基于藻菌共生体系强化微藻富集和废水处理的研究 78页

分类号：X703单位代码：10183研究生学号：2014644025密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）基于藻菌共生体系强化微藻富集和废水处理的研究ConstructionofAlgae-bacteriaCo-cultivationSystemforEnhancingAlgaeHarvestandAcceleratingWastewaterTreatment作者姓名：王瑶类别：工程硕士领域（方向）：环境工程指导教师：周丹丹教授合作导师:关春雨高级工程师培养单位：环境与资源学院2017年5月\n基于藻菌共生体系强化微藻富集和废水处理的研究ConstructionofAlgae-bacteriaCo-cultivationSystemforEnhancingAlgaeHarvestandAcceleratingWastewaterTreatment作者姓名：王瑶领域（方向）：环境工程指导教师：周丹丹教授合作教师:关春雨高级工程师类别：工程硕士答辩日期：2017年5月26日\n\n摘要摘要基于藻菌共生体系强化微藻富集和废水处理的研究微藻作为最有潜力可替代石油资源的生物质能源受到广泛关注。然而微藻富集困难是微藻生物技术发展的瓶颈问题。生物絮凝法是最具潜能方法来收获微藻，从而减少富集费用和能量消耗。生物絮凝法具有明显优势，一方面，利用具备絮凝功效的细菌高效富集微藻，同时避免传统絮凝剂带来的不利影响。另一方面，由于微藻净化水质能力较弱，细菌的存在可以加速去除废水。本研究利用响应面模型法优化微藻-生物絮凝菌共培养条件，提高微藻絮凝效率和油脂容量。同时构建微藻-生物絮凝菌共生体系，强化微藻的絮凝效率，加速废水处理效能。解析微藻-生物絮凝菌聚集机理。由于纯藻不具备絮凝作用，小球藻的絮凝效率仅为0.2%。接种菌藻比（B/C）、有机物浓度即葡萄糖浓度（Cglucose）、共培养时间（T）作为自变量，响应值（因变量）为微藻的絮凝效率和油脂容量，构建三维响应面模型。絮凝效率和油脂容量模型的F-value值分别为3.98和8.46，实际值和预测值的R2值分别为0.7817和0.8711，结果显示该模型成立。因此在共优化条件下即B/C为0.20–0.25，Cglucose小于1.5g/L,T为9–14d，微藻絮凝效率达到45.0–50.0%，油脂容量超过21%。藻-菌共生体系中（AB），探究不同水力条件对微藻富集与废水处理的影响，结果表明，当培养周期为48h时，较高水力条件（即150rpm/min）可以得到最优絮凝效率、微藻生物量和化学需氧量（COD）去除率。絮凝效率为86.65%，微藻沉淀液生物量浓度为7108.00mg/L，水质的COD去除率为77.96%。构建菌-藻共生体系，与纯藻培养体系（PA）做对比，强化微藻的富集与废水处理。结果显示，藻菌共生体系在24h絮凝效率达88.72%，而纯藻体系几乎不具备絮凝效率（絮凝效率为4.54%）。在24h和48h培养周期下，藻菌共生体系的沉淀液（ABR）微藻生物量可达7406.06mg/L和8205.00mg/L。在48h培养周期下，藻菌共生体系对COD和总氮（TN）的去除效率分别为91.66%和52.34%，对COD和TN的去除率高于纯藻对COD和TN的去除率31.74%和15.48%。I\n摘要利用扫描电子显微镜（SEM）观察藻菌聚集体的微观结构，发现体系分泌的胞外聚合物（EPS）和生物絮凝菌对藻菌聚集起着重要作用。在培养24h周期时，藻菌共生体分泌EPS中的多糖和蛋白质容量分别为257.89mg/L和60.92mg/L，显著高于纯藻分泌EPS中的多糖和蛋白质容量。三维荧光光普（EEM）结果显示，色氨酸和酪氨酸是藻菌共生体EPS的主要荧光成分，不同于纯藻EPS的荧光成分。傅里叶红外（FT-IR）测试结果显示，糖苷键和氨基组分的改变导致多糖和蛋白质发生变化。高通量测序结果表明，菌株Bacillus和Sphingobacterium能够分泌色氨酸和鼠李糖，菌株Brevundimonas可以分泌蛋白质和多糖，共同作用促进微藻的絮凝。综上所述，藻-菌共生体系分泌的EPS中的芳香族蛋白（色氨酸和酪氨酸）和多糖对微藻的絮凝起着重要作用。本研究对微藻的富集提出新观点，利用微藻-生物絮凝菌共培养共生体系强化微藻的富集，提高微藻生物量，强化废水处理效能，初步分析藻-菌聚集机制。关键词：微藻，生物絮凝菌，富集，废水处理，机理，响应面II\nAbstractAbstractConstructionofAlgae-bacteriaCo-cultivationSystemforEnhancingAlgaeHarvestandAcceleratingWastewaterTreatmentMicroalgaeaspotentialbioresourcesreceivedextensiveconcern.However,microalgaeharvestingtechnologyisabottleneckinthedevelopmentofmicroalgaebiotechnology.Bioflocculationisapotentialmethodtoharvestalgae,reducingcostandenergy.Ononehand,bioflocculationmethodusingbioflocculationbacteriacanharvestalgaeandavoidthenegativeeffectsoftraditionalflocculantssuchasmetalions.Ontheotherhand,thebioflocculationbacteriapromotewastewaterdegradationastheresultofaxenicalgaegenerallyshowinglowwastewatertreatmentcapability.Inthiswork,co-cultureconditionswereoptimizedtoweakenthenegativecompetitionbetweenthemicroalgaeandbioflocculationbacteriabyresponsesurfacemethodology(RSM),enhancingharvestingefficiencyandlipidcontent.Andweprovedalgae-bioflocculationbacteriaco-cultivation(AB)insyntheticwastewater,aimingtoenhancealgaeharvest,promotealgaebiomass,acceleratewastewatertreatmentandrevealthemechanismofalgaebioflocculation.Axenicmicroalgaeexhibitedpoorharvesting,asexpressedbyaflocculationefficiencyof0.2%.Thisworkoptimizedtheco-cultureconditionsofmicroalgaeandbioflocculationbacteriainsyntheticwastewaterusingresponsesurfacemethodology,aimingtoenhancemicroalgaeharvestingandlipidcontent.Threesignificantprocessvariables:inoculationratioofbacteriaandmicroalgae(B/C),initialglucoseconcentration(Cglucose),andco-culturetime(T),wereproposedintheRSMmodel.F-valuesof3.98/8.46andR2valuesof0.7817/0.8711bothindicatedareasonablepredictionbytheRSMmodel.Theresultsshowedthatmicroalgaeharvestingefficiencyreached45.0–50.0%,andthelipidcontentwasover21.0%whenco-culturedwithbioflocculationbacteriaundertheoptimizedcultureconditionsofinoculationratioofIII\nAbstractbacteriaandmicroalgaeof0.20–0.25,initialglucoseconcentrationoflessthan1.5mg/Landco-culturetimeof9–14d.Weinvestigatedtheeffectofalgaeharvestingefficiencyandwastewatertreatmentunderdifferenthydraulicconditions.Theresultsshowedthatthealgaeharvestingefficiencywas86.65%,algaebiomasswas7108.00mg/Landchemicaloxygendemand(COD)removalwas77.96%whenco-culturedconditionwasunderthehigherhydrauliccondition(150rpm/min).Wealsoprovedalgae-bioflocculationbacteriaco-cultivation(AB)insyntheticwastewaterunderhigherhydrauliccondition,aimingtoenhancealgaeharvest,promotealgaebiomassandacceleratewastewatertreatment.TheresultsshowedthattheharvestingefficiencyofABachievedto88.72%onlyin24hoursco-cultivationascomparedto4.54%achievedwithpurifiedalgaecultivation(PA).AlgaebiomassofABraisedto7406.06mg/Land8205.00mg/Lintheco-cultivationtimeof24hoursand48hoursrespectively.TheCODandtotalnitrogen(TN)removalefficiencyof91.66%and52.34%inABduring48hourscultivationweremuchhigherthanthatofPAowingtothepresenceofbacteria.Scanningelectronmicroscopy(SEM)observedthestructureofalgae-bioflocculationbacteriagranulesandalgae-bioflocculationbacteriaflocs.SEMimagesindicatedthatEPSandbacteriahadrelevancewithalgaeaggregation.Extracellularpolymericsubstances(EPS)measurementshowedthatpolysaccharideandproteincontentinABwere257.89mg/Land60.92mg/Lbytheendof24hourscultivation.TryptophanandtyrosinewerethedominantfluorescentcomponentsofEPSinABbythree-dimensionexcitationemissionmatrixfluorescencespectroscopy(EEM)measurement.Fouriertransforminfrared(FT-IR)resultsobservedthatthechangeofglucosidicbondandaminegroupassociatedwithpolysaccharideandprotein.High-throughputsequencinganalysisindicatedthatBacillusandSphingobacteriumincreasedthesecretionoftryptophanandrhamnoserespectively.Brevundimonassecretedproteinandpolysaccharideforalgaeflocculation.ThecomprehensiveresultsfurthersupportedIV\nAbstractthataromaticprotein(tryptophanandtyrosine)andpolysaccharideofextracellularpolymericsubstancesplayedkeyrolesinharvestingalgaeinAB.Thisworkprovidednewinsightsintomicroalgaeharvestingandcost-effectivemicroalgalbioproductsandconfirmedthepromisingprospectofintroducingbioflocculationbacteriaintomicroalgaebioenergyproduction.Keywords：Microalgae,bioflocculationbacteria,harvesting,wastewatertreatment,mechanism,responsesurfacemodelV\n目录目录第1章绪论...............................................................................................11.1微藻生物质能源............................................................................11.2微藻富集方法与机理研究现状....................................................11.2.1微藻的富集方法......................................................................11.2.2微藻生物絮凝机理....................................................................31.3微藻与废水耦合的研究现状..........................................................31.4微藻与细菌间的协同作用...............................................................51.5课题的提出与研究内容..................................................................61.5.1课题的提出................................................................................61.5.2课题的研究内容........................................................................7第2章实验材料与方法..........................................................................92.1实验材料与仪器..............................................................................92.1.1微生物种....................................................................................92.1.2微生物培养................................................................................92.1.3实验仪器..................................................................................112.1.4实验试剂..................................................................................102.2实验分析方法................................................................................12\n目录2.2.1生物分析法..............................................................................122.2.2化学分析法..............................................................................132.2.3光谱分析法..............................................................................13第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量...........................................................................................................153.1响应面模型的实验设计................................................................153.2响应面模型优化及分析.................................................................183.3生物絮凝菌对微藻絮凝效率优化.................................................233.4生物絮凝菌对微藻的油脂容量优化.............................................253.5生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量共优化.....................263.6小结................................................................................................27第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理........................294.1探究水力条件对微藻的富集与废水处理的影响........................294.1.1探究水力条件对微藻的富集和生物量的影响......................294.1.2探究水力条件对废水处理效能的影响..................................324.2基于藻菌共生体系对微藻的富集和废水处理的强化作用........334.2.1基于藻菌共生体系强化微藻的富集与生长..........................334.2.2基于藻菌共生体强化废水处理效能......................................364.3藻菌体系稳定性分析....................................................................38\n目录4.4小结.................................................................................................40第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究...............................................395.1藻菌聚集微观结构........................................................................395.2藻菌聚集体胞外聚合物分析........................................................405.2.1多糖和蛋白质分析..................................................................405.2.2三维荧光光谱分析...................................................................415.3傅里叶红外光谱分析....................................................................445.4微生物群落结构分析....................................................................455.5小结................................................................................................50第6章结论与展望................................................................................506.1结论................................................................................................506.2展望................................................................................................51参考文献...................................................................................................52作者简介及在学校期间所取得的科研成果..........................................60致谢...........................................................................................................61\n第1章绪论第1章绪论1.1微藻生物质能源目前石油资源的短缺影响未来经济的发展，而微藻生物质能源可以有效替代石油资源并受到科学家们的广泛关注。由于微藻的快速增长，使得微藻可以迅速积累大量的油脂，且显著高于其它陆生植物的油脂容量[1]。微藻可以通过改变脂质生物合成途径来存储油脂。且微藻的油脂容量和生长率显著优于其它物种[2,3]。微藻生物产生的油脂可以作为生物柴油原料供体，微藻油脂中的每个碳原子所存储的能量是碳水化物存储能量的两倍，这将直接转化为两倍的燃料能源，进而转化成生物质能源[4,5]。因此微藻生物质存储丰富的油脂已得到全球范围内的广泛关注，生产可替代、持续性新型生物质能源来替代化石燃料，并且可以有效解决全球气候变暖等环境问题[6,7]。这是因为微藻可以利用自身的光合作用将太阳能源或者异养培养中的有机物质转化为生物质能源，并且通过一定的技术措施对藻细胞加工，可以获得各类的生物燃料[8]。目前限制微藻生物技术发展的主要挑战之一是微藻的富集。如何从微藻的培养基中收获微藻是一大难题。由于微藻个体微小，属于单细胞生物，真核生物微藻尺寸为2-30μm，蓝藻细胞为0.2-2μm，且稳定存在于溶液中，在培养液中浓度低至200-600mg/L，不易被收获，常规的初始富集方法不仅费用昂贵，而且影响后续进程[9]。因此需要迫切解决微藻富集的难题。1.2微藻富集方法与机理研究现状1.2.1微藻的富集方法微藻富集困难成为限制微藻技术发展的瓶颈问题。由于微藻细胞体积极小（粒径为2-20μm）能稳定悬浮在溶液中，因此一般意义上的沉淀、筛选是不可行的，而絮凝法是微藻富集的一种高效富集手段。1\n第1章绪论1.2.1.1化学絮凝法化学絮凝法（金属盐离子如铝离子和铁离子）广泛应用于废水处理和矿产资源的絮凝技术中，尽管金属盐离子已经应用于富集微藻的技术中[10]，研究表明仍然有高浓度的金属离子残留于微藻生物质中。残留于微藻体内的金属离子进一步影响油脂的提取[11]。碱性絮凝法成为最便宜的絮凝方法，然而毒性很低矿物质参也可能导致化学污染[12]。1.2.1.2物理絮凝法物理絮凝法有效的避免了化学污染与生物污染问题，如膜分离、离心、电解絮凝等方法，物理絮凝法对微藻的絮凝效率达90%以上，但是需要额外的能量输出，而且其价格非常昂贵[13,14]。1.2.1.3自絮凝法当pH大于9时，由于微藻的光合作用消耗CO2，有时会自然发生絮凝作用，一般来说，自絮凝的发生与钙离子或者镁离子的沉淀形成有关。沉淀物可以携带正电荷，与微藻表面的负电荷发生电性中和的作用，或者对微藻起到网补卷扫的絮凝作用[15]。但是大部分的河流湖泊很难达到如此高的pH值。1.2.1.4生物絮凝法生物絮凝方法中，细菌和真菌也能起到絮凝微藻的作用，一些真菌能分泌出大量相互作用的菌丝控制微藻细胞表面从而起到絮凝微藻作用。某些特定细菌或细菌菌群也起到絮凝微藻作用，具有富集潜能。因此生物絮凝方法开始受到研究者广泛关注，目前研究表明，生物絮凝法是一种绿色且高效的富集手段[16]。研究者OhHM等人探究土壤生物絮凝剂对微藻的富集效率优于金属盐离子和高聚物[17]。研究者KimDG等人利用钙铁离子助凝剂和生物絮凝剂共同作用富集微藻，使得微藻的富集效率达到95%以上[18]。研究者WanC等人筛出一株具有聚集微藻功能的细菌SolibacillussilvestrisW01，富集效率可达95%[19]。研究者LeeJ等人提出在藻菌共生体系中，培养14天后微藻絮凝效率可以达到94%，而纯藻的絮凝效率仅为2%，说明细菌的存在对微藻絮体尺寸和沉降起到了关键作用[20]。研究者AgbakpeM等人通过生物絮凝菌包被聚乙烯亚胺（PEI）提高微藻的富集效率，微藻的富集效率由23%提高到83%[21]。研究者WangH等人从二叠系地下2\n第1章绪论水中筛选出一株特定细菌HW001能够有效富集微藻[22]。因此采用生物絮凝菌富集微藻是切实可行的。1.2.2微藻生物絮凝机理目前，针对细菌和微藻聚集的机理研究不够深入。PowellRJ等人筛选具有聚集微藻功能的细菌Bacillussp.StrainRP1137，添加少量金属离子（钙离子和镁离子），微藻富集效率可达70-95%[23]。研究者SalimS等人认为细菌细胞表面是藻菌聚集的重要因素，能够有效促进细胞（菌）-细胞（藻）间的连接[24]。LeeJ等人研究认为细菌本身和细菌产生的胞外聚合物共同作用增强微藻富集，某些特定细菌的存在对微藻的富集起到了关键性作用，例如Flavobacteriumsp.,Terrimonassp.,Sphingobacteriumsp.,Rhizobiumsp.和Hyphomonassp.[20]。研究者AgbakpeM等人通过改变细菌的电荷特性，将带有负电荷的细菌包被很强阳离子电解质的聚合物，利用双电层理论（DLVO）使得带负电荷的细菌在带正电荷聚合物的包被作用下，形成一种桥连方式，利用吸附架桥的作用富集微藻[21]。研究者BhaskarPV和BhosleNB提出微藻的沉降与胞外聚合物（EPS）的增加呈现正相关性[25]。当快速增加细胞生物膜的数量，大量的微藻很快被富集。微藻或者细菌可以分泌胞外聚合物，胞外聚合物主要是由蛋白质、多糖和其它小分子的糖类组成[24]。微生物分泌的胞外聚合物能够使得藻细胞彼此捆绑在一起或者紧密的结合在一起。如果胞外聚合物和部分藻细胞捆绑在一起，那么其余的胞外聚合物能够捆绑其它的藻细胞，形成胞外聚合物-藻细胞的架桥或者网状结构。如果胞外聚合物完全的捆绑藻细胞，这可能是由于两者的尺寸很小且可以很好的结合到一起[26]。然而，目前还没有证实哪种机制是对微藻富集起决定性作用。因此迫切需要解析生物絮凝菌富集微藻的机制，为强化微藻的富集提供理论基础。1.3微藻与废水耦合的研究现状近年来，污水处理与微藻培养耦合技术引起了研究者的高度重视，该技术是指在微藻和细菌协同体系作用下，将污水中的污染物质资源化为微藻生物燃料资源的过程[27,28]。由于微藻培养费用十分昂贵，因此需要有效解决培养基来源的问题[29,30]。研究表明微藻能够利用生活生产中的废水进行自身生长，由此带来明显3\n第1章绪论的优势，不但可以供给微藻所需的营养物质，而且又可以处理多种类废水。如生活废水，养猪废水，啤酒废水，造纸废水，淀粉废水等[31]。研究者ZhangTY等人利用Scenedesmussp.ZTY2,Scenedesmussp.ZTY3,Chlorellasp.ZTY4处理市政废水，11天后COD去除率分别为40.8%，39.4%，40.8%[32]。研究者WuYH等人利用微藻处理市政二级出水，调解氮磷比的条件下，10d的培养周期后，微藻可以有效去除氮元素和磷元素[33]。微藻也能够去除重金属物质，微生物在进行光合作用时，能够通过物理吸附、离子交换、化学吸附、共价结合方式去除金属物质。表面沉淀、氧化还原、细胞表面结晶化对重金属进行去除，同时微藻能够释放细胞外代谢产物，这些产物又与金属离子发生螯合作用，避免金属转移到细胞内部造成中毒。另外，由于微藻对生态变化非常敏感，因此微藻也可以作为有毒物质的监测指示剂。而异养微藻的培养非常容易出现染菌现象，这也是不可避免的。因此更多的学者认为将微藻和细菌共培养具有一定的优势。由于细菌能够加速去除水质中的有机污染物质，因此，与纯藻相比，藻菌耦合培养可以大幅度提升废水处理效率。刘茜处理啤酒废水时发现，与单纯小球藻培养相比，藻菌共生体对废水中COD、TN、总磷（TP）的去除率和油脂容量都显著提高[34]。HernándezD等人将微藻和活性污泥共培养去除淀粉废水和养猪废水，COD的去除率可达62.3%和84.8%[35]。研究者ZhangY等人发现微藻和细菌共培养可以提高TN、TP、COD去除率[36]。微藻和活性污泥共培养可以提对废水的去除性能，去除有机物质、营养和病原体,不需要提供额外的O2，同时能够有效的絮凝微藻[37,38]。许多高浓度微藻塘利用微藻-细菌联合体来提高自身的效能。多种生物反应器能够提供最佳培养条件（温度、pH、氧传质、营养物质的浓度等）用于微藻的高效新陈代谢。在生物膜反应器中，C.sorokiniana和活性污泥共培养提高了有机物和氨的去除进程，封闭的生物膜反应器中的COD去除率提高到75%，NH+3−4去除率为99%，PO4去除率为86%[39]。研究者WuY等人提出异养和自养微生物共培养可以提高对高浓度有机物的去除效率，TP的去除效率达81%，溶解性磷（TSP）的去除率达74%，TN的去除率达82%，硝态氮（NO-+3-N）的去除率达79%，铵态氮（NH4-N）的去除率达86%[40]。研究者BhatnagarA等人探究小球藻Chlorellaminutissima在市政废水中培养对污染物的去除实验，改变微藻、细菌、光、污染物浓度因素来优化4\n第1章绪论小球藻对不同污染物的去除率[41]。细菌能够加速COD的去除，能够将复杂的有机物降解为小分子物质供给微藻的吸收和利用。同时能够减弱毒性，保护微藻的生长。藻菌共培养期间，有机物可以被细菌分解为CO2、水（H2O）、营养物质供给微藻的生长、代谢。因此微藻和细菌呈现出互惠共生的关系[42]。某些具有絮凝功效的真菌或者细菌可以与微藻单独或者联合培养。真菌或者细菌与微藻的共培养需要碳源。而废水中含有大量的碳源用于微藻和细菌的生长代谢。从而形成藻-菌絮体，使得微藻成功的被收获[43,44]。1.4微藻与细菌间的协同作用自养微藻和异养细菌可以呈现合作关系也可以呈现竞争关系。在实验室单藻培养环境下，特定细菌可以伴随微藻生长[45]。这就导致了纯藻容易出现染菌的现象。因此有菌藻共生体系代表自然条件下微藻和细菌形成的联合体，形成了微藻和共生菌的体系。好氧细菌（从实验室微藻体系分离出Pseudomonasdiminuta和P.vesicularis）能够促进微藻（Scenedesmusbicellularis和Chlorellasp.）大幅度生长[46]。甚至小球藻（Chlorellasp.）处理废水后释放的化学物质能够很好的促进大肠杆菌（Escherichiacoli）增长[47]。相反，微藻和色纤毛菌（Leptothrixochracea）在富含铁的液体条件下呈现敌对关系[48]。当有细菌存在的条件下，微藻产生的叶鞘（三层组织结构）由碳水化合物、蛋白质、重金属阳离子组成，而叶鞘与微藻细胞的聚集有关系[49]。细菌共生体直接附着在微藻的叶鞘上，连接着微藻细胞表面，减少扩散距离，能够迅速有效的交换物质[50]。因此藻菌共生体系中微藻的生长要优于纯藻的生长。一般来说，好氧异养生物能够累积光合成的产物碳物质，从而抑制微藻的光合作用[51]。在自然条件下，微藻可以释放0-80%光合作用产物即溶解性有机物质。在光生物反应器中可以释放6-16%的溶解性有机物质[52]。在封闭的光生物反应器中，溶解氧浓度可以达到400%，能够抑制微藻的生长[53]。微藻光合作用产生的氧气可以供给细菌生长代谢，从而提供良好的环境促进微藻生长[45]。在自然生长条件下，光生物反应速率是微藻呼吸速率的4-7倍。因此，细菌消耗氧气对微藻-细菌生长环境非常重要，同时也通过细菌的矿化作用影响着N的固定，糖、醋5\n第1章绪论酸、甘油影响异养生物的生长。然而，微藻的生长也抑制细菌的活动，例如释放抑菌剂、温度和保持高氧的环境[54]。生物絮凝菌是一种绿色环境友好型功能菌,一方面可分泌粘性物质促进微藻的聚集,另一方面可有效避免传统絮凝剂对油脂提取的影响。因此，生物絮凝菌成为促进微藻富集优先考虑的菌种。实际上，微藻-生物絮凝菌共生体系具有显著优势。一方面絮凝菌能够加速降低COD浓度，同时可以去除复杂的污染物质，能够减弱微藻生长环境的毒性。另一方面絮凝菌能够使机物降解为二氧化碳，水等可利用的营养物质，利于微藻的吸收利用。因此，生物絮凝菌和微藻共培养可同步实现废水净化和微藻收获作用，然而目前鲜有将生物絮凝菌和微藻共培养协同处理废水的报道。这是因为自养藻类生长速率缓慢，与异养细菌相比无竞争优势，两者相互竞争营养物质和生存条件。与此同时，高浓度细菌能够抑制或杀死微藻，低细菌浓度促进微藻生长，同时微藻可以吸收高浓度有机物质，超量微藻却可以抑制细菌生长。另一方面彼此间分泌毒素物质制约彼此。因此迫切找寻有效的生物絮凝菌和微藻共培养方法，能起到高效富集微藻的作用。有效调控共培养条件，削弱菌对藻的抑制作用，同时刺激生物絮凝菌分泌大量的胞外聚合物，促进微藻的絮凝，保证系统的稳定性对于生物絮凝菌强化微藻的富集具有重要意义。1.5课题的提出与研究内容1.5.1课题的提出由生物絮凝法富集微藻的研究现状可知，微藻的富集方法大部分是通过筛选具备絮凝功效的细菌作为有效的生物絮凝剂。通过分别培养微藻和细菌，再利用细菌的絮凝功效富集微藻。而微藻和细菌的培养基、培养环境等条件都大不相同，从而极大的增加了微藻和细菌的培养费用和资源空间。由微藻生物质处理废水的研究可知，微藻能够去除部分污染物质，如COD、TN、TP等，但去除效率较低，研究者们主要探究微藻与活性污泥耦合强化废水处理。而针对微藻-细菌耦合培养富集微藻和处理废水的研究还鲜见报道，同时针对生物絮凝菌富集微藻的机理尚未明晰。众多研究者认为微藻的富集可能由细菌、胞外聚合物（EPS）、电性中6\n第1章绪论和、吸附架桥等作用引起的，但具体何种机制富集微藻有待进一步研究。综上所述，利用微藻-生物絮凝菌共生体系富集微藻，优化微藻的絮凝效率，强化废水处理效能，提高油脂容量。解析微藻-细菌絮凝机理，充分发挥微藻-生物絮凝菌共培养效能。本课题的研究对微藻-生物絮凝菌共培养过程有更深入的理解，对微藻的富集、废水处理、油脂容量有了新的突破点。对微藻-生物絮凝菌共生体系富集微藻提供理论依据，对具有工业应用价值的微藻生物质能源技术具有重要的理论价值和应用意义。1.5.2课题的研究内容1.5.2.1研究目的本课题以高浓度人工模拟废水与异养微藻培养耦合为立足点，优化微藻-生物絮凝菌共培养为主线，筛选合适的微藻絮凝菌，强化微藻富集效率、废水处理和油脂容量。并对微藻聚集机制进行了初步分析。为废水处理中微藻生物质能源回收奠定了一定的理论基础。并按照图1.1技术路线展开研究内容。1.5.2.2研究内容微藻与生物絮凝菌共培养耦合体系优化藻-菌共培强化藻-菌富解析菌藻养条件集与废水处理聚集机制观察胞外藻-菌鉴定微藻废水絮凝油脂藻-菌聚合间官生物富集处理效率容量聚集物作能团絮凝指标指标形态用作用菌群藻-菌共培养工艺构建及菌-藻聚集机理解析图1.1本研究技术路线图Fig.1.1Technologyroadmapofthisstudy（1）优化微藻-生物絮凝菌共培养条件7\n第1章绪论优化已知生物絮凝菌（F2,Rhizobiumradiobacter）对微藻富集效率，利用响应面模型法优化菌藻比、有机物浓度、共培养时间培养条件，得出最佳微藻絮凝效率和油脂容量。（2）生物絮凝菌与微藻共培养条件下对微藻富集与废水处理的强化作用探究不同水力条件对微藻富集和废水处理的影响。构建微藻-生物絮凝菌共生体系，强化对微藻富集效率、废水处理作用；并与纯藻体系进行对比。（3）解析微藻-生物絮凝菌聚集机制利用扫描电镜观察藻-菌微观结构，检测藻-菌胞外聚合物（多糖、蛋白质）浓度，利用三维荧光普分析胞外聚合物荧光成分，利用傅里叶红外分析藻-菌官能团结构。通过高通量测序鉴定生物絮凝菌。从而探究微藻-生物絮凝菌聚集机理。8\n第2章实验材料与方法第2章实验材料与方法2.1实验材料与仪器2.1.1微生物种实验藻种为普通的小球藻（Chlorellavulgaris,FACHB-8）和（Chlorellaregularis,FACHB-729），购买于武汉中科院野生生物种质库—淡水资源藻种库。实验中的共生菌群是在长期且连续异养环境中伴随小球藻共生菌群，形成藻菌共生体系。因此获得无菌藻需经过多次纯化处理。实验菌种为絮凝菌种(Rhizobiumradiobacter,F2），由黑龙江省环境生物技术重点实验室开发并提供。2.1.2微生物培养2.1.2.1微生物培养基小球藻的培养基选择BG11培养基：硝酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，七水合硫酸镁0.075g/L，七水合氯化钙0.036g/L，碳酸钠0.02g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，微量元素溶液A51mL/L，适量浓度葡萄糖。微量元素溶液A5的组成成分（单位g/L）：硼酸2.86，氯化锰1.81，硫酸锌0.222，钼酸钠0.39，五水合硫酸铜0.079，硝酸钴0.05。菌株的增殖培养基选择LB固体培养基(单位g/L)：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂15-18，pH调节至7.0-7.2。生物絮凝菌种子培养基单位组成成分（单位g/L）：葡萄糖10，磷酸氢二钾5，磷酸二氢钾2，七水合硫酸镁0.2，氯化钠0.1，尿素0.5，酵母膏0.5，pH调节至7.2-7.5。葡萄糖在115°C下灭菌30min，其余成分均在121°C下灭菌20min。2.1.2.2微生物培养条件纯藻和藻菌共生体系接种比均为10%（v/v）接种到250mLBG11培养基于500mL三角瓶中，培养于恒温震荡培养箱中，恒温25°C，转速150rpm/min,培养期间利用光强2000lux的日光灯提供光照，光照周期为12h。生物絮凝菌按一定比例接种到250mL种子培养基于500mL三角瓶中,培养于恒温震荡培养箱9\n第2章实验材料与方法中，恒温30°C，转速150rpm/min。2.1.2.3小球藻纯化方法小球藻纯化方法采用先稀释涂布平板法再平板划线分离培养法。利用无菌水将微藻稀释一定浓度，平板涂布法培养4-6d后，挑取微藻单菌落进行平板划线分离培养。分离3-4代后可获得纯藻单菌落，转接到斜面培养基扩大培养，于4℃冰箱保存。2.1.3实验仪器实验所用的主要仪器如表2.1所示。表2.1实验仪器Table2.1Experimentalapparatus名称型号生产厂家电子分析天平QUINTIX224-1CN赛多利斯科学仪器有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE上海博讯实业有限公司医疗设备恒温培养振荡器ZWY-240上海智城分析仪器有限公司厂手提式灭菌器SYQ-DSX-280B上海申安医疗仪器有限公司数控超声波清洗器KQ2200DE昆山市超声仪器有限公司pH计PHS-25上海精科仪器有限公司冷冻真空干燥机Pilot1-2LD博医康仪器有限公司紫外可见分光光度计UV2800舜宇恒平LED灯—飞利浦高速冷冻离心机TGL-16M上海卢湘仪混匀小精灵MIX900杭州奥盛仪器有限公司可视氮吹仪KD200杭州奥盛仪器有限公司荧光显微镜EVOS美国AMGCOD快速测定仪B-3c(V8)连华科技有限公司TOC测定仪TOC-LCPH/CPN日本岛津有限公司红外光谱分析仪Avatar360美国Nicolet三维荧光光谱仪FP-6500日本JASCO10\n第2章实验材料与方法2.1.4实验试剂实验所用的主要试剂与材料如表2.2所示。表2.2实验主要试剂与材料Table2.2Experimentalchemicalsandmaterials名称性质生产厂家硝酸钠分析纯天津市光复精细化工研究所磷酸氢二钾分析纯天津市光复精细化工研究所七水合硫酸镁分析纯国药集团化学试剂有限公司七水合氯化钙分析纯天津市博迪化工有限公司碳酸钠分析纯北京化工厂柠檬酸分析纯沈阳市东兴试剂厂柠檬酸铁铵分析纯北京化工厂硼酸分析纯天津市光复精细化工研究所氯化锰分析纯天津市光复精细化工研究所硫酸锌分析纯国药集团化学试剂有限公司钼酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司五水合硫酸铜分析纯国药集团化学试剂有限公司硝酸钴分析纯国药集团化学试剂有限公司牛肉浸膏分析纯天津市光复精细化工研究所蛋白胨分析纯国药集团化学试剂有限公司氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司琼脂分析纯国药集团化学试剂有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯国药集团化学试剂有限公司酵母膏分析纯天津市光复精细化工研究所氢氧化钠分析纯天津市光复精细化工研究所甲醛分析纯国药集团化学试剂有限公司蒽酮分析纯国药集团化学试剂有限公司氯仿分析纯国药集团化学试剂有限公司溴化钾光谱纯国药集团化学试剂有限公司Folin-酚试剂盒分析纯上海生工试剂有限公司11\n第2章实验材料与方法2.2实验分析方法在研究过程中主要涉及三个方面的分析方法，分别为生物分析法、化学分析法以及光谱分析法。2.2.1生物分析法2.2.1.1微藻生物量浓度藻菌共培养体系和纯藻体系培养结束后于500mL量筒静沉5min,分别记录微藻沉淀体积和上清液体积。沉淀藻细胞和上清液藻细胞通过玻璃钎维膜收集（孔径0.45mm，直径47mm）,用蒸馏水洗涤3-5次，于105°C恒温干燥箱干燥直至恒重。测量藻细胞重量。2.2.1.2微藻絮凝效率微藻絮凝效率公式如下：A×V微藻絮凝效率(%)(1)=×100……………………………………….(2.1)A×V+B×V12其中，A为沉淀藻细胞浓度，B为上清液藻细胞浓度，V1为沉淀液体积，V2为上清液体积。2.2.1.3胞外聚合物提取与检测胞外聚合物提取采用甲醛-强氧化纳法，取10mL混合液加入60µL甲醛溶液于4oC条件下混合搅拌30min,再加入4mL浓度为1mol/LNaOH溶液于4oC条件下混合祭敖包90min，混合后10000rpm/min离心20min，取上清液，通过0.45µm聚酯纤维滤膜，利用HCl/NaOH调节pH至中性[55]。多糖、蛋白质浓度检测分别采用蒽酮比色法及Folin-酚法[56]。2.2.1.4高通量测序分析生物群落结构分析利用聚合酶链反应扩增和高通量测序技术（Hiseq2500,Illumina）。样品DNA的制备按照土壤基因组快速抽提试剂盒（OMEGA土壤提取试剂盒）提取基因组。PCR扩增利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量,以确定PCR反应应加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合了Miseq12\n第2章实验材料与方法测序平台的V3-V4通用引物。341F引物（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R引物（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。再经过第二轮扩增。定量混合利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量,以方便按照1：1的等量混合后测序。2.2.2化学分析法2.2.2.1化学需氧量和总氮测定采用COD快速测定仪检测水质中的COD浓度。采用TOC测定仪检测水质中TN浓度。2.2.2.2油脂提取与测定微藻油脂提取与测定采用氯仿-甲醇法，将藻液于-80°C冷冻真空干燥机冷冻干燥，形成松散的藻粉。取0.3g干藻粉装置试管中，加入27mL5%NaCl溶液，4oC冰水浴超声5min，加入45mL的氯仿-甲醇混合液（v/v2:1），于混匀仪900rpm/min条件下混匀3min,再加入15mL甲醇，混匀仪900rpm/min条件下混匀3min,混匀后的样品在9000rpm/min条件下4oC离心10min，收集氯仿层，上述过程重复两次。将收集后的氯仿层，利用氮吹仪60oC条件下氮吹30min，称重测油脂含量。油脂容量计算方法：M1油脂容量(%)=()×100……………………………………………………….(2.2)M2其中，M1为油脂重量，M2为总微藻重量。2.2.3光谱分析法2.2.3.1扫描电子显微镜分析扫描电镜（ScanningElectronMicrocope，SEM）用于观察藻菌颗粒和藻菌絮体表面和内部结构。对于含微生物的样品需要进行预处理。藻菌颗粒和絮体预处理步骤如下：样品用0.1MPBS（pH=7.2）清洗数次后，用2.5%戊二醛固定30min后置于-20oC冰冻保存；再用0.1MPBS漂洗10min；用4.0%的多聚甲醛溶液固定4h；13\n第2章实验材料与方法再用0.1MPBS漂洗2次，每次10min，然后进行梯度脱水：50%、70%、80%、100%乙醇依次梯度脱水1次,每次10min；自然干燥后采用离子溅射仪喷金镀膜（HITACHI，E-1010）。预处理后的样品，即可置于扫描电镜（Akashi-SX-40,USA）下进行观察分析。2.2.3.2三维荧光光谱分析将藻菌和纯藻提取的胞外聚合物用于三位荧光光谱分析（Three-dimensionexcitationemissionmatrixfluorescencespectroscopy，EEM），根据三维荧光光谱中的荧光峰可分析胞外聚合物的组成成分。提取胞外聚合物于0.45μm聚酯纤维滤膜过滤。三维荧光光谱仪发射波长从220-600nm，增长幅度为1nm。激发波长从200-450nm,增长幅度为5nm。通常情况下，天然环境中各种溶解有机质激发/发射（Ex/Em）荧光峰的位置可以归纳为：Ⅰ区：Ex/Em（<250nm/280-330nm）；Ⅱ区：Ex/Em（<250nm/330-380nm）Ⅲ区：Ex/Em（<250nm/>3380nm）；Ⅳ区：Ex/Em（>250/<380nm）；Ⅴ区：Ex/Em（>250nm/>380nm）。其中，Ⅰ区和Ⅱ区为芳香族蛋白峰，Ⅲ区为富里酸类荧光峰，Ⅳ区为可溶性微生物产物荧光峰，Ⅴ区为腐殖酸类荧光峰[56]。2.2.3.3傅里叶红外光谱分析傅里叶变换红外光谱可对藻菌聚集颗粒和絮体样品中的有机官能团进行分析。样品用量约为5mg,预处理方法为-80°C真空干燥箱冷冻干燥，获得干藻粉，藻粉与光谱纯KBr按质量百分比为1:100放入石英研钵中研磨混合。傅里叶红外光谱分析仪（Avatar360,Nicolet,USA）扫描分析，波数范围500-4000cm-1，纯KBr作为背景吸收峰。14\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量3.1响应面模型的实验设计为了优化生物絮凝菌对微藻絮凝效率和油脂容量条件并研究主要因素之间可能存在的交互作用，本小节采用较为常用的响应面法（ResponseSurfaceMethodology,RSM）优化实验。响应面法的基本思路是通过一系列确定性实验，拟合成多项式函数方程式，用来近似隐式极限状态函数。在合理选取试验点后，进行合适地迭代，这样使得多项式函数能在失效概率上收敛于真实的隐式极限状态函数的失效概率，并通过多元二次回归方程来确定多项式函数方程，同时得到多项式中的各项系数。若失效概率小于0.05，则说明得到的多项式函数方程是有意义的，能较好地近似隐式极限状态函数。响应面法被认为是一种很好的数理统计方法，可以用较少的实验次数获得最优条件以及各因素之间的相互作用的关系，目前也有学者开始采用响应面法优化微藻絮凝效率[21]。中心复合设计法(CCD)是响应面法的一种，被用来研究多个因素对系统的影响以及多因素之间的交互作用。中心复合设计法建立的模型所含的变量数通常在26个之间，每个变量需要5个水平，分别是：低值点(1)，高值点(+1)，中值点(0)，极低值点(α)和极高值点(+α)(在本研究中为2和+2)。每个变量实际值将按照从小到大顺序编码为2,1,0,1,2。在本次研究中，选取菌藻比（BacteriaChlorellaration,B/C），有机物浓度即葡萄糖浓度（GlucoseConcentration,Cglucose,g/L），共培养时间（Co-cultureTime,T,d）作为所考察优化的系统变量（自变量），响应值（因变量）为微藻的絮凝效率和油脂容量。为方便书写，上述三个自变量在以下涉及的方程及表格中均简写为B/C、Cglucose、T。三个自变量的实际值与编码值如表3.1所示，表3.2为实验设计方案。根据响应面法，自变量与响应值之间的函数关系采用下面的二次模型来表示：Y1（%）b0biXibiiXi2bijXiXj3.1)Y2（%）b0’b’’’’2b’’’'3.2)iXibiiXiijXiXj15\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量其中Y1和Y2是响应值，本次研究中为微藻的富集效率和油脂容量，b0是常数，bi是单因素变量Xi（i=1,2,3，在本次研究中分别代表B/C,Cglucose,T）的线性系数，bii是单因素Xi的二次项系数，bij是交叉项变量Xi和X（ji=1,2,3和j=1,2,3）的线性系数，ε是残余项。Design-ExpertV8.05被用来进行试验的设计以及实验数据的回归分析，Analysisofvariance（ANOVA）被用来对方程3.1和方程3.2中的每一项进行置信度分析，以及用来分析所得回归模型与实际值得匹配度。表3.1所考察因素的实际值与编码值Table3.1LevelsofinvestigatedvariablesintheexperimentRangesandlevelsVariables21012B/C0.00.10.20.30.4Cglucose(g/L)01234T(d)05101520注：生物絮凝菌F2的接种比固定为5%（v/v）。16\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量表3.2实验设计表格Table3.2TheexperimentaldesignRunX1X2X3B/CCglucose(g/L)T(d)1-1-1-10.11.052-1-110.11.01531-1-10.31.0541-110.31.0155-11-10.13.056-1110.13.015711-10.33.0581110.33.01590-200.20.010100200.24.01011-2000.02.010122000.42.0101300-20.22.00140020.22.020150000.22.010160000.22.010170000.22.010180000.22.010190000.22.010200000.22.01017\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量3.2响应面模型优化及分析表3.3列有响应面法实验结果，根据实验实际的微藻絮凝效率和油脂容量结果，通过模型预测出微藻絮凝效率和油脂容量结果。通过软件DesignExpert建立二次模型，得到二次多项式方程3.3和3.4，二次模型系数均通过多项式回归分析获得。Y1(%)=+39.95-3.19X1-3.98X2+3.78X3+9.43X1X2+0.40X1X3+0.03X2X3-8.25+13.05-6.19……………………………………………………………………………………….(3.3)Y2(%)=-21.82+0.73X1-1.11X2+3.34X3-1.42X1X2-0.43X1X3-1.38X2X3+0.94-0.234.36…….………………………………………………………………………………………(3.4)表3.4和表3.5显示为响应面法二次模型误差分析数据，“Prob>F”值小于0.05，则表明模型参数在统计学上是显著的，由表3.4和表3.5可知微藻的絮凝效率和油脂容量Model的“Prob>F”值分别为0.0212和0.0013，说明Model即模型对响应值微藻的絮凝效率和油脂容量的影响在统计学上是显著的，仅有2.12%和0.13%的概率是由随机误差产生的。“F-value”值越高说明模型的有效度越好，微藻的絮凝效率和油脂容量的“F-value”值分别为3.98和8.46，表明模型拟合度较好。ANOVA分析认为该响应面模型是有效的。微藻的絮凝效率和油脂容量的实际值与预测值拟合图见图3.1。实际值与预测值拟合的R2值分别为0.7817和0.8711，R2值也代表方程3.3和3.4的实际值与预测值，说明絮凝效率和油脂容量模型在结果上具有78.17%和87.11%一致性。表明二次模型预测值与实际值间的拟合度是较高的。IsaMH等人研究认为R2值越接近1，模型拟合度越接近实际数据[57]。且由图3.1可以看出预测值与实际值数据匹配良好，表明二次模型是可靠的，该响应面模型成立。18\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量表3.3响应面法实验结果Table3.3TheresultsofRSMexperimentsRunX1X2X3B/CCglucose(g/L)T(d)Y1(%)Y2(%)1-1-1-10.11.0570.013.72-1-110.11.01563.618.231-1-10.31.0526.114.741-110.31.01531.226.45-11-10.13.0536.913.16-1110.13.01540.621.0711-10.33.0540.617.381110.33.01535.914.690-200.20.01075.624.7100200.24.01065.219.911-2000.02.0100.2024.7122000.42.01019.726.51300-20.22.000.23.4140020.22.02032.117.8150000.22.01040.621.6160000.22.01041.421.5170000.22.01038.822.2180000.22.01039.120.1190000.22.01042.522.8200000.22.01039.222.519\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量表3.4微藻絮凝效率回归模型及其误差分析Table3.4Analysisofvariance(ANOVA)forresponsesurfacequadraticmodelformicroalgaeflocculationefficiencySourceSumofSquaresDfMeanSquareF-valueProb>FRemarksModel5719.969635.553.980.0212SignificantX1139.911139.910.880.3715X2216.481216.481.350.2715X3195.231195.231.220.2950X1X2711.211711.214.450.0611X1X31.3111.310.010.9296X2X30.0110.010.000.99411014.2211014.226.350.03042442.5712442.5715.280.0029551.411551.413.450.0929Residual1598.2810159.83Lackoffit1587.595317.52148.50<0.0001SignificantPureerror10.6952.14Cortotal7318.241920\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量表3.5微藻油脂容量回归模型及其误差分析Table3.5Analysisofvariance(ANOVA)forresponsesurfacequadraticmodelformicroalgaelipidcontentSourceSumofSquaresDfMeanSquareF-valueProb>FRemarksModel510.95956.778.460.0013significantX17.2417.241.080.3233X216.77116.772.500.1450X3152.611152.6122.750.0008X1X216.23116.232.420.1509X1X31.4611.460.220.6511X2X315.25115.252.270.162612.75112.751.900.19810.7710.770.110.7425273.841273.8440.81<0.0001Residual67.09106.71Lackoffit62.44512.4913.420.0064significantPureerror4.6550.93Cortotal578.041921\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量图3.1微藻絮凝效率（a）和油脂容量（b）实际值与预测值对比图Fig.3.1Theactualandpredictedformicroalgae(a)flocculationefficiencyand(b)lipidcontent22\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量3.3生物絮凝菌对微藻絮凝效率优化aCglucose/g/Lb图3.2自变量B/C与Cglucose（T为10d）（a)和自变量B/C与T（Cglucose为2.0g/L）（b）对微藻絮凝效率的影响的响应面三维图Fig.3.2ThecombinedeffectofB/CandCglucoseonmicroalgaeflocculationefficiencyatconstantT(10d)(a),thecombinedeffectofB/CandTonmicroalgaeflocculationefficiencyatconstantCglucose(2.0g/L)(b)23\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量为将考察因素及其交互作用对响应值的影响可视化，通过DesignExpert软件将方程3.3绘制成三维响应面图（图3.2），由于响应面法含有三个考察因素，因此需要将某个考察因素固定（本文将考察因素固定在0水平），考察其他两个因素对于系统响应值的影响。图3.2（a）表示固定共培养时间T为10d条件下，B/C和Cglucose对微藻絮凝效率的影响的响应面模型图。当B/C从0.10增加到0.25时，微藻絮凝效率从40.0%增加到45.0%。但是当B/C继续增加到0.3时，絮凝效率逐渐开始降低。因此在B/C为0.22，Cglucose为3.0g/L条件下，絮凝效率达到最高值（50.0%）。而Cglucose为2.0g/L条件时，絮凝效率最低。当Cglucose继续增加或者降低条件下，可以提高微藻的絮凝效率。图3.2（b）表示固定Cglucose为2g/L条件下，B/C和T对微藻絮凝效率的影响。当T从5d增加到12d时，絮凝效率从16.0%急剧增加到34.0%。在T达到12d时微藻絮凝效率达到最大值。然而，在B/C为0.1时，T持续增加到15d条件下，絮凝效率缓慢降低到32.0%。综合图3.2（a）结果，Cglucose在1.0g/L或者3.0g/L，B/C维持在0.15-0.25条件下，微藻絮凝效率高于42.5%。因此，生物絮凝菌强化微藻的絮凝的最佳条件为：B/C为0.15-0.25,Cglucose低于1.5g/L或者高于2.5g/L，T为9-14d。目前，金属离子例如铝离子或者铁离子广泛应用于微藻富集技术中。然而金属离子仍然残留于生物质中，严重影响油脂提取质量[11]。生物絮凝菌是一种典型的环境友好型功能菌。一方面，它可以有效的避免传统絮凝剂带来的不利影响。另一方面，生物絮凝菌可以通过新陈代谢作用去除并转移一些难降解的或者复杂的物质，生成小分子物质供给微藻同化利用[58]。在本研究中，纯藻显示的絮凝效率仅仅为0.2%，是不具备絮凝功效的。生物絮凝菌（F2,Rhizobiumradiobacter）能够有效的富集微藻，絮凝效率达40.0-50.0%。进一步确定了生物絮凝菌在微藻的富集起到了关键作用。之前的研究发现，生物絮凝菌RhizobiumradiobacterF2是由多糖和蛋白质组成的。多糖浓度为1865μg/mL（82.4%,w/w）,蛋白质浓度为399μg/mL（17.6%,w/w）,并进一步确定生物絮凝菌F2多糖成分是由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成[59]。多糖平均分子重为4.79×105Da。红外光谱和X射线光电子能谱结果显示，多糖中含有羧基、羟基和氨基，能够产生絮凝的作24\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量用[60]。因此生物絮凝菌F2通过产生大分子胞外聚合物，从而利用架桥的作用絮凝微藻[61]。3.4生物絮凝菌对微藻的油脂容量优化abCglucose/g/L图3.3自变量Cglucose与T（B/C为0.2）（a）和自变量B/C与Cglucose（T为10d）（b）对油脂容量的影响的响应面三维图Fig.3ThecombinedeffectofCglucoseandTonmicroalgaelipidcontentatconstantB/C(0.2)(a),thecombinedeffectofB/CandCglucoseonmicroalgaelipidcontentatconstantT(10d)(b)25\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量通过DesignExpert软件将方程3.4绘制成三维响应面图（图3.3），图3.3（a）表示Cglucose和T在B/C固定为0.2条件下对油脂容量的影响。图3.3（b）表示B/C和Cglucose在T固定为10d条件下对油脂容量的影响。随着Cglucose和T的变化，油脂容量变化范围从4.8-23.9%。由图可以看出T的变化对油脂容量变化具有显著影响。当T增加时，油脂容量迅速增加，当T达到12d时，油脂容量达到最大值为24.0%。相反，当超过12d时，油脂容量逐渐下降。而B/C对油脂容量影响较小，B/C和油脂容量呈现轻微的抛物线关系。然而，当B/C和Cglucose共同作用时，对油脂容量的累积有着非常明显的作用，在低浓度Cglucose和较高的B/C，油脂容量可以达到最大值为25.8%（见3.3（b）标记部分）。通常来说，在营养条件匮乏情况下，例如较高B/C（0.2–0.3），较低Cglucose（不超过2.0g/L），T为9-14d时，富集的微藻生物量累积的油脂容量可以得到强化。因此，在上述条件下，微藻油脂容量超过21.0%。研究者ZhangTY等人发现微藻-细菌聚集情况下经过培养条件的优化，油脂容量可以达到14.8–20.5%[32]。然而，在本研究中，利用响应面模型法优化培养条件，可以强化油脂容量达到25.8%。一般来说，由于细菌可以与微藻竞争营养物质，从而不利于微藻油脂容量的累积，因此细菌污染在异养培养微藻情况下是需要及时消除的。这是因为，营养物质足够丰富的情况下，与微藻相比细菌凭借快速生长的优势占据主导地位。然而在本研究中，微藻的生物量在油脂容量最优条件下高于其它条件20-50%。在常规培养条件下（即B/C为0.1–0.2,Cglucose为2.0g/L,T低于9d），油脂容量的变化范围为4.8–16.2%。在营养物质匮乏条件下，油脂容量迅速增加到21.0–25.8%（即B/C为0.2–0.3,Cglucose不超过2.0g/L,T为9–14d）。在营养物质最匮乏条件下油脂容量达到最大为25.8%（即B/C为0.3,Cglucose为1.0g/L,T为12d）。这是因为当营养物质受到限制或者接近匮乏时，微藻对碳吸收和积累持续转化为油脂[1]。3.5生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量共优化基于以上生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量的优化结果，可以得出微藻絮凝效率和油脂容量的共优化条件：即B/C为0.20–0.25,Cglucose不超过1.5g/L,T为9–14d。26\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量由于细菌的过量生长和微藻生物量的降低，因此微藻和细菌的竞争对于异养共培养是一个非常严重的问题。本研究发现，微藻的生长周期高于细菌的生长周期，这是因为细菌需要更多的营养物质来供给自身生长和繁殖，然而过量生长易受到营养匮乏的限制。在Cglucose为2g/L,T为10d培养条件下，纯藻（B/C为0）的生物量为菌藻共生体（B/C为0.2）的微藻生物量8倍。因此说明生物絮凝菌R.radiobacterF2严重抑制微藻细胞的生长，生物絮凝菌抑制藻类有多种途径，例如可能通过产生生长抑制剂等物质，或者影响胞外酶的合成系统或者彼此竞争营养物质[62-63]。在本研究中，生物絮凝菌对微藻生物量的抑制可能为初始阶段两生物之间对营养物质的竞争。当微藻细菌共培养条件为B/C为0.2，Cglucose为2g/L,T为20d，微藻细胞浓度可以增长8%，暗示了当培养条件到达营养物质匮乏阶段，微藻不再过多受生物絮凝菌的抑制作用。然而，在微藻-生物絮凝菌共培养的营养匮乏阶段，微藻的油脂容量的累积高于纯藻的油脂容量累积。因此调节生物絮凝菌F2和微藻的共培养条件，可以减弱两者的竞争情况。例如可以通过延长培养时间或者降低有机物浓度来控制生物絮凝菌的饥饿状态。降低菌藻比可以限制细菌的生长和繁殖。另一方面，生物絮凝菌可以有效的避免传统絮凝剂对油脂提取和油脂质量的影响。更重要的是，生物絮凝菌有着很快的生长速率，具备净化水质的能力，例如去除有毒污染物质和重金属，从而保护微藻的生长和代谢[63]。而微藻也可以供给生物絮凝菌氧气，节约曝气费用。提供其它胞外富含碳的分泌物，促进生物絮凝菌生长。因此，微藻和生物絮凝菌共培养可以强化微藻的富集和提高油脂容量，调节共培养条件使得微藻-生物絮凝菌成为一个互惠互利的共生体系。3.6小结本研究通过响应面模型优化在合成废水中微藻（Chlorellavulgaris）和生物絮凝菌（F2,Rhizobiumradiobacter）共培养条件，以期提高微藻的絮凝效率和油脂容量。从而得出微藻絮凝效率和油脂容量的共优化条件：即B/C为0.20–0.25,Cglucose不超过1.5g/L,T为9–14d。微藻絮凝效率可以达到45.0–50.0%，微藻油脂容量超过21.0%。生物絮凝菌是一种环境友好型功能菌，可以有效避免传统化学生物絮凝剂带27\n第3章基于响应面模型法优化生物絮凝菌对微藻的絮凝效率和油脂容量来的不利影响。本研究针对微藻富集和微藻油脂提供新思路，确定生物絮凝菌在微藻生物富集技术中的前景。28\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理4.1探究水力条件对微藻的富集与废水处理的影响实验室中的小球藻（C.regularis）在长期连续的异养培养条件下出现共生菌群，形成微藻-细菌共生体。水力剪切力对颗粒形成速度、微生物结构和工艺稳定性影响显著，被认为是形成颗粒化最重要的影响因素之一49。因此探究不同水力条件对微藻富集的影响。分别探究静止（0rpm/min）、较弱水力条件（80rpm/min）、较强水力条件（150rpm/min）培养条件下，对微藻-细菌共生体系的影响。培养时间为48h，每隔24h通入氧气，保证体系内氧气含量一致。探究不同水力条件下对微藻的絮凝效率、微藻生物量废水处理效的影响。4.1.1探究水力条件对微藻的富集和生物量的影响不同水力条件下对微藻的絮凝影响见图4.1和图4.2。不同培养时间、不同水力条件条件下藻菌重力沉降图见图4.1。由图4.1（a）可以看出，藻菌共生体接种初期具备一定的絮凝效率，5min静沉后，一部分藻菌颗粒或者絮体沉降在量筒底部。经过24h培养后，不同水力条件下（即150rpm/min、80rpm/min、0rpm/min）均具备非常良好的絮凝效能（图4.1（b））。上清液清澈透明，绝大部分的藻菌共生体沉降在量筒底部，说明24h的絮凝能力最佳。经过48h培养后，由量筒内的颜色可知，150rpm/min条件下藻菌共生体生长最迅速，其次是80rpm/min，0rpm/min条件下微藻生长最缓慢。48h培养后，经过5min静沉发现，150rpm/min水力条件下的上清液颜色比其它条件偏绿。可能是因为藻菌共生体生长量过高。由图4.2不同水力条件对藻菌共生体絮凝效率的影响可以明显看出，藻菌共生体具有非常强的絮凝能力。在0h培养初期，不同水力条件下的絮凝效率大体一致，絮凝效率均为55.50%。经过24h培养周期后，不同水力条件下藻菌共生体的絮凝效率均有所增加，但是150rpm/min条件下的絮凝效率最佳（96.40%），80rpm/min和0rpm/min条件下的絮凝效率为81.71%和81.19%。经过48h培养周期，150rpm/min水力条件下的絮凝效率均有所下降，降低至86.65%。而80rpm/min和0rpm/min条件下絮凝效率小幅度增加为82.13%和87.60%。虽然在150rpm/min水29\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理力条件下絮凝效率有所下降，但总体来说，藻菌共生体具备优良的絮凝效能。0min1508005min150800a0h0min1508005min150800b24h0min1508005min150800c48h图4.1不同水力条件下藻菌重力沉降图：培养0h（a）;培养24h（b）;培养48h（c）Fig.4.1GravitysettlingforABintheculturetimeof0h(a),24h(b)and48h(c)30\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理图4.2不同水力条件对藻菌共生体絮凝效率的影响Fig.4.2Theeffectofharvestingefficiencyunderdifferenthydraulicconditions/LmgBiomass/图4.3不同水力条件对藻菌共生体生物量的影响Fig.4.3Theeffectofalgaeunderdifferenthydraulicconditions由图4.3不同水力条件对藻菌共生体生物量的影响可知，藻菌共生体接种的生物量大体一致，沉淀液的生物量浓度高于上清液生物量浓度，经过24h培养，150rpm/min和80rpm/min水力条件下，微藻生物量浓度快速增长，且生物量浓度高于0rpm/min水力条件。经过48h培养周期，虽然150rpm/min水力条件下的絮凝效率有所下降，但经过48h培养后，该水力条件下微藻的生物量得到大幅度增长，沉淀液的生物量浓度为7108.00mg/L,150rpm/min条件下的生物量浓度是8031\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理rpm/min和0rpm/min水力条件下的生物量浓度1.8-2.3倍。因此较高的水力条件（即150rpm/min）下，可获得最佳的微藻富集效率和生物量。4.1.2探究水力条件对废水处理效能的影响a/Lmg%/removal/CODCODconcentrationb/Lmg/DOconcentration图4.4不同水力条件对废水处理效能影响:COD变化（a）；DO变化（b）Fig.4.4Theeffectofwastewatertreatmentdifferenthydraulicconditions:thevariationofCOD(a)andthevariationofDO(b)由图4.4（a）藻菌共生体系COD变化可知,初始体系中的COD浓度为4575.00mg/L,经过24h培养周期后，不同水力条件均对COD具有一定的去除能力，15032\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理rpm/min对COD的去除能力最佳，COD的去除率为35.84%。80rpm/min和0rpm/min对COD的去除率分别为28.94%和16.43%。经过48h培养周期，150rpm/min对COD去除进一步提高，而80rpm/min和0rpm/min对COD去除率有所下降。150rpm/min条件下的COD去除率为77.96%，高于80rpm/min和0rpm/min条件下COD去除率40.46%和54.97%。因此较高水力条件（即150rpm/min）对废水处理效能最佳。由图4.4（b）藻菌共生体系中的DO变化情况可知，间隔24h通入氧气，保证不同水力条件下的溶解氧一致，且藻菌共生体系得到充足的氧气用于自身的生长和代谢。初始未通入氧气前，体系DO浓度为8.11mg/L,通入氧气后，体系内DO浓度为20mg/L左右。经过24h培养周期后，150rpm/min的耗氧量最低，DO浓度为14.2mg/L,其次是80rpm/min（DO浓度为9.21mg/L）,0rpm/min水力条件下的耗氧量最多，DO浓度为5.94mg/L。之后通入氧气，各体系的DO浓度大致为21mg/L,经过48h培养周期后各培养体系耗氧量与24h耗氧量趋势相反，150rpm/min耗氧量最大，DO浓度为6.69mg/L,其次是80rpm/min，DO浓度为8.9mg/L,0rpm/min水力条件下的耗氧量最低，DO浓度为10.96mg/L。这可能是因为150rpm/min水力条件需要更多氧气用于自身的生长，提高微藻的生物量浓度，同时加强对废水COD的去除。4.2基于藻菌共生体系对微藻的富集和废水处理的强化作用利用上一节的水力条件（即150rpm/min），不通入氧气条件。微藻-细菌共培养48h,采用BG11培养基，葡萄糖浓度为5g/L,接种比为10%（v/v），以纯化后的小球藻（PA）作为参照。探究微藻-细菌共生体（AB）对微藻的富集效率，微藻生物量，水质污染物的去除过程。4.2.1基于藻菌共生体系强化微藻的富集与生长藻菌共生体和纯藻的重力沉降图见图4.5。图4.5（a）为藻菌共生体和纯藻在培养时间为0h、24h、48h的初始状态。我们可以清晰的看到大量的微藻絮体和颗粒悬浮于藻菌共生体的量筒中（AB0/AB24/AB48）。然而，纯藻的量筒却非常透明清澈，具有少量的絮体和颗粒物。更重要的是大多数的微藻絮体和颗粒仅在5min后沉降于量筒底部（见图4.5（b））。尤其是藻菌共生体在培养时间为33\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理24h后的上清液呈现出最清澈状态，说明了藻菌共生体在培养24h后具有最佳的沉降性能（AB24）。相反，纯藻在培养时间0h、24h、48h（PA0/PA24/PA48）后，沉降5min几乎没有任何变化。0minAB0AB24AB48PA0PA24PA48a5minAB24AB48PA0PA24PA48bAB0图4.5藻菌共生体和纯藻分别在培养时间为0h,24h,48h的初始状态（a）和重力沉降5min后的状态（b）Fig.4.5GravitysettlingforABandPAattheinitialstate(a)andafter5minutesstate(b)intheculturetimeof0h(AB0/PA0),24h(AB24/PA24)and48h(AB48/PA48)34\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理aHarvestingefficiency/%Co-culturetime/hb/L/mgBiomass图4.6藻菌共生体和纯藻的絮凝效率（a）和生物量（b）Fig.4.6Harvestingefficiency(a)andalgaebiomass(b)ofABandPA图4.6（a）的藻菌共生体和纯藻的絮凝效率进一步说明了藻菌共生体显示出非常良好的富集能力。纯藻的富集效率维持在4-5%，几乎不具备絮凝性能。当培养24h后，藻菌共生体的絮凝效率从53.55%迅速增加到88.72%。当培养时间提高到48h后，絮凝效率下降到68.64%。虽然当培养时间继续增加后，微藻的絮凝效率有所下降，但是微藻的生物量仍然继续增加（见图4.6（b））。藻菌共生体中的大部分生物量聚集在沉淀液中。当培养时间由0h增加到24h时，微藻的生物量浓度从1106.67mg/L迅速的增加到7406.06mg/L。微藻在24h的生物量浓度几乎为0h生物量浓度7倍。当培养时间为48h,微藻生物量浓度逐渐增加到35\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理8205.00mg/L。而纯藻的生物量持续低于藻菌共生体中的微藻生物量。整个培养周期48h，纯藻的生物量浓度由216.67mg/L提高到2134.17mg/L。因此藻菌共生体具备良好的富集效能，同时能够大幅度提升微藻生物量。4.2.2基于藻菌共生体强化废水处理效能4.2.2.1COD和TN的变化a/Lmg//%CODremovalCODconcentrationCo-culturetime/hb/Lmg//%removalTNTNconcentrationCo-culturetime/h图4.7藻菌共生体和纯藻体系中的水质COD（a）和TN（a）变化Fig.4.7VariationofCOD(a)andTN(b)inABandPA图4.7为藻菌共生体和纯藻体系中的水质COD和TN浓度变化情况。由于培养基中P元素浓度极低，培养基中的P元素浓度为11.47mg/L，所以不考虑P元素的变化情况。在整个48h藻菌共生体系培养过程中，COD浓度由4931.3336\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理mg/L降低到411.23mg/L，去除效率达91.66%。然而，整个48h纯藻培养过程中，COD浓度由4881.00mg/L降低到1961.33mg/L。去除效率为59.92%。藻菌共生体系中的水质COD去除率比纯藻体系水中的COD去除率高31.74%。同样，在整个48h藻菌共生体系培养过程中，TN浓度由331.47mg/L降低到157.99mg/L。TN的去除效率为52.34%。整个48h纯藻培养过程中，TN浓度由294.67mg/L降低到187.32mg/L，TN的去除效率为36.86%。藻菌共生体系中TN的去除效率比纯藻TN去除效率高15.48%。因此通过藻菌共生体系和纯藻体系中的COD和TN的去除率结果，阐述了细菌的存在条件下加速水质中的COD和TN的去除，尤其是，细菌对COD去除的贡献度更高。4.2.2.2溶解氧（DO）的变化藻菌共生体系和纯藻体系水质中的溶解氧（DO）变化见图4.8。藻菌共生体系的溶解氧变化幅度较大，初始溶解氧浓度为7.95mg/L，培养12h后，DO浓度略微上升到8.43mg/L，这可能是因为，微藻刚刚适应环境对水中的DO利用率较低，同时水流剪切力的扰动增加了水体中DO的含量，微藻能够利用有机物进行自身的生长，释放氧气。当培养期为24h时，DO急剧下降，降至3.83mg/L，这可能是因为在此阶段微藻和细菌对葡萄糖的利用率很高，大量消耗水质的氧气用于自身的生长和代谢，也因此该时期生物量的生长较初始阶段有了极大的提高。培养36h时，由于代谢、生长减缓，水流剪切力作用等影响下，DO又有所回升达到7.55mg/L，培养48h时，DO浓度又急剧降低到1.17mg/L。纯藻体系DO变化呈现持续降低的趋势，初始DO浓度为6.20mg/L，培养12h时，DO浓度变化不大，为6.07mg/L。随着培养时间的增加，DO浓度持续降低，培养48h后，DO浓度为0.34mg/L。由于藻菌培养体系存在细菌的作用下，使得整个体系的水质中的溶解氧呈现较大幅度的变化。微藻和细菌之间的复杂关系使得水质中的溶解氧变化呈现波动状态。37\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理/Lmg/DOconcentrationCo-culturetime/h图4.8藻菌共生体系和纯藻体系水质中溶解氧的变化情况Fig.4.8VariationofDOinABandPA4.3藻菌体系稳定性分析图4.9序批式条件下的絮凝效率情况Fig.4.9Variationofharvestingefficiencyinsequencingbatchexperiment38\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理ab图4.10序批式条件下的COD（a）和TN（b）去除率情况Fig.4.10VariationofCOD(a)andTN(b)removalinsequencingbatchexperiment探究土著微生物环境下的藻菌体系稳定性能。设计共计7个批次实验，单个批次实验条件采用上一节条件，藻菌共培养48h,采用BG11培养基，葡萄糖浓度为5g/L,接种比为10%（v/v）。运行48h后，检测微藻絮凝效率、培养基中COD和TN的去除效率。图4.9为序批式条件下的絮凝效率情况。我们可以看到1-6次序批式实验的微藻絮凝效率维持在70.00%-80.00%。藻菌共生体系的序批式实验在1-5次实验中均超过75.01%，而第一次序批式实验的絮凝效率最高（79.90%）。而在第5-7次序批式实验后藻菌絮凝略有下降，下降至68.01%。但总体来说，藻-菌共生序39\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理批式实验，微藻絮凝效率比较稳定。图4.10为序批式条件下的COD和TN去除率情况，由图4.10(a)，藻菌共生序批式条件下COD的变化情况可以看出，1-4个序批式实验，藻菌共生体对培养基中的COD的去除效率维持在90.00%以上，呈现出非常良好的稳定性。从5-7次序批式实验可以看出，藻菌共生体对COD的去除效率有所下降，但下降幅度不大。COD的去除率由第五次的87.89%下降至82.89%。可以表明藻菌在后期对COD去除性能有所降低，但总体来说去除特性变化不大。由图4.10（b），藻菌共生序批式条件下对培养基中的TN去除率变化情况可以看出，藻菌共生体对TN去除率一直维持在40.00-46.00%。在整个7次序批式实验，藻菌共生体对TN去除呈现一个小范围波动，总体来说，藻菌共生体对TN的去除率显示出较好的稳定性。藻菌共生体对培养基中的TN呈现小范围波动，对微藻絮凝效率和对培养基中COD的去除率在前批次呈现一定的稳定性，后批次中出现一定程度的下降，但仍然具有很高的絮凝效率和营养物质的去除率，因此藻菌共生体具有较好的稳定性能。4.4小结探究静止（0rpm/min）、较弱水力条件（80rpm/min）、较强水力条件（150rpm/min）培养条件下，对微藻-细菌共生体系的影响。结果表明，无论是静止培养、低转速培养、高转速培养，藻菌共培养体系具备良好的絮凝效率，絮凝效率从55.00%增加到80.00%以上。尤其是较高水力条件（即150rpm/mim条件）絮凝效率在24h培养周期下可以达到96.40%。150rpm/min条件下微藻沉淀液的生物量浓度为7108.00mg/L，是80rpm/min和0rpm/min的生物量浓度1.8-2.3倍。150rpm/min条件下对COD的去除率为77.96%。高于80rpm/min和0rpm/minCOD去除率40.46%和54.97%。因此较高水力条件（即150rpm/min）对微藻富集与废水处理效能最佳。因此选择较高水力条件（即150rpm/min）下构建微藻-细菌共培养共生体系并与纯藻体系对比，结果显示，藻菌共生体系在24h絮凝效率达88.72%，纯藻体系几乎不具备絮凝效率（絮凝效率为4.54%）。在24h和48h培养周期下，藻菌共生体系的微藻生物量可达7406.06mg/L和8205.00mg/L。40\n第4章基于藻菌共生体系优化微藻富集和废水处理在48h培养周期下，藻菌共生体系对COD和TN的去除效率分别为91.66%和52.34%，对COD和TN的去除率明显高于纯藻对COD和TN的去除。同时，藻菌共生体具备较好的稳定性能，无论是对微藻的絮凝效率，还是对培养基中的COD、TN的去除率。41\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究5.1藻菌聚集微观结构abcd图5.1扫描电子显微镜图片：藻-菌颗粒（a），藻-菌絮体（b），藻细胞分泌胞外聚合物（EPS）（c），藻细胞之间附着的细菌（d）Fig.5.1SEMimagesofthealgae-bacteriagranules(a),algae-bacteriaflocs(b),EPSstructureattachedbetweenalgaeandalgae(c)andbacteriaattachedbetweenalgaeandalgae(d)图5.1显示藻菌共生体颗粒和絮体的扫描电子显微镜（SEM）图片。由图5.1（a）可以看出藻菌共生体颗粒的尺寸大约为1mm，有些颗粒甚至超过2mm。藻菌共生体絮体尺寸大约为200μm（见图5.1（b））。藻菌共生体颗粒和絮体均由单个藻细胞紧密的聚集在一起。图5.1（c）中，胞外聚合物EPS显示纤维网状结构能够连接藻细胞（见红色标记）。EPS连接藻细胞的结构是非常复杂的。这42\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究个结果与研究者SalimS的发现结果相一致[24]。SalimS等人认为连接着藻细胞表面的EPS的主要成分为蛋白质和多糖。另一方面，藻细胞表面周围附着着大量细菌，显示藻细胞和细菌一起成簇生长（见图5.1（d））。因此EPS和细菌与微藻-细菌的聚集具有相关性。5.2藻菌聚集体胞外聚合物分析5.2.1多糖和蛋白质分析a/Lmg/PolysaccharideconcentrationCo-culturetime/hb/Lmg/ProteinconcentrationCo-culturetime/h图5.2藻菌共生体和纯藻的多糖（a）和蛋白质（b）容量Fig.5.2Polysaccharides(a)andprotein(b)contentsofABandPA藻菌共生体和纯藻的胞外聚合物（EPS）检测数据见图5.2。藻菌共生体和纯43\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究藻的EPS浓度相比较，无论是多糖的浓度还是蛋白质的浓度，藻菌共生体均高于纯藻。藻菌共生体和纯藻的多糖容量见图5.2（a），藻菌共生体在初始培养时期到24h培养时期，多糖的浓度由25.95mg/L迅速增长到265.27mg/L（多糖浓度最大值），之后降低到126.59mg/L。而在整个48h的培养周期内，纯藻的多糖浓度始终低于6.45mg/L。藻菌共生体和纯藻的蛋白质容量见图5.2（b），藻菌共生体的蛋白质浓度趋势和多糖相似。随着培养时间从0h、24h、48h的增长，藻菌共生体的蛋白质浓度由20.67mg/L增加到69.22mg/L又降低到34.89mg/L。同时，在纯藻的整个培养周期中，蛋白质浓度由11.00mg/L增加到16.45mg/L。因此藻菌共生体在多糖和蛋白质浓度的变化上明显高于于纯藻。5.2.2三维荧光光谱分析三维荧光光谱（EEM）具备快速，敏感，有效的特性，可以确定胞外聚合物的有机组分(EOM)。在EOM中，EEM可以确定蛋白质和腐殖酸类物质。不同培养时期，藻菌共生体和纯藻的胞外聚合物的EEM图见图4.7。在整个48h的培养周期中，藻菌共生体有两个主峰，纯藻有一个主峰（见图4.7标记）。藻菌共生体中，在Ⅳ区域内，PeakA与色氨酸或者色氨酸类似物有关（发射波长（Em）为335nm，激发波长（Ex）为280nm）。同时，在Ⅱ区域内，PeakB与芳香族蛋白有关，可能是酪氨酸或者酪氨酸类似物(发射波长（Em）为335nm，激发波长（Ex）为230nm）。然而在纯藻的EEM中，在Ⅰ区域内，PeakC也与芳香族蛋白有关（发射波长（Em）为280-330nm，激发波长（Ex）为200-250nm）[56,65]。从谱图可以明显看出，纯藻中的PeakC与藻菌共生体中的PeakA和PeakB完全不同。藻菌共生体系与纯藻体系相比，色氨酸，色氨酸类似物或者酪氨酸，酪氨酸类似物的芳香族蛋白是藻菌共生体分泌EPS的主要蛋白成分，能够强化微藻的富集过程。小球藻被认为是不具备絮凝特性的藻种，这是因为小球藻分泌很低浓度的EPS[66]。从实验结果上来看，芳香族蛋白（色氨酸和酪氨酸）和多糖作为大分子物质对微藻的富集起到了至关重要的作用。研究者Song认为从C.minutus分泌44\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究的EPS的主要荧光成分为两种芳香族蛋白和一种酪氨酸的的类似物[67]。在蓝藻和细菌生物膜中，蛋白质类似物是EPS中的主要的荧光成分。然而，EPS在异养培养中可以被微生物分解[68,69]。因此细菌的存在可以促进EPS的产生，尤其是芳香族蛋白质。更重要的是，研究者ZhuL等人认为颗粒污泥中的芳香族蛋白质和色氨酸蛋白类似物浓度显著高于污泥絮体中的芳香族蛋白质浓度，因此芳香族蛋白是其保持颗粒污泥结构稳定的重要成分[65]。在本研究中，较强的水力条件下大量的藻菌颗粒和絮体没有被破碎。因此色氨酸和酪氨酸对于藻菌颗粒和絮体的稳定起着重要作用。研究者LiuY等人认为鲑精朊是一种非常有潜力的生物絮凝剂，可以应用于富集微藻技术中[70]。因为鲑精朊富含大量的芳香族蛋白如赖氨酸和精氨酸。而氨酸和精氨酸能够起到絮凝微藻的作用。综上所述，芳香族蛋白（色氨酸、酪氨酸）具备富集微藻的潜能。45\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究abcdef图5.3藻菌共生体的胞外聚合物在不同培养时期三维荧光光谱图:（a）0h;（c）24h;（e）48h，纯菌的胞外聚合物在不同培养时期三维荧光光谱图:（b）0h;（d）24h;（f）48hFig.5.3EEMfluorescencespectraofEPSinABattheculturetimeof:(a)0h;(c)24h;(e)48handEEMfluorescencespectraofEPSinPAattheculturetimeof(b)0h;(d)24h;(f)48h.46\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究5.3傅里叶红外光谱分析图5.5藻菌共生体和纯藻的傅里叶红外光谱图Fig.5.5TheFTIRspectraofABandPA藻菌共生体和纯藻的傅里叶红外光谱图见图5.5。由图可以看出，微藻细胞表面存在着丰富的官能团。本研究发现，藻菌共生体的红外光谱图有两处明显的吸收峰与纯藻不同。在藻菌共生体培养24h和48h时期，1127cm–1处的吸收峰偏移到1153cm–1。而此处吸收峰发生变化是由糖苷键中的CH2-O-CH2官能团发生变化，而糖苷键中的CH2-O-CH2官能团与多糖有密切关系[71]。当微藻和共生菌群结合时，红外吸收峰由1127cm–1偏移到1153cm–1，说明糖苷键的变化影响着多糖物质发生变化。进而影响微藻的絮凝效率。在波长为1053cm–1另一处吸收峰偏移到1024cm–1，此位置上的峰偏移说明氨基发生变化，进一步说明该位置的氨基变化引起蛋白质物质发生变化（如色氨酸和酪氨酸），从而影响着微藻的絮凝[72]。微藻表面的吸收峰1153cm–1和1024cm–1分别代表着糖苷键和氨基组分，从而影响多糖和蛋白质发生变化，多糖和蛋白质的的变化对微藻絮凝起着至关重要的作用。47\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究5.4微生物群落结构分析高通量测序结果可以使我们能够准确的获得样品中更深层次的生物群落多样性。分别检测在0h培养时期时，藻菌共生体沉淀液和上清液样品的生物多样性（ABR0、ABS0），24h培养时期时，藻菌共生体沉淀液和上清液样品的生物多样性（ABR24、ABS24），48h培养时期时，藻菌共生体沉淀液和上清液样品的生物多样性（ABR48、ABS48）。α生物多样性指数见表5.1，可以看出藻菌共生体样品含有丰富的多样性。六个样品的覆盖指数（coverage）从95.25%变化到99.19%。每个样本通过随机抽样的原则被用来估计使用概率抽样的完整性计算[73]。我们利用ACE,Chao1,Simpson指数来分析α多样性指数。ACE,Chao1和Simpson指数越高代表α多样性越高。结果表明细菌群落在藻菌沉淀液（ABR）的生物多样性高于藻菌上清液（ABS）。表5.1微生物群落的α多样性指数Table5.1Alphadiversityofhigh-throughputsequencingforeachsampleSampleSeqOTUCoverage(%)CommunitydiversityIDNumNumACEChao1SimpsonABR01932235298.941488.41812.130.20ABR2418164112995.269042.524405.370.22ABR4818405123495.226919.783951.470.11ABS01973436199.19763.32675.030.11ABS241446835098.95716.87570.690.09ABS481566734699.07698.97562.020.11根据六组不同的样品比较微藻共生细菌的微生物群落。用热图表示在不同培养条件下，六组不同的样品即藻菌沉淀液（ABR）和藻菌上清液（ABS）的微生物群落差异性（见图5.6）。蓝色的生物群落相似性高于红色生物群落。由热图结果显示，在培养时间为0h和培养时间24h，藻菌共生体沉淀液（ABR0和ABR24）48\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究有着最高的细菌群落相似度，随后是培养时间0h和培养时间48h藻菌共生体沉淀液（ABR0和ABR48）的细菌群落相似度。然后是培养时间为0h和培养时间24h的藻菌共生体上清液（ABS0和ABS24）的生物细菌群落相似度。因此藻菌共生体的沉淀液中的细菌群落有着非常高的相似性。藻菌共生体沉淀液（ABR）和藻菌共生体上清液（ABS）的生物群落结构（属水平）见图5.7。不论是ABR还是ABS均具有丰富的群落结构。从高通量测序结果显示，ABR和ABS有200多个细菌，但是本研究重点关注15个主要的细菌。ABR与ABS相比，某些具备特定功能的细菌见表5.2。菌株Sphingomonas（编号1）是ABR中丰富度最高的细菌。其他丰度的细菌依次为菌株Rhizobium（编号2）,菌株Bacillus（编号3）,菌株Brevundimonas(编号4),菌株Roseomonas（编号5）和菌株Bosea（编号6）。Sphingomonas是主要的微生物种类，从培养时间0h到培养时间48h,Sphingomonas丰富度由43.61%变化到26.82%。Sphingomonas在细菌群落有着极高的比例，并且Sphingomonas能够分泌鼠李糖。大部分EPS中的鼠李糖属于Sphingans，Sphingans是由Sphingomonas分泌[74]。同时，Sphingomonas和Brevundimonas能够分泌大量EPS，从而促进微藻沉降和絮凝[20,75]。在ABR中，细菌Bacillus的丰富度由0.75%增长到1.24%，而在ABS中，丰富度由5.34%增长到10.69%。Bacillus的存在条件下可以刺激植物分泌3-4倍的色氨酸[76]。因此色氨酸的增长是由Bacillus菌株引起的，暗示了Bacillus菌株对微藻的富集起到重要作用。菌株Rhizobium能够提高植物的生长，因此菌株Rhizobium可以提高微藻的生物量[20]。另外大部分的细菌能够加速去除COD和TN。包括Brevundimonas、Roseomonas和Bosea菌株[55,77,78]。更重要的是，细菌群落存在某些能够产生蛋白和多糖特定菌株。例如Bacillus,Sphingomonas,Brevundimonas能够分泌色氨酸，鼠李糖和胞外聚合物，这些分泌物对微藻的絮凝做出了重大贡献。在本研究中，Bacillus,Sphingomonas和Brevundimonas菌株对藻菌颗粒和絮体的形成有着积极的作用。傅里叶红外结果显示了细菌的存在改变了微藻的糖苷键和脂环胺基团，从而改变多糖和蛋白质。研究者AnaBarros曾经提出微藻的生物絮凝法的机理主要通过架桥和网补作用，使得藻细胞通过EPS紧密的相连聚集在一起[79]。EPS能够掌控絮体的形成和沉降。因此藻菌聚集机理是通过分泌芳香族蛋白（色氨酸和酪氨酸）和多糖引起的49\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究架桥和网补作用。一般来说，微藻异养培养中细菌污染是需要消除的，因为细菌和微藻竞争营养物质，从而严重影响微藻的生物量。有趣的是，在本研究中，微藻的生物量显著高于其他研究。学者JiangL发现Monoraphidiumspp.SDEC-17是一种高密度生长的藻种，微藻的生物量可以达到1870.00mg/L[80]。研究者SuY等人利用藻-菌共培养收获微藻，微藻的生物量经过32天的培养周期由600.00mg/L增长到1840.00mg/L[44]。在本研究中，藻菌共生体显示出惊人的性能，微藻的生物量仅仅在48h培养后可以达到8205.00mg/L。可能是由于菌株Rhizobium导致生物量快速增长，因此我们可以节约培养资金和时间来收获大量的微藻。更重要的是，细菌生物群落不仅仅可以增加微藻的生物量，还可以加速去除废水中的有机物。在共培养过程中，细菌去除有机物质可以产生二氧化碳，水和其他的营养物质，用于微藻的生长和吸收。因此，微藻和细菌呈现出互惠共生的关系。藻菌共生体对COD的去除率高达91.66%，与纯藻相比，去除率提高了31.74%。这是因为细菌有着非常好的COD去除能力，例如菌株Roseomonas和Bosea。同时，在48h的培养时间，藻菌共生体对TN的去除率高于纯藻对TN的去除率（15.34%）。这是因为Brevundimonas菌株可以吸收N元素[77]。因此微藻可以吸收小分子物质用于自身的生长和代谢，从而提高藻细胞的生物量。另一方面，微藻产生氧气供给细菌，可以减少曝气费用，提供其它的营养物质给细菌生长和代谢。因此细菌群落的存在可以减少微藻的富集费用，替代发酵生物絮凝剂的成本。50\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究图5.6藻菌沉淀液和藻菌上清液的热图分析。颜色代码代表了不同的六个样本细菌群落,其中蓝色(值=0.0)表示相似度最高和红色(值=0.43)表示相似度的最低Fig.5.6HeatmapoftheABRandABScoefficients.Thecolorcoderepresentsthesimilarlyofthesixsamplebacteriacommunities,whereblue(value=0.0)representsthehighestandred(value=0.43)thelowestlevelofsimilarity51\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究图5.7藻菌共生体沉淀液（ABR）和藻菌共生体上清液（ABS）的生物群落结构（属水平）。细菌群落棒显示不同细菌相对丰富度Fig.5.7Thebacterialcommunitystructure(atthegenuslevel)inABRandABS.Bacterialcommunitybarplotshowingtherelativereadsabundanceofdifferentbacterialgenuswithinthedifferentcommunities表5.2藻菌共生体中特定细菌功能Table5.2BacteriafunctioninABNumberBacteriaFunction1SphingomonasSecretingexcessrhamnose;EnhancingEPSproduced2RhizobiumPromotingalgaegrowth3BacillusIncreasingsecretionoftryptophan4BrevundimonasEnhancingEPSproduced;AcceleratingTNdegradation5RoseomonasAcceleratingCODdegradation6BoseaAcceleratingCODdegradation52\n第5章微藻-生物絮凝菌聚集机理研究5.5小结在藻菌共生体系中，微藻的絮凝效率和生物量得到显著的提高。藻菌共生体系中的COD和TN的去除率显著高于纯藻。藻菌共生体中分泌的EPS的主要荧光成分为色氨酸和酪氨酸。由于细菌群落的存在改变了糖苷键和脂环胺基团，从而影响多糖和蛋白质。菌株Bacillus和Sphingobacterium能够分泌色氨酸和鼠李糖。菌株Brevundimonas能够分泌多糖和蛋白质促进微藻的絮凝。综上所述，藻菌的富集机理主要是通过EPS中的芳香族蛋白（色氨酸和酪氨酸）和多糖引起的架桥、网补作用，从而对微藻的富集起到了至关重要的效能。同时菌株Rhizobium提高微藻的生物量，大部分的细菌能够加速去除COD和TN。53\n第6章结论与展望第6章结论与展望6.1结论本研究利用响应面模型优化微藻-生物絮凝菌共培养条件，得到最佳微藻絮凝效率和油脂容量。同时探究水力条件对微藻絮凝效率和废水处理的影响。根据水力条件，构建微藻-细菌共生体系，强化微藻絮凝效率，加速废水去除效能。通过藻菌共培养和纯藻生物表征对比，解析微藻-细菌聚集机理。得出主要结论如下：（1）通过响应面模型优化在合成废水中微藻（Chlorellavulgaris）和生物絮凝菌（F2,Rhizobiumradiobacter）共培养条件，以期提高微藻的絮凝效率和油脂容量。得出微藻絮凝效率和油脂容量的共优化条件：即B/C为0.20–0.25,Cglucose不超过1.5g/L,T为9–14d。微藻絮凝效率可以达到45.0–50.0%，微藻油脂容量超过21.0%。（2）探究静止（0rpm/min）、较弱水力条件（80rpm/min）、较强水力条件（150rpm/min）培养条件下，对微藻-细菌共生培养体系的影响。结果表明，较强的水力条件下对微藻的富集和废水处理均起到强化作用。即150rpm/mim培养条件絮凝效率在24h培养周期下可以达到96.40%，对COD的去除率为77.96%。因此选择较高水力条件（即150rpm/min）下构建微藻-细菌共生体系并与纯藻体系对比，结果显示，藻菌共生体系在24h絮凝效率达88.72%，纯藻体系几乎不具备絮凝效率（絮凝效率为4.54%）。在24h和48h培养周期下，藻菌共生体系的微藻生物量可达7406.06mg/L和8205.00mg/L。在48h培养周期下，藻菌共生体系对COD和TN的去除效率分别为91.66%和52.34%，对COD和TN的去除率明显高于纯藻对COD和TN的去除率。（3）藻菌共生体中分泌的EPS的主要荧光成分为色氨酸和酪氨酸。由于细菌群落的存在改变了糖苷键和脂环胺基团，从而影响多糖和蛋白质。菌株Bacillus和Sphingobacterium能够分泌色氨酸和鼠李糖。菌株Brevundimonas能够分泌多糖和蛋白质促进微藻的絮凝。综上所述，藻菌的富集机理主要是通过EPS中的芳香族蛋白（色氨酸和酪氨酸）和多糖引起的架桥、网补作用，从而对微藻的富54\n第6章结论与展望集起到了至关重要的效能。大部分的细菌能够加速去除COD和TN。6.2展望（1）本论文针对藻菌共生体系处理实验室人工模拟合成废水，建议利用藻菌共生体处理实际废水。（2）本论文的微生物表征测试均是针对藻菌共生体。建议采用一定的方法和手段将微藻和细菌分散开，进行FT-IR、EEM、多糖、蛋白质的分析，从而更能直观的对比说明是细菌、微藻还是两者共同作用导致EPS中的多糖蛋白组分发生变化，从而更进一步揭示微藻-细菌聚集机理。（3）本论文优化共培养条件，得出最佳的微藻富集效率和废水处理效能及油脂容量。但应进一步结合工程实际利用发酵或者连续流反应器进行培养及相关工程参数的确定。55\n参考文献参考文献[1]Perez-GarciaO,EscalanteFM,De-BashanLE,etal.Heterotrophicculturesofmicroalgae:metabolismandpotentialproducts[J].WaterResearch,2011,45(1):11-36.[2]SubashchandraboseSR,RamakrishnanB,MegharajM,etal.Consortiaofcyanobacteria/microalgaeandbacteria:Biotechnologicalpotential[J].BiotechnologyAdvances,2011,29(6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