废水处理污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性 7页

废水处理污泥中邻苯二甲酸酯降解菌的多样性随着塑化剂邻苯二甲酸酯(PAEs)在日用品、建筑材料、医药、化妆品等生产行业的广泛应用，其在环境中的残留、分布及对生态系统的危害被日益关注。据统计，PAEs在全球的年消费量高达680万t，由于PAEs与化合物的结合方式为物理结合，导致其较易释放进入环境，该释放过程可发生于塑料产品的生产、使用和丢弃等过程中。目前，在土壤、河水、海水、沉积物和生物群中均发觉PAEs的存在，其在环境中长期赋存会对生物体产生毒害效应。PAEs中应用较广泛的为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，由于其致癌性、致畸性和致突变性，DBP和DEHP已被美国环境保护署列为优先掌握污染物。土壤、河水、海水甚至饮用水源中的PAEs污染问题和污水的处理、排放亲密相关。目前，中国污水排放标准明确规定了常规生化指标和重金属含量，但PAEs等有机污染物不在其列。因此，即使污水达标排放，PAEs仍会随污水进入水环境系统，并对四周土壤造成污染。7\n在中国，除农用大棚和塑料薄膜的使用可直接导致PAEs污染土壤外，大部分含有PAEs的塑料制品废弃物多通过垃圾堆放、填埋和后期污水处理进入环境。生活、医疗和工业垃圾经过长期堆放后，PAEs可从塑料制品中释放，加上雨水的冲刷进入垃圾渗滤液。包含垃圾渗滤液在内的多种污废水是PAEs的主要汇合场所，因此只有在污水处理环节中有效去除PAEs，才能避免污水排放后PAEs对周边环境的二次污染。污水处理中的生物降解是去除各类有机污染物的关键因素。目前，关于污水处理系统中PAEs降解菌的多样性和PAEs对污水处理系统中微生物群落结构的影响鲜有报道。本研究系统探究了常规废水处理污泥对典型PAEs的微生物群落响应特征和污泥中PAEs降解菌的多样性，为PAEs降解菌的实际应用供应理论依据。一、材料和方法1.1污泥取样废水处理污泥取自X省Y市某污水处理厂的好氧池，该厂长期处理化工和印染废水。新奇污泥样经沉淀和离心去除水分后，4℃保存备用。1.2主要培育基和试剂基础盐培育基:1.00g/LKH2PO4，7.04g/LNa2HPO4•12H2O，0.10g/LMgCl2•6H2O，1mL微量元素母液，pH7.2。微量元素母液:2.1385g/LFeSO4•7H2O，0.1g/LZnSO4•7H2O，0.03g/LMnCl2•4H2O，0.3g/LH3BO4，0.2868g/LCoCl2•6H2O，0.02g/LNiCl2•6H2O，0.03g/LNa2MoO4•2H2O，pH4.0。DBP、DEHP均为色谱级试剂，其他试剂均为分析纯试剂。1.3PAEs降解菌富集培育7\n针对DBP和DEHP分别进行富集培育，每组试验设置：取5g废水处理污泥置于200mL基础盐培育基中，添加100mg/LDBP或DEHP作为碳源，置于30℃、200r/min摇床培育5d，转接至含有400mg/LDBP或DEHP的基础盐培育基中连续培育5d，再连续转接两轮(DBP或DEHP质量浓度梯度为700、1000mg/L)。1.4DNA提取和序列扩增采用十六烷基三甲基溴化铵法对样本的基因组DNA分别进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，样品DNA稀释至1ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，依据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，NewEnglandBiGolabs公司的PhusionHighGFidelityPCRMasterMiXwithGCBuffer和高效高保真酶进行聚合酶链反应(PCR)，确保扩增效率和精确性，PCR扩增引物序列及对应区域见表1。1.5Hiseq测序和数据处理使用Thermofisher公司的IonPlusFragmentLibraryKit48rXns试剂盒构建文库，经过Qubit定量和文库检测合格后，使用IonS5TMXL上机测序，测序数据经过Cutadapt(V1.9.1)进行低质量部分剪切，再截去Barcode和引物序列后，初步得到原始数据，去除原始序列中的嵌合体序列后，得到最终有效数据。1.6数据分析1.6.1可操作分类单元(OTUs)聚类和物种注释7\n利用Uparse软件(Uparsev7.0.1001/)对全部数据进行聚类分析，具有97%及以上全都性的序列归为一个OTUs，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释，获得分类学信息并分别在界、门、纲、目、科、属、种水平统计群落组成。1.6.2组间群落相似性分析基于测序数据和OTUs聚类分析结果，使用Qiime软件计算Unifrac距离，进行非加权组平均法样品聚类分析。使用R软件的ade4包和ggplot2软件包进行主成分分析(PCA)，以反映组间群落相似性，并分别进行参数和非参数检验，检验方法选用Tukey和wilcoX检验。1.6.3菌群丰度和系统发育多样性分析先使用Qiime软件(Version1.9.1)计算菌群丰度指数和系统发育多样性指数。再使用R软件进行菌群丰度和系统发育多样性分析，并分别进行参数和非参数检验，检验方法选用Tukey和wilcoX检验。二、结果与争论2.1DBP和DEHP降解效率试验证明，4轮富集培育后得到的富集菌液对DBP和DEHP的降解效果较佳。富集菌液对DBP和DEHP的降解效率见图1。当DBP和DEHP为1000mg/L时，其在培育第6天的降解率分别达到57.1%和36.0%，经过10d培育后，富集菌液对DBP、DEHP的降解率分别可达99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，与文献全都，而原因是DEHP含有比DBP更复杂的支链结构。7\n据报道，DBP和DEHP的降解均从酯水解开头，形成中间产物单酯(邻苯二甲酸丁酯或邻苯二甲酸乙酯)和相应的醇，单酯进一步被降解成为邻苯二甲酸。由于DEHP两个酯链上各多出一个支链，导致其被降解为单酯的难度增加，是其降解速率比DBP慢的主要原因。2.2污泥菌群丰度及组间群落相似性分析分别取原废水处理污泥(简称RS组)和DBP、DEHP降解菌富集培育后污泥(分别简称DBP、DEHP组)进行Hiseq测序。OTUs聚类分析发觉，DBP、DEHP组中OTUs数量显著低于RS组，DBP、DEHP和RS组的OTUs数量分别为226、273和848，3个样品组共有OTUs数量为205。DBP、DEHP组中分别有90.7%、75.1%的OTUs与RS组中仅24.2%的OTUs重叠。该结果进一步表明，富集培育过程中，DBP和DEHP的添加使废水处理污泥中的微生物多样性显著降低。本研究进一步对OTUs代表序列进行了物种注释和组间群落相似性分析，基于OTUs水平的PCA见图2。样品的群落组成越相似，则它们在PCA中的距离越接近。DBP、DEHP组物种组成相似性较高，且均与RS组差异较大。2.3污泥中优势菌群和PAEs降解菌的分布7\n基于菌群丰度分析结果，取相对丰度前10的优势门类(见表2)具体展示不同样品组的物种丰度。变形菌门和拟杆菌门在全部样品组中均占优势，且RS组中相对丰度比DBP、DEHP组中低。在RS组中，放线菌门相对丰度也较高。通过Unifrac距离分析样品间的相似性得知，DBP和DEHP组之间的物种丰度及优势门类较相似，而DBP、DEHP组均与RS组相似度较低。7\n为探讨污泥中PAEs降解菌的分布，在DBP、DEHP和RS组相对丰度排名前35的属中选取并汇总了已被报道的具有DBP或DEHP降解能力的属，结果见表3。在DEHP组中，优势属戈登氏菌属、无色杆菌属、红球菌属、根瘤菌属和金黄杆菌属中均被报道存在DEHP降解菌，在DBP组中，优势属代尔夫特菌属、假单胞菌属和鞘脂菌属中均被报道存在DBP降解菌。戈登氏菌属、红球菌属和根瘤菌属还同时被报道存在DBP降解菌，表明很多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同时存在DBP降解能力，其余属不具备同时降解DBP和DEHP的能力，进一步表明DEHP比DBP更难降解，该结果和DEHP存在更复杂的支链结构相关。鉴于DEHP更难被降解，微生物假如能有效降解DEGHP，则其更简单降解结构相似且没有复杂结构的DBP。系统发育多样性分析表明，已报道的PAEs降解菌存在于多种优势属中，其相互间没有明显进化关系，该结论与已报道的研究结论全都，即在自然环境中PAEs降解菌存在高度的遗传多样性。以上结果表明，废水处理污泥中存在多种类型PAEs降解菌。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断增长，进而成为优势微生物，最终达到DBP和DEHP的有效降解。但低浓度PAEs的污染仍会造成各类遗传损伤。因此，在复杂的环境中去除低浓度的PAEs仍是亟待解决的重要问题。三、结论(1)废水处理污泥经过10d培育后，对1000mg/L的DBP和DEHP的降解率分别可达99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP。(2)DBP和DEHP的添加显著降低了废水处理污泥的微生物多样性，DBP、DEHP组物种组成相似性较高，且均与RS组差异较大。(3)废水处理污泥中存在多种类型PAEs降解菌。高浓度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不断增长，进而成为优势微生物，最终达到DBP和DEHP的有效降解。（来源：X省科技学院环境与资源学院,X省废弃生物质循环利用与生态处理技术重点试验室；X省工商大学食品与生物工程学院）7