面积占地球陆地面积的1／3，在我国则占到国理，土壤类型为红壤，肥力中等，pH6．6，每盆土面积的52．5％，其中，干旱地区为30．5％，半播种量为100粒。出苗后适时浇水，采用人工拔干旱地区为22．0％t3J。我国又是水资源相对贫乏草，不施肥。2013年5月开始干旱胁迫，试验在的国家，人均水资源占有率不足，是世界平均水塑料大棚中开展大棚中平均温度16～28％，相对平的1／4，居世界109位。在全球气候变化下，湿度为65％～75％。干旱胁迫开始时，盆中土壤干旱发生的频率不断增加，因此，干旱对植物的含水量保持在田问持水量的80％。干旱胁迫持续影响一直是人们关注的焦点。16d，在0，4，8，12，16d进行土壤含水量的动百脉根(LotuscorniculatusL．)为豆科百脉根态变化及植株成熟叶片的相关生理指标的测定，属多年生牧草，又名牛角花、五叶草，原产于欧其中，0d设为对照，每个处理重复3次。干旱胁亚温暖地区，在我国中西部及世界各地广泛分迫16d后，进行第1次复水，将土壤含水量均恢布j，在云南的一些天然草地、草山草坡均有分复至对照水平，过4d再复水1次，在复水后的布J。百脉根具有营养价值较高、适口性较好、第4，8天分别测定相关指标。取样时，选取相同再生能力强、耐牧的特点；在草地上，与白三叶、部位完全成熟的叶片。苜蓿竞争J，可以通过青贮、刈割及放牧加以利1．3测定指标及方法用，是牛、马、兔等家畜的优良牧草。目前，国1．3．1土壤含水量的测定内外已在百脉根遗传多样性J、生态学特性Ⅲ9等采用烘干法测量，参照王纪华等¨的方法。方面展开了一定的研究，对于百脉根抗旱性方面1．3．2叶片相对含水量(RWC)的测定的研究主要集中在百脉根种子萌发阶段¨。。或幼苗采用称重法，参照王纪华等的方法。阶段¨，而百脉根成熟植株在干旱胁迫下及恢复1．3．3叶绿素含量的测定水分后的生理生化变化研究甚少。为此，本实验采用N，N一二甲基甲酰胺浸提，参照INS—选取栽培型的百脉根，品种为“帝国”和云南野KEEP和BLOOM¨的方法。生型百脉根，研究干旱胁迫和复水后土壤含水量、1．3．4丙二醛(MDA)含量的测定叶片相对含水量(RWC)、叶绿素(Ch1)含量、参照《植物生理生化试验原理和技术》进行丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)丙二醛含量的测定¨。和过氧化物酶(POD)等指标的变化情况，了解1．3．5超氧化物歧化酶(SOD)活性测定百脉根在干旱胁迫下的生理生化特征，及复水后参照《植物生理学研究技术》测定超氧化物百脉根的生理生化特性的恢复情况，探讨百脉根歧化酶活性¨。耐旱机制，为百脉根耐旱品种的选择提供一定的1．3．6过氧化物酶活性(POD)的测定理论依据。参照《植物生理学研究技术》测定过氧化物酶活性¨。1材料与方法1．3．7数据分析1．1材料试验数据用Excel2003，SPSS13．0软件分析供试野生型百脉根种子于2011年10月采自处理，采用单因素方差分析和Duncan多重比较。云南省香格里拉县亚高山草甸，海拔为3200m，2结果与分析地理位置为北纬27。20，东经99。36，年平均气温5．8~C，年均降雨量849．8mm，无霜期120d，2．1干旱胁迫及复水处理下百脉根根际土壤相对属高原寒温带湿润性气候。供试栽培型种子由云含水量的变化南绿盛公司提供。干旱胁迫处理下，百脉根根际含水量明显低\n第i期宋丽梅，等：干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响39于对照。随着干旱胁迫的持续，野生型百脉根及表1叶片相对含水量和两二醛在干旱胁迫及复水处理下的变化栽培型百脉根根际土壤含水量均呈现出明显的下Tab．1VariationofleafrelativewatercontentandMDAcontent降趋势。其中栽培型百脉根土壤含水量下降较快，exposedtodroughtstressandsubsequentrecovery在胁迫16d时下降到了21．6％，与对照相比差异显著(P<0．05)。第16天上午进行复水后，不同的百脉根种植土壤含水量逐渐恢复至胁迫前水平(图1)。DO9&58±1．65a96．32土1．51a272±n33d366±n40b0七野生型wild—type13497．03±3．67a91．344-1．88ab2．17±0．23d2514-0．49C80D894．07±4．03a87．97±3．92b3．74±n51cd3．61±0．26bc重60D1266．83±2．35b77．34±4．11c14．984-n75a8．82±0．24a谪|40Dl663．98±5．58b58．36±2．64d8．30±0．97b9．50±n65a扣R495．19±1．39a92．99±2．31ab5．334-O4Oc5．54土n24b耋20R894．70±2．29a97．504-l，53a5．36±0．19c4864-0．47beOD0D4D9D12D16R4R8注：同列中不同小写字母表示差异性显著水平为JP处理treatment<0．05。注：DO，D4，D8，D12，D16分别为对照干早胁迫0，4，8，12，Note：Thedatumwiththedifferentsmalllettersshowsignif-16d；R4，R8分别为复水4，8d；下同。Note：DO，D4，D8，D12，D16weredroughtstress4，8，12，16d；icantdifference(P<0．05)inthesalTlecolumn．for0．R4andR8werere．wateringfor4．8d：thesameasbelow．图1土壤含水量干旱胁迫及复水处理下的变化2．3干旱胁迫及复水处理对百脉根叶绿素的影响Fig．1Thechangesofsoilwatercontentunderdroughtstressandrewatering随着干旱胁迫的加剧，野生型和栽培型百脉根的叶绿素含量均呈下降、上升、再下降的趋势。2．2干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片含水量和其中，野生百脉根在胁迫8d后，叶绿素含量达丙二醛的影Ⅱ向到峰值，显著高于对照(P<0．05)，是对照的野生百脉根和栽培百脉根对照的叶片相对含1．47倍；随后，逐渐降低，到16d达到最低。复水量分别为98．58％，96．32％，随着干旱胁迫程水后，叶绿素含量上升，不过仍然显著低于对照度的加剧，百脉根叶片相对含水量呈下降趋势组(P<0．05)；栽培型百脉根在胁迫8d后，与(表1)。其中，野生百脉根RWC在胁迫前8d下对照相比，叶绿素含量显著升高(P<0．05)，在降幅度较小，在胁迫12d后RWC为66．83％，与12d后达到峰值，然后开始下降。复水4d后，对照相比显著降低(P<0．05)；栽培百脉根叶绿素含量仍然低于对照(P<0．05)；第二次复RWC在胁迫第8天后，RWC为87．97％，与对照水后，叶绿素含量开始上升，不过显著低于对照相比，达到显著水平(P<0．05)，胁迫第l6天(图2)。降至58．36％。经过两次复水后，RWC均有较大程度的恢复。试验期间，随着干旱胁迫时间的延长，叶重§6片中MDA含量先上升后下降的趋势。在胁迫前8d，MDA含量上升幅度不大；而8d后，MDA谪乏如2含量上升明显，其中野生型在干旱胁迫第12天毫出现峰值，是对照的5．51倍；而栽培型MDA0积累速度较为平缓，在第16天出现峰值。复水D0D4D8D12D16R4R8后，叶片中MDA含量均大幅下降，栽培型恢复处理treatment到对照水平，野生型处理仍显著高于对照(P<图2叶绿素在干旱胁迫及复水处理下的变化Fig．2Thechangesofchlorophyllcontent0．05)(表1)。underdroughtstreeandrewatering\n云南农业大学学报第29卷2．4干旱胁迫及复水处理对百脉根抗氧化酶的影响^II．暑．jv＼烬2．4．1超氧化物歧化酶(SOD)活性五IA0∞00∞i鲁随着干旱时间的延长，无论是栽培型，还是基野生型百脉根SOD活性均呈先升高后降低的趋忧龆势，不过二者存在一定的区别。干旱胁迫12d后，栽培型的SOD活性达到峰值，与对照相比存在显著差异(P<0．05)，随DOD4D8D12D16R4R8后，SOD活性不断下降。相比而言，野生型百脉处理treatment根在胁迫前12d，SOD活性变化较为平缓，与对图4过氧化物酶活性在干旱胁迫及复水处理下的变化Fig．4ThechangesofPODactivityunder照相比，差异性不显著(P>0．05)，在胁迫的第droughtstreeandrewatering16d达到峰值，显著高于对照组(P<0．05)。第一次复水后，随着复水时问的延长，百脉根处理3讨论组SOD活性均逐渐下降，复水8d后，其与对照组差异性不显著(P>0．05)(图3)。3．1干旱胁迫及复水对土壤含水量及叶片含水量的影响2500植物的抗旱性与体内的水分状况密切相关，2000叶片相对含水量(RWC)能较好地反应植物的水分状况，而植物叶片内的含水量与植物根际含水l500O∞O如O∞O如OOmO量紧密相关。在本实验中，随着胁迫时间的延长，l000百脉根根际含水量及叶片相对含水量均呈下降趋势；经过复水处理后，均恢复至对照水平，这表500明，在干旱胁迫条件下，百脉根植物体内水分亏O缺严重，对土壤水分的消耗量增加，导致土壤含DOD4D8D12D16R4R8水量的降低。处理treatment图3超氧化物歧化酶活性在干旱胁迫及3．2干旱胁迫及复水对叶绿素含量的影响复水处理下的变化叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，干Fig．3ThechangesofSODactivityunderdroughtstreeandrewatering旱胁迫对植物叶绿素的含量有着明显的影响，不过研究结果不尽相同。M)~KELA等¨在研究中，2．4．2过氧化物酶(POD)活性发现干旱胁迫使番茄(Solanumlycopersicum)体试验中，随着干旱胁迫的加剧，百脉根内的叶绿素含量升高，相反，NAYYAR等Ⅲj、POD活性呈先上升，再下降的趋势。在胁迫前HERBINGERl181等则认为干旱胁迫降低了植物的12d，POD活性变化幅度不大，而胁迫12d后，叶绿素含量。本实验结果表明，在干旱胁迫下，处理组POD活性明显上升，均在第l6天达到峰百脉根叶绿素含量主要呈上升、下降的趋势，在值，在栽培型中，处理是对照的3．78倍，比对小麦(Triticumaestivum)和云杉(Piceamort—照增加277．8％，而野生型是对照的3．13倍，golica)。。幼苗上均有类似的发现。我们分析原因比对照增加213．0％，差异性均达到显著水平可能是，干旱严重抑制了叶片的延伸生长，不过(P<0．05)，不过，二者相比存在显著差异，栽由于叶片内部的保护作用，叶绿素的合成受到的培型POD活性显著高于野生型。复水后，无论影响较小，使得叶绿素的绝对含量并未减少，加栽培型，还是野生型百脉根的变化趋势一一致，之叶片的含水量降低，从而产生了类似“浓缩”在第4d处理组POD活性基本恢复至对照水平，的现象，导致叶绿素浓度增加。经过复水，叶绿复水8d后，POD含量均显著低于对照组(P<素含量得到了恢复，表明干旱胁迫并未破坏植物0．05)(图4)。体内叶绿素的合成机制，植物可以通过自身的修\n第1期宋丽梅，等：干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响41复机制恢复至正常水平。料的适应性有一定的关系。野生型百脉根采自云3．3干旱胁迫及复水对叶片丙二醛(MDA)含南西北部的亚高山草甸，当地年均降雨量量的影响849．8mm，百脉根长期生长在相对湿润的环境丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化的产物之中，所以对干旱的适应较差。对于干旱胁迫对百一，MDA含量的高低在一定程度上能反应脂膜过脉根的生长等生理过程是否存在滞后效应，以及氧化作用水平和膜结构的受害程度。试验结果滞后效应等问题还需要进一步的研究。显示，MDA含量随着干旱时间的延长逐渐升高。4结论在胁迫初期，MDA含量上升缓慢，处理8d后，MDA含量上升加剧，其中野生型上升的幅度较在干旱胁迫处理后，百脉根的根际土壤含水大。这表明，随着干旱程度的加剧，膜脂过氧化量、叶片相对含水量、叶绿素含量、抗氧化酶及反应持续加重，细胞原生质膜破坏程度增加，在膜脂过氧化指标的动态变化都表明了干旱胁迫对第12天时，野生百脉根的含量显著高于栽培型，百脉根的生理生化具有明显的影响，且随着干旱且栽培型MDA的含量高峰出现的晚，说明野生时问的延长，叶绿素含量、抗氧化酶及膜脂过氧型百脉根质膜受到的破坏程度较大，且出现的早。化的变化趋势不尽相同。经过复水处理后，各指复水后，MDA含量下降，表明膜脂过氧化反应减标得到了一定程度的恢复。从干旱胁迫和复水处轻，但其并未恢复至对照水平，可见干旱胁迫已理过程中百脉根的生理生化变化情况来看，长期经对百脉根造成了一定程度的伤害。生长在湿润环境中的百脉根具有的耐旱性较差。3．4干旱胁迫及复水对百脉根叶片抗氧化酶的[参考文献]影响超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶[1]BAILP，SUIFG，GEDT，eta1．Effectofsoildrought(POD)是植物细胞抵御活性氧伤害的重要保护stressonleafwaterstatus，membranepermeabilityand酶。当植物处于干旱条件下时，植物会通过提高enzymaticantioxidantsystemofmaizeJ．Pedosphere，抗氧化酶的活性来适应干旱环境。SOD的作用2006，16(3)：326—332．[2]高峰，许建中．我国农业水资源状况与水价理论分主要是减少氧化力强的OH一的生长，清除0，析[J]．灌溉排水学报，2003，22(6)：27—32．形成H0，再由CAT和POD进一步将转化为[3]罗志成．北方旱地农业研究的进展与思考[J]．干H0，通过协调一致，使活性氧维持在一个较低旱地区农业研究，1994，12(1)：4—13．水平_2。本试验结果显示，随着干旱程度的加[4]康绍忠．新的农业科技革命与21世纪我国节水农业剧，干旱处理的SOD活性，POD活性均呈上升趋的发展[J]．干旱地区农业研究，1998，16(1)：势，在处理前8d，SOD活性、POD活性上升缓14—20．慢。试验过程中，发现栽培型的SOD活性、POD[5]王栋，任继周．牧草学各论[M]．南京：江苏科学活性上升幅度均高于野生型，这表明栽培型百脉技术出版社，1989：230—231．根的活性氧清除系统对干旱胁迫表现出更灵敏和[6]徐桂芬，崔茂盛，匡崇义，等．云南野生优良豆科更强的适应性。随着复水过程的延续，百脉根干牧草百脉根的开发利用[J]．牧草与饲料，2012，6旱处理组叶片内的SOD活性逐渐下降，表明因活(1)：10—11．[7]NIKOLI(~R，MITI~N，MILETI~R，eta1．Efectsofcy—性氧引起的膜脂过氧化和氧化还原平衡紊乱得到tokininsoninvitroseedgerminationandearlyseedling了修复，不过高于对照组，可能是由于修复时间morphogenesisinLotuscorniculatusL．[J]．Journalof过短，没有达到完全修复；复水处理后POD含量PlantGrowthRegulation，2006，25(3)：187—194．则低于对照。[8]孙艳香，杨红梅，耿云红，等．根癌农杆菌介导的综上所述，在于旱胁迫处理下，栽培型和野百脉根遗传转化体系的优化研究[J]．南开大学学生型材料问表现出较大的差异，其中栽培型百脉报：自然科学版，2006，39(2)：51—57．根积累的MDA较少，细胞膜受到的伤害较轻，【9STEINERJJ，GARCIADELOSSANTOSG．Adaptive且SOD和POD活性高，在一定程度反映出栽培ecologyofLotuscorniculatusL．genotypes[J]．CropSci—型的耐旱性强于野生型，这种差异可能与试验材ence，2000，41(2)：552—563．\n42云南农业大学学报第29卷[10]赵丽丽，陈超，王普昶．百脉根种子萌发期抗旱性contrastingstressresponsewithoxidativeinjury[J]综合评价[J]．贵州农业科学，2012，40(9)：56JournalofIntegrativePlantBiology，2006，48(11)—60．1318—1329．赵海明，孙桂枝，王学敏，等．百脉根种质苗期抗[18]HERBINGERK，TAUSZM，WONISCHA，eta1．旱性鉴定及综合评价[J]．草原与草坪，2011，31Complexinteractiveeffectsofdroughtandozonestress(6)：18—26．ontheantioxidantdefencesystemsoftwowheatcuhivars[12]王纪华，赵春江，黄文江，等．土壤水分对小麦叶[J]．PlantPhysiologyandBiochemistry，2002，40(6／片含水量及生理功能的影响[J]．麦类作物学报，7／8)：691—696．2001，21(4)：42—47．[19]NIKOLAEVAM，MAEVSKAYAS，SHUGAEVA，et[13]INSKEEPWP．BL00MPR．Extinctioncoefficientsofa1．Effectofdroughtonchlorophyllcontentandantioxi—chlorophyllaandBinN，N—dimethylformamideanddantenzymeactivitiesinleavesofthreewheatcultivar80％acetone[J]．PlantPhysiology，1985，77(2)：varyinginproductivity[J]．RussianJournalofPlant483—485．Physiology，2010，57(1)：87—95．[14]王学奎．植物生理生化试验原理和技术[M]．北[20]邹春静，韩士杰，徐文铎，等．沙地云杉生态型对京：高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