基于PCR技术测定水处理厂进出水样中肠道病毒 8页

基于PCR技术定量的实时测定意大利污水处理厂流入和流出样中肠道病毒GiuseppinaLaRosa,ManoochehrPourshaban,MarcelloIaconelliandMicheleMuscillo总结：肠道病毒广泛存在于污水中，研究消除污水中这种病毒的处理效果和他们释放到环境中或通过回收的废水带来的潜在的健康风险，都是环境微生物学中非常重要的课题。利用PCR（聚合酶链式反应）技术对罗马周边5个污水处理厂流入和流出水样中肠道病毒进行实时定量测定，发现三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（GⅠ和GⅡ），并且和排泄物污染中的古菌指标进行了比较。其中，腺病毒在处理前后的废水中浓度是最高的，进水中的平均浓度大小为：腺病毒＞诺沃克病毒GⅠ＞诺沃克病毒GⅡ＞肠道病毒，出水中的平均浓度大小为：腺病毒＞肠道病毒GⅠ＞肠道病毒＞诺沃克病毒GⅡ。去除率分别为：肠道病毒35%，诺沃克病毒GⅠ78%，细菌99%。由于分子量化不能有效的表明它们对人体健康的实际威胁，因此通过完全细胞培养和PCR技术对已处理的出水中的肠病毒微粒的传染性进行评估。由传染性试验发现经过处理的水中活的细菌体通过排放进入环境会对公共健康带来潜在的威胁。由此对病毒的存在和抗污水净化流程对有效的管理回收处理的废水有关的风险的潜在影响，以及它们进入环境的影响有一个更好的了解。关键词：诺沃克病毒，腺病毒，肠道病毒，污水，实时定量PCR试验引言肠病毒主要是通过粪便排出，而当前的污水处理通常不能有效地去除这些生物体。大量的经处理和未处理的污水排入水体中，会对农业、娱乐以及饮用水有潜在的影响。当前，诸如粪大肠杆菌和肠球菌等细菌指标经常用于水质评价。这些细菌很常见，并且测量费用便宜，但是作为粪便污染的指标不是很理想。实际上，用当前的污水处理方法去除致病性肠道病毒比去除肠原杆菌更难。不同的研究发现，不论哪种处理方法肠道病毒在污水中都保持一个较高的数量，由此提出用一种病毒指示器反应废水污染。肠道病毒（EVs）和腺病毒（ADVs）就被建议用来作为监测水中人类粪便污染和确定\n消毒效果的指示。对污水处理站的监测，为研究病毒在各自的生活区域中的循环和这些病毒在已处理出水中存留率提供了一个合适的途径。目前研究的目标是评价废水处理前后三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ）的浓度，得到对已处理污水的病毒污染的潜在传染性的观察，并获得消毒效果的初略估计。作为对比，也对作为粪便污染指示的大肠杆菌和肠球菌两种肠原杆菌进行测量和量化。肠道病毒只有单链RNA，是非包膜病毒。肠道病毒感染的症状包括轻度上呼吸道疾病、发热性皮疹、无菌性脑膜炎、胸膜痛、脑炎、急性弛缓性麻、麻痹脊髓灰质炎、肠胃炎、心肌炎、心包炎和糖尿病。腺病毒有双链DNA，是非包膜病毒，有52个血清型，分成A、B、C、D、E、F六个亚种。感染症状包括肠胃炎、咽炎、肺炎、结膜炎,脑膜脑炎诺沃克病毒是鉴定急性非细菌性肠胃炎最常见的病毒，它有一单链RNA，这些病毒属于环状病毒科，分为GⅠ—GⅤ五个群。各组病毒通过适当的实时定量PCR（或RT-PCR）实现量化。实时定量PCR在水环境中是核酸量化的一种重要工具，该法灵敏，且有特异性，与其他方法相比更快，更简单。定量分子试验不能区分活的和灭活的病毒颗粒，因此大量病毒颗粒存在并不能表明对人体健康的现实影响。因此，评估已处理废水中肠道病毒感染性，可通过综合培养和实时定量PCR（ICC-RT–PRC），这是一种将灵敏的传统定量PCR与一个传染性试验相结合的方法。方法样品采集选择意大利中部的五个不同城市的污水处理厂，每个厂之间相距30km。这几个所选的污水处理厂都是用传统的活性污泥法处理城市污水。废水在排入水体前，处理过程主要包括格栅分离，初级沉淀，二级生物处理和最终的氯消毒。每天进入这些工厂的废水量从4800到750000m3不等，设计处理能力从60000到1100000人口当量，并且这些厂不处理工业废水。总共采集50个样品（25个进水，25个出水，每个样品50mL）。从2007年5月到9月，每月采样一次。每次采样时间为一个星期天早上，用50mL无菌的离心管储存置于4℃恒温袋中，在24小时内送回实验室。\n病毒浓缩和RNA提取病毒的浓缩如前所述，简单地说，4℃下以3000×g样品离心分离10min，再取上清液以200000×g离心分离2h。在悬浮液中加入1mL磷酸盐缓冲液使悬浮颗粒溶解，在-80℃下保存到提取出基因组。为评估病毒复活率，在50mL蒸馏水中加入1.91×108个艾柯病毒2（康纳利斯菌株，美式培养，ATCC，VR-32）的基因组拷贝（GC），计算用实时定量PCR浓缩后与浓缩前基因拷贝数的比率。用NucliSensminiMAG核酸分离装置从100μL病毒颗粒中分离出RNA和DNA，该装置是基于大量核酸提取方法和磁硅珠的结合，用于收集和洗涤磁硅颗粒，并从磁珠上复原核酸。病毒从100μL的脱洗缓冲液中的硅颗粒上脱离，在-80℃下储存。Italia,Florence,Italy)细菌学试验试验前，保证样品的完整性和可分析性。对大肠埃希氏菌，使用微量滴定板，按照制作流程“用微型方法计算表面大肠埃希氏菌数目和废水的MUG/EC”。相似的，对肠球菌，使用微量滴定板按照制作流程“用微型方法计算表面大肠球菌数目和废水的MUG/EC”。所有这些流程都是根据ISO程序（ISO9308-3,1998，ISO-7899-1，1998）。在这两种情况下，细菌数与荧光多少一致，用最可能数字表示，与ISO8199一致。定量标准用绝对量化确定样品中病毒基因拷贝数量，通过连续的10倍稀释（108-101）腺病毒的线性质粒DNA，肠道病毒和诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ的ssRNA溶液，制作外部校准曲线。标准液是无核酸酶但含有tRNA的稀释液（100ng/μL）。诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ的定量标准，先前设定为ssRNA链的762核苷酸和591核苷酸，分别包含RNA聚合酶部分密码组序列。对诺沃克病毒的定量分析是在ORF1和ORF2两个区域，使用特定基因族群集团试验，对基因组片段Ⅰ和Ⅱ分别用改良的TaqMan试验，能够扩大到96bp和98bp。\n腺病毒量化的校准曲线是从重组pCR4TOPO所含蛋白质基因部分在一个线性HindⅢ质粒上测得。TaqMan定时定量PCR是用Hernroth及其合作者的试验，并作细微的修改，放大了hexon基因保守区域到69-bp。肠道病毒量化的标准RNA是由一个从包含整个脊髓灰质炎病毒1基因组克隆成的pGEM-4Z载体的pVRB106上获得amHI220-670片段（451-bp）。重组质粒用Qiagen制备。获得DNA模板后，用RiboMAX大型RNA生产系统T7制作RNA模板。由T7仪器转录513核苷酸ssRNA，并用ND-100仪器量化。ssRNAme复制体的聚合浓度用下式计算：GC/mL=C/MW*6.02×1023，其中C是RNA浓度（C=g/mL），MW是分子量。根据Donalson及其合作者的试验量化PCR，该试验是基于对5号区（192bp）的TaqMan探针水解。表2表示引物和PCR的使用。定时定量PCR定时定量PCR是用ABI－PRISM7000连续检测仪测定10μL提取出的基因复制品。反应在一次性96孔光学平板上进行，加入25μL腺病毒SensimiｘDNA和肠道病毒及诺沃克病毒的单段SensmiｘRNA的混合物。对腺病毒，反应混合物在50℃下加热2min然后在95℃下加热10min；保持40个周期的活性，每个周期包括在95℃变性15s，在60℃退火1min。对肠道病毒及诺沃克病毒的反应混合物先在42℃培育45min转录RNA。这是因为量化PCR非常灵敏，要防止样品受污染就需在准备，试剂混合，抽样及凝胶电泳阶段单独进行；试剂和样品储存在不同房间中，并且各个房间使用的仪器不能在其他的房使用。PCR混合控制和提取控制系统结合使用。标准曲线用SequenceDetectionSystem软件制作，绘制周期阈值（Ct）与病毒复制体数量的曲线。运行的可接受性被定义为一个相关系数（R2）＞0.98，斜率在-3.6到-3.1之间，对应反应效率在90到110%之间，由方程Efficiency=10（-1/slope）—1。为验证样品实用性，重复测试负样，在实时混合样中加入RNA或DNA标准样。数据分析定时定量PCR的再现性通过内部和外部试验的可变性（同一天的复制品和其他时间在完全相同试验条件之下的变化）评估。用变异系数（%CV）来量化标准曲线在不同稀释值下的Ct值变化。\n量化数据用Excel软件导出做统计分析。去除计算方程如下：R（%）=（MPCout—MPCin）/MPCｘ100，其中，MPCout是指出水样品中病原体浓度，MPCin是指进水样品中病原体浓度。这意味着细菌平均值比病毒削减20%。此外还能计算最大值和最小值。细胞培养分析和预测人类肠道病毒处理水样中类肠道病毒传染性分析使用人类横纹肌肉瘤（RD）细胞。浓缩和超速离心分离后，用氯仿提取物净化200μL病毒悬液，并接种到25cm2的组织培养瓶中。被丢弃的培养液和细胞用4mL维护媒介（Dullbecco修改过的媒介DMEM）覆盖。一般培养液在5%的CO2中与37℃下培养5天每天用光学显微镜观察。一个艾柯病毒2菌株（VR-32，ATCC，USA）做一个正控制；未感染细胞做负控制。细胞培养应在PCR上设物理隔绝。5天后，培养瓶中有CPE出现，然后冷冻和解冻三次。取200μL上清液用NucliSensminiMAG法从中提取病毒核酸，RNA存在于最终的100μL的上清液中。在定时定量PCR扩大培养中用10μL纯化病毒核酸，测量细胞培养后病毒复制数。通过ICC-RT-PCR获得的产品对其进行分析，确认肠道病毒的存在，还可能获得更多肠道病毒类型的信息。这是通过在2%琼脂糖凝胶喊溴化乙锭（0.5mg/mL）中运行PCR（预期达192bp），并用紫外线照透器观察。在毛细管自动序列发生器（ABI棱镜310基因分析仪））中一些正样品被净化。结果浓缩效率该方法的浓缩效率是用定时定量PCR测定，使用参入艾柯病毒2（一式三份）的蒸馏水，并计算病毒拷贝数在浓缩前后的比率。超过5.4×10８/标准病毒反应，1.98×10８GC/恢复反应（SD=7.3×10７），收益率为35.4%±3.3%。细菌学结果定量细菌学数据如表一所示。对每个检出微生物，表中列出了进出水的最大值和最小值，以及去除率。一个两质还原或者更多，对进出水中细菌数的影响进行比较。结果表明在已处理废水中大肠杆菌颗粒和肠球菌去除率分别为98.9%和98.5%。定时定量PCR结果\n污水中病毒浓度的测定是用定时定量PCR，斜率值从-3.2到-3.5。内部和分析可变性显示一个良好的重现性。在处理前后的污水中发现大量的腺病毒（分别为9.8×108GC/mL，4.9×108GC/mL，见表2）。进水中浓度最低的病毒是肠道病毒（2.4×106GC/mL），出水中浓度最低是诺沃克病毒GⅡ（9.9×105GC/mL）.。进水样平均值大小为：AdV＞NoVGⅠ＞NoVGⅡ＞EV，出水样：AdV＞NoVGⅠ＞EV＞NoVGⅡ。进水中三种病毒加在一起总GC数为4.8×107，出水中总GC数为1.2×107，总去除率为74%。全面分析经过几个月的到的去除率，能最有效移除的是NoVGⅠ（78.4%），而EVs的移除率最低（34.6%）。对样品分析显示一些废水样中的某些病毒可完全清除：37.5%的废水样中没有NoVGⅡ，53.3%废水样中无NoVGⅠ，8.3%水样中五EVs，11.1%水样中无AdVs。大多数污水样品只有部分清除，此外，在极少情况下，出水的污染程度高于进水。在定时定量PCR的样品中最常见的病毒是EVs（进水96%，出水84%）和AdVs（进水96%，出水76%）。样品中含量较少是NoVGⅠ和NoVGⅡ（进水中分别为92%和72%，出水中分别为68%和40%）。同时存在多种病毒的原则是：64%进水样（28%出水样）对所测病毒都适宜；28%的进水或出水样对三种病毒适宜；8%的进水（或出水）水样对两种病毒适宜。没有任何进水（16%出水）水样对所有病毒都不适宜。肠病毒传染性和序列分析9个（总共25个）水样显示细胞的病变影响RD细胞；计算细胞培养前后每升内GC量，以及指数期增加的GC量。样品经序列分析192-bp扩展子和肠道病毒B的特征。讨论未经适当处理的废水排进水体是造成水环境致病性污染的一个主要来源。由于其高致病性，引起了公众极大的关注。事实上，通过直接接触废水被认为是主要的致病原因，并且造成肠胃炎、肝炎、呼吸系统疾病和其他健康问题。在人类排出物中存在大量的病毒，根据其流行病学意义引起人们关注的主要有三种病毒：EVs、AdVs、和NoVs。研究目的是为评估这些病毒在进出水中的浓度，获得更多关于它们的潜在传染性的观察，并获得一个粗略的净化效果估计。用分子方法来量化病毒，特别使用TaqMan定时定量PCR试验，该法具有快速、准确、灵敏和定量的优点。\n对AdVs，在使用TaqMan定时定量PCR试验前先证明在环境和试验样品中腺病毒种（A-F）的病毒DNA都可测定。AdVs在进出水样中都的存在（分别为96%和76%）。此外，所有测定病毒中，AdVs在进出水中的浓度是最高的。并且AdVs的浓度比其他病毒的总量还高。这一发现与2008年的一项研究一致，AdV浓度是所有被测肠病毒中最高的。出现AdVs较高浓度的原因是它是肠病毒中唯一的DNA病毒，也是最具耐热性的。事实上，不同研究显示AdVs比粪指示菌在环境中和污水中的存活时间长，切耐紫外线。在目前的研究中AdV浓度略高于此前的研究，可能是因为其再人群中有了更高的发病率。对NoV定量使用定时定量RT-PCR方法，该法之前多用于临床试验中，现用于河口、海水和污水样本中。NoVs比AdVs少：进出水中GⅠ含量分别为72%和40%，GⅡ含量分别为92％和68％。发现进出水样中GⅠ比GⅡ更有用。所得的病毒浓度符合之前不同试验研究的结果。NoVGⅠ相对于NoVGⅡ有更高的浓度表面看似不符合NoV爆发的流行病学数据和个别病例，主要归因于NoVGⅡ。这一发现表明GⅠ在人群中是一个重要的存在，在法国和瑞典都对这一发现进行过描述。并暗示进一步的研究来解决可能存在的差异导致致病性的不同，以及他们在水中稳定性的不同，和避免受人类免疫系统影响的差异。基于TaqMan探针水解技术对EVs进行量化是在肠道病毒基因的保守区段进行，该区段有足够的可识别病毒变异性的基因。EVs的活性样本比例是最高的（进出水分别为96％和84％），但是它们的浓度是最低的。这可能表明EVs与其排放量是一致的，即使是无症状感染的情况下，二其他肠病毒大多是疫情与其排放减少量一致，且有更大的浓度。综上，平均病毒基因浓度大小为：进水中，AdV＞NoVGⅠ＞NoVGⅡ＞EV；出水中，：AdV＞NoVGⅠ＞EV＞NoVGⅡ。去除率从35%（EV）到78%（NoVGⅡ）。考虑所有病毒组，整体的去除率是74%。这些数据与之前的研究是一致的，都表明在进出水中肠病毒都有一个较高的量。去除效率的结果与其他研究一致，表明即使是正常工作的污水处理系统对肠病毒的去除率也只有20-80%，这些病毒很易进入水源并成为人类健康隐患。另一方面，指示细菌的去除率更高一些（高达98.8%）。所得数据一方面可以确定指示细菌的高去除率，另一方面确定肠细菌和肠病毒去除率之间的相应缺失。应该注意的是，每月采集一次的样品不能是复合样。因此，，所得结果不能作为污水处理厂的实际去除率，而应该是进出口大致的病毒污染量。这项研究的另一个限制是采样的时间不足以作为评估病毒浓度的季节性变化，尤其是对诺瓦克病毒，在冬季会引起肠道炎。然而，最近的研究表明，NoV爆发引起的胃肠炎在春季有所增加并\n在夏季达到峰值，并且夏季污水处理厂NoV浓度有所增加。对病毒浓度的详细分析并不在目前的工作范围。定时定量PCR迅速发现和量化环境样品中的病毒的能力说明环境的应用程序有一个相当大的运用潜力。然而，在解释卫生方面的含义，用PCR检测病毒基因组的存在仍有困难，是由于分子方法不区分传染性和非传染性的病毒颗粒。因此继续用ICC-RT-PCT评估处理废水的病毒传染性。这种方法克服了传统细胞培养和直接PCR试验中相关缺陷，减少了检测病毒传染性的时间。选择这种方法用于检测EVs，是由于在三种病毒测试研究中，它们是唯一能在细胞株上有效生长的种群。培养AdVs（尤其是肠病毒类型40和41）有更多的问题，目前没有适于NoVs的普通细胞培养。ICC-rreal-timePCR法提供4-5天内污水采样检测的结果。通过GC数的指数型增加来确定病毒数增加。相关结果显示，处理过的水仍然包含传染性EVs（样本含36%），并且表示潜在的健康危害。对于其他肠病毒研究，对污水厂污水中病毒基因的检测显示，经过处理的污水可能代表一个环境污染源潜在的病毒感染。事实上，以前的研究已经发现在三级处理和紫外线污水消毒废水中存在传染性AdVs，证明了AdVs隔离种的抗性。近年来，城市污水中人类致病性病毒的分子特性的检测用于获得特定群体中病毒循环的信息；然而，我们所掌握的最好的知识，在没有经过前期调查处理是，需与污水处理厂中病毒浓度比较不同浓度下的流行病学病毒，水性肠病毒，可用定量分析。考虑到病毒性肠胃疾病的爆发，而且缺乏有效的流行病学监控系统时，污水处理厂进水的病毒学监测可能是一个经济有效的方法，其将对工厂服务区的致病性病毒的出现进行持续追踪。另一方面，对污水样品监控可有利于对过废水处理中病毒去除率的认识，从而预防疾病。结论这项工作证明了污水厂出水中肠病毒基因是很常见的，表明污水处理的污水可能是一个有潜在病毒感染性的环境污染源。所有测试病毒中，AdVs在进出水中的浓度都是最高的，它可作为确定水体病毒污染的可能性指标的病毒之间的相关性的依据。已经证明定时定量PCR是用于快速测定环境样品中肠病毒的一个强大工具，并且也代表了水生环境中病毒量化的一个相当大的进步。