A_A_O与OD污水处理工艺对城市生活污水中内分泌干扰物去除效果研究.pdf 64页

'学校代码:10571学号:2015010114密级:公开A/A/O与OD污水处理工艺对城市生活污水中内分泌干扰物去除效果研究RemovalEfficiencyofEndocrineDisruptersinMunicipalWastewaterTreatmentPlantswithA/A/OandODTreatmentProcesses医学学科门类临床流行病学学科、专业环境毒理学研究方向二〇一五级年级硕士层次(硕士博士)周开茹研究生姓名唐焕文、刘小山导师姓名2015.9～2018.5起止日期二○一八年六月 学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医科大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。作者签名：日期：学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医科大学。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密后适用本声明。作者签名：日期：导师签名：日期： 目录中文摘要...........................................................1英文摘要...........................................................41前言..............................................................81.1研究背景........................................................81.2研究目的.......................................................101.3研究内容.......................................................112材料与方法......................................................112.1实验材料.......................................................112.2实验方法.......................................................133结果.............................................................204讨论.............................................................315小结.............................................................34参考文献..........................................................35综述...............................................................44综述参考文献......................................................52致谢...............................................................58附录一缩写词中英文对照...........................................59附录二在读硕士期间的科研情况.....................................60 ContentsAbstractinChinese......................................................................................................1AbstractinEnglish......................................................................................................41Introduction...............................................................................................................81.1Background..............................................................................................................81.2Objective................................................................................................................101.3Contents.................................................................................................................112MaterialsandMethods...........................................................................................112.1Materials................................................................................................................112.2Methods..................................................................................................................133Results......................................................................................................................314Discussion.................................................................................................................345Conclusions..............................................................................................................35References...................................................................................................................36Review.........................................................................................................................44ReferencesforReview................................................................................................52Acknowledgements....................................................................................................58AppendixІ:Abbreviation..........................................................................................59AppendixII:Scientificresearchduringpostgraduatestudy.................................60 A/A/O与OD污水处理工艺对城市生活污水中内分泌干扰物去除效果研究中文摘要【目的】1.利用化学分析方法检测城市污水处理厂中八种典型内分泌干扰物(Endocrinedisruptingchemicals,EDCs)的分布情况以及去除效果。2.探讨生物学方法对污水厂中EDCs去除的监测效果以及城市污水中影响EDCs去除效果的因素，为城市污水中EDCs的监督管理提供理论依据。【方法】1.采集东莞2种不同常用处理工艺(厌氧/缺氧/好氧法、氧化沟法)的污水处理厂（A厂、B厂）中各个处理阶段的水样，有机萃取后，一部分用气相色谱质谱联用仪检测水中八种典型EDCs的浓度，另一部分用于生物学效应检测。2.用人肾上腺皮质癌细胞（H295R）检测污水厂各个水样萃取物中类固醇激素干扰物的去除效果。3.用人乳腺癌细胞（MVLN）检测污水厂各个水样萃取物中雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)结合活性的去除效果。4.用大鼠肝癌细胞（H4IIE）检测污水厂各个水样萃取物中芳烃类受体（Arylhydrocarbonreceptor,AhR）结合活性的去除效果。5.统计分析运用GraphPadPrism6对实验结果各项指标进行统计学分析。计量资料均采用xs表示，采用t检验或单因素方差分析进行组间比较，P≤0.05即为差异有统计学意义，检验水准α=0.05。两个统计变量相关性评价用Spearman相关分析。【结果】1.化学分析EDCs结果1.1春季：进水中壬基酚（Nonlyphenol,NP）、辛基酚（Octylphenol,OP）、-1-1双酚A（BisphenolA,BPA）含量最高，浓度分别为10782ng·L、9892ng·L、1 -14543ng·L。17α-乙炔基雌二醇(17α-Ethinglestradiol,EE2)和己烯雌酚（Diethylstilbestrol,DES）均低于检出限，其中A污水厂的雌三醇（Estriol,E3）-1最高（24.5ng·L）。酚类和雌激素化合物去除率均在90%以上。-1-11.2夏季：进水中OP、NP和BPA浓度依次为835.4ng·L、3289.6ng·L和-142834.3ng·L，BPA类物质的浓度远远高于春季。DES,17β-雌二醇（17β-Estradiol,E2）与EE2在两个污水厂中均未检出。-1-11.3秋季：进水中OP、NP和BPA浓度依次为30347.9ng·L、215554.3ng·L、-1-155277.7ng·L。雌酮（Estrone,E1）在A污水厂进水中的浓度相对较高为99ng·L，DES与EE2均低于检出限。酚类化合物去除率最低为94.9%，雌激素类化合物去除率最低为91.6%。2.生物检测EDCs结果2.1H295R细胞试验结果显示，细胞经两污水厂进水及出水有机萃取物处理后，雌二醇（17β-Estradiol,E2)水平显著升高，睾酮（Testosterone,T)水平呈下降趋势。类固醇基因StAR、17βHSD4、17βHSD1、CYP11A的表达没有显著的改变（见附表）。春季：类固醇基因CYP21、CYP17在A、B两厂的进出水中皆呈下降趋势；3βHSD2、CYP17和CYP21基因表达量在A厂污水处理后显著下降而在B厂出厂水处理后显著上升。夏季：在A厂中，与进水处A1相比，出水处A5的CYP11B2、CYP19、HMGR基因上调相对明显，分别为1.83倍、1.51倍与1.41倍；CYP11B2、CYP21在B厂的出水中表达水平整体呈下降水平。秋季：HMGR和3βHSD2在A、B厂各处理阶段中的表达皆呈下降趋势；CYP11B2在A、B厂各阶段的处理工艺中的表达皆呈上升趋势。2.2MVLN细胞试验结果显示，春季B污水厂的进水雌激素当量（Estradiol-1Equivalencyquotient,EEQ）最高为37.99ng·L，A污水厂的出水中EEQ值先升-1高后降低；夏季B污水厂的进水中EEQ值最高为59.57ng·L，A污水厂的出水-1中EEQ值先升高后降低；秋季A污水厂的进水中EEQ值最高为34.72ng·L，A污水厂的出水中EEQ值整体呈下降趋势。2.3H4IIE细胞试验结果显示，春季B厂从进水到出水处，多环芳烃受体活性先降低后升高。夏季B污水厂进水中TCDDEquivalencyquotient（TEQ），最2 -1高为63757ng·L。秋季，A厂中厌氧池A2处和好氧池A4处的多环芳烃受体活性明显高于进出水处。B厂在进水B1处的多环芳烃受体活性远远高于出水B5处。3.相关性分析Spearman相关性分析结果显示，夏季，A厂酚类物质OP、NP、BPA与E22浓度的变化中，R分别为0.87、0.77、0.92，P<0.05，酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化之间有相关关系。春秋季，A厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化无相关关系；春夏秋季，B厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化无相关关系。夏季，A厂烷基酚与E2浓度的变化中，P<0.05，烷基酚物质与E2浓度的变化之间有相关关系。【结论】1.A/A/O与OD污水处理工艺对八种EDCs整体去除率大于90%，且出水部分以酚类物质为主。2.化学分析法与生物分析法相互补充，不能相互替代。即使化学分析部分中去除率为100%，两厂的出水中仍具有一定的生物活性。两种方法结合，更能有效的检出污水中的EDCs。【关键词】A/A/O；OD；内分泌干扰物；H295R；MVLN；H4IIE3 RemovalEfficiencyofEndocrineDisruptersinMunicipalWastewaterTreatmentPlantswithA/A/OandODTreatmentProcessesAbstract[Objective]1.Usingchemicalanalysismethodstodetectthedistributionandremovalefficiencyofeighttypicalendocrinedisruptingchemicals(EDCs)inmunicipalwastewatertreatmentplants.2.ToexplorethemonitoringeffectofbiologicalmethodsontheremovalofEDCsinwastewatertreatmentplantsandthefactorsaffectingtheremovalefficiencyofEDCsinurbansewage,andtoprovideatheoreticalbasisforthesupervisionandmanagementofEDCsinurbansewage.[Methods]1.CollectingwatersamplesfromvarioustreatmentstagesofsewagetreatmentplantsintwodifferenttreatmentprocessesinDongguan.Aftersolid-phaseextraction,someofthemwereusedforbiologicaleffectdetection.TheotherpartwasusedtodetecteighttypicalEDCsusinggaschromatographymassspectrometry.2.Humanadrenocorticalcarcinomacells(H295R)detectedtheremovaleffectsofsteroidhormoneinterferingsubstancesinvariouswatersamplesofwastewatertreatmentplants（WWTPs）.3.Usingofhumanbreastcancercells(MVLN)todetecttheremovaleffectofestrogenreceptorbindingactivityinvariouswatersamplesoftheWWTPs.4.Therathepatomacells(H4IIE)wereusedtotesttheremovaleffectsofthearomatichydrocarbonreceptor-bindingactivitiesinvariouswatersamplesoftheWWTPs.5.Statisticalanalysis:GraphPadPrism6wasusedtoanalyzetheexperimental4 results.Allofthevalueswererepresentedbyxs,andthedatawereanlaysedandcomparedbyttestorone-wayANOVAbetweenthetwogroups.ThesignificancelevelwassetatPvalue≤0.05.Spearmancorrelationanalysiswasusedtoevaluatethecorrelationbetweentwostatisticalvariables.[Results]1.ChemicalanalysisEDCsresults1.1Inspring:OP,NPandBPAlevelswerethehighest,withconcentrationsof-1-1-110782ng·L,9892ng·L,and4543ng·L,respectively.BothDESandEE2were-1belowthedetectionlimit,withthehighestE3forWWTPA(24.5ng·L).Theremovalratesofphenolicandestrogeniccompoundswereallabove90%.-11.2Insummer:TheconcentrationsofOP,NPandBPAwere835.4ng·L,3289.6-1-1ng·Land42834.3ng·L,respectively.TheconcentrationofBPAsubstancesismuchhigherthanthatofspring.DES,E2,andEE2werenotdetectedinbothWWTPs.-11.3Inautumn:TheconcentrationsofNP,BPA,andOPwere30347.9ng·L,-1-1215554.3ng·L,and55277.7ng·L,respectively.TheconcentrationofE1inthe-1inletwateroftheWWTPAwasrelativelyhighat99ng·L,andbothDESandEE2werebelowthedetectionlimit.Thelowestremovalrateofphenoliccompoundswas94.9%,andthelowestremovalrateofestrogenswas91.6%.2.BiologicaltestofEDCsresults2.1H295RcelltestresultsshowedthatafterthecellsweretreatedwiththeinfluentandeffluentorganicextractsofthetwoWWTPs,thelevelof17β-Estradiol(E2)increasedsignificantly,andtheleveloftestosterone(T)showedadownwardtrend.TherewasnosignificantchangeintheexpressionofthesteroidgenesStAR,17βHSD4,17βHSD1,andCYP11A.Inspring,thesteroidgenesCYP21andCYP17allshowedadecreasingtrendintheinfluentofWWTPAandWWTPB.Theexpressionlevelsof3βHSD2,CYP17andCYP21genesdecreasedsignificantlyafterthesewagetreatmentintheWWTPAandincreasedsignificantlyaftertheWWTPBtreatment.Summer:InWWTPA,theCYP11B2,CYP19,andHMGRgenesatthewateroutletA55 weresignificantlyupregulatedcomparedwiththeinfluentA1,1.83,1.51,and1.41times,respectively;CYP11B2andCYP21wereexpressedintheWWTPBeffluents.Theoveralllevelshowedadecline.Inautumn:theexpressionofHMGRand3βHSD2showedadownwardtrendineachtreatmentstageofWWTPAandWWTPB;theexpressionofCYP11B2inallstagesofWWTPAandWWTPBshowedanupwardtrend.2.2MVLNcelltestresultsshowedthattheEstradiolEquivalencyquotient(EEQ)-1intheWWTPBinspringwasthehighest,reaching37.99ng·L.TheEEQvalueintheeffluentoftheWWTPAincreasedfirstandthendecreased.ThehighestEEQ-1valueintheinfluentwastewateroftheWWTPsis59.57ng·L.TheeffluentEEQoftheWWTPsfirstincreasesandthendecreases.TheEEQvalueoftheinfluent-1wastewaterofWWTPAinautumnis34.72ng·L.TheeffluentEEQvalueofWWTPAasawholeshowedadownwardtrend.2.3H4IIEcelltestresultsshowedthatthepolycyclicaromatichydrocarbonreceptoractivityfirstdecreasedandthenincreasedinthespringfromplantBtoplantwater.ThemaximumTCDDEquivalencyquotient(TEQ)inthesewagetreatment-1plantinsummerBis63757ng·L.Inautumn,theactivityofPAHsattheA2andA4intheanaerobictankAwassignificantlyhigherthanthatattheinletandoutlet.TheactivityofthepolycyclicaromatichydrocarbonsacceptoratB1inWWTPBismuchhigherthanthatatoutletB5.3.SpearmananalysisSpearmancorrelationtestresultsshowedthatinsummer,therewasacorrelationbetweenthechangesofOP,NP,BPA,andE2concentrationsofphenolicsintheWWTPA,P<0.05,andchangesinthephenoliccompoundsOP,NP,BPA,andE2concentrations.Inspringandautumn,therewasnocorrelationbetweenthechangesofOP,NP,BPAandE2concentrationsofphenolsinWWTPA;inseasons,therewasnocorrelationbetweenthechangesofOP,NP,BPAandE2concentrationsofphenolsinWWTPB.Insummer,therewasacorrelationbetweentheconcentrationofalkyl6 phenolsandE2inthechangeofconcentrationsofalkylphenolsandE2inWWTPA.[Conclusions]1.TheoverallremovalrateoftheeightEDCsfortheA/A/OandODwastewatertreatmentprocessesisgreaterthan90%,andtheeffluentpartisdominatedbyphenoliccompounds.2.Chemicalanalysisandbiologicalanalysiscomplementeachotherandcannotreplaceeachother.Eventheremovalrateinthechemicalanalysissectionis100%,theeffluentofthetwoplantsstillhassomebiologicalactivity.ThecombinationofthetwomethodscanmoreeffectivelydetecttheEDCsinthesewage.[Keywords]A/A/O;OD;endocrinedisruptingchemicals;H295Rcell;MVLNcell;H4IIEcell7 1．前言1.1研究背景环境内分泌干扰物（Endocrinedisruptingchemicals,EDCs）是对保持动态平衡的生物体内天然激素起干扰作用的外源物质，可通过核受体或内分泌激素的合成、分泌、传递和清除途径影响生物的发育、繁殖和行为，作为一类新型的环境[1]污染物逐渐引起了国内外学者的广泛关注。目前已知的环境中EDCs主要有（1）激素类物质，包括天然及合成激素类物质，天然雌激素如E1、E2与E3等；天然雄激素如T等；人工合成激素类如EE2与DES。天然类激素主要来源于人和脊椎动物体内天然合成的激素而人工合[2]成的激素一部分来源于人类、家畜和水产品，另一部分源于污水的排放。（2）人工合成化学物如邻苯二甲酸酯类（PhthalateEsters,PAEs）、酚类（包括NP、OP、BPA）以及多环芳烃类（PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs）等。人群流行病学研究显示，EDCs可使女性不孕、胎儿早产、早期卵巢功能、激素水平[3-5]异常；使男性前列腺癌发病率增加，精子量减少。美国伊利诺香宾大学的研究显示，卵巢接触EDCs后，会影响卵巢的正常发育，还可能会通过雌激素机制[6,7][8]增加患乳腺癌的风险。Campen等人研究发现女性暴露在BPA的环境中，可[9]能降低其卵母细胞质量并导致其不孕的风险。Hampl等人研究同样发现EDCs[10]会影响男性精子的质量。徐廷云等对苏州地区男性精液中的PAEs的进行浓度检测，结果显示不育男性精液中PAEs总量显著高于正常生育组，且男性的精子[11]总数与PAEs的总量成反比。王明远等人通过meta分析得出环境内分泌干扰物可能是女性复发性流产的重要病因之一，EDCs职业暴露导致自然流产增加。大量数据表明，世界各大水体均受到不同程度的EDCs污染。BPA是被研究最多的化学物质之一，也是最有效的内分泌干扰化学物质之一。它广泛应用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂的生产中，因此，BPA可在塑料水瓶、食品容器、各种家[12]用产品(如光盘、消费电子产品)、医疗设备(如牙科填充物)中均有发现。而NP[13]主要来源于工厂生产烷基酚乙氧酚表面活性剂的代谢物。希腊研究者在其城市[14][15]的污水厂中检测出BPA、NP等物质。意大利的Alessando等人研究显示BPA和NP不仅存在于地表水和沉积物中，在土壤和地下水中均有发现。在国内，崔8 [16]志鸿等人对重庆市内水体中的有机污染物进行检测发现，有机污染物的类型以[17]PAHs和PAEs为主。高达文等人在松花江的地表水中检测出六种PAEs类物质。在武汉东江水体及其水底的污泥中均发现部分EDCs的存在，但是EDCs的浓度[18]与其他文献相比较低。有研究显示，EDCs在极低浓度下就可引起水生生物的[19]生殖发育障碍。EDCs蓄积于水生生物体内，可通过食物链或饮用水被人体吸收进而影响人体健康。在美国的波托马克河的支流中发现EDCs物质与两性鱼的[20]存在，表现为睾丸中含有卵母细胞和其他雌性性腺的特征。鱼类接触NP后，会对其血浆卵黄生成素水平及卵子产生有一定的影响，从而产生倒U形剂量-反[21]应关系。在捷克，Petra等人研究发现，鱼类暴露在污水中的EDCs，会对鱼的生长产生一定的影响。研究人员通过体外和体内生物测定都证明了在黄河中存在内分泌干扰物，实验证明鱼生活在黄河（郑州河段）水体中，后期出现一定的生[22]殖障碍。[23]污水处理厂中的污水是水中EDCs的主要来源。现有的污水处理工艺主要采用生物降解法包括活性污泥法、厌氧/缺氧/好氧法（Anaerobic/Anoxic/Oxic,A/A/O）法、氧化沟法（Oxidationditch,OD）法、膜生物反应器法等，这些处理工艺主要针对有机污染物、氮磷的去除，对EDCs的处理效果未知。研究显示，城市污水中EDCs的处理效果受多种因素影响，如处理的工艺类型及操作的条件[24]。化学分析法常被用于EDCs的测定，但应用此方法大规模检测环境样品时，检测时往往费时费力，且此方法仅限于对已知目标物的分析，不能反映多种化合物可能产生的累加、协同等生物效应。目前已建立多种生物测试方法用于检测城市污水处理厂出厂水中的内分泌干扰活性，主要有细胞增殖法、报告基因法、酶[25]联免疫吸附法和重组酵母法等，这些方法主要是用来检测与雌激素受体结合启动雌激素应答元件而产生内分泌干扰效应的环境雌激素类化合物。MVLN细胞试验法就是一种报告基因法，是在人乳腺癌细胞MCF-7雌激素应答原件上游插入了荧光素酶报告基因，所以能够通过荧光量强度检测化合物的雌激素受体结合[26,27]活性。EDCs是主要通过非受体介导的途径干扰内分泌系统，如干扰内分泌激素的合成、激活、转运与代谢等。研究发现来源于人肾上腺皮质癌细胞NCI-H295R保留了类固醇激素合成途径，可以从激素水平、酶的活性及基因表9 [28]达水平研究外源化合物类固醇激素的干扰效应。US.EPA已经将H295R作为EDCs第一阶段筛查的工具。我们前期研究表明，除了用来研究已知外源化合物[29,的类固醇激素干扰效应，H295R细胞试验还可用来研究环境样本中的干扰效应30]。H295R细胞类固醇激素合成途径的机制图（图1），包括8种甾体合成酶(CYP11A、CYP11B2、CYP17、CYP19、17βHSD1、17βHSD4、CYP21、3βHSD2)和其他两种与胆固醇合成及转运有关的蛋白质(3-羟基-3-甲基谷酰基辅酶A还原[31]酶即HMGR，急性调节蛋白即StAR)。其中，CYP11B2基因编码的醛固醇合成酶是肾上腺皮质激素合成通道上重要的组成部分，CYP11B2基因表达水平上升[32]。CYP19基因调控芳香化酶催化雄激素转化为雌激素，在各组织中均有表达，[33]并参与生殖行为、发展。而环境中的多环芳烃类物质物质的体外筛选则主要通过大鼠肝癌细胞H4IIE细胞进行。H4IIE细胞能够与芳香烃受体(AhR)结合，诱[34]导基因表达，通过改变激酶活性，改变蛋白质功能等而起作用。图1类固醇激素合成通道1.2研究目的通过采用体外细胞法对工艺流程污水样品中的类固醇激素干扰物及雌激素活性物进行评价；同时结合化学分析方法，检测水中八种典型EDCs在工艺流程的分布，进一步阐明污水处理厂不同工艺对此类EDCs的去除效果。10 1.3研究内容（1）用GC-MS检测A/A/O与OD处理工艺中八种EDCs的浓度，研究不同工艺和不同季节等因素对EDCs去除率。（2）用H295R细胞、MVLN细胞与H4IIE细胞分别筛选出A/A/O与OD处理工艺中的类固醇激素化合物、雌激素化合物、多环芳烃类化合物。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1主要试剂甲醇与乙酸乙酯（HPLC级）美国SigmaAldrich公司玻璃纤维膜（GF/F,0.7µm）英国Whatman公司OasisHLB固相萃取柱（500mg,6mL）美国Waters公司DMEM/F12培养基美国Gibco公司丙酮酸钠美国Gibco公司FBS（charcoal-strippedFBS）美国Gibco公司Nu-serum美国BD公司ITs+Premix美国BD公司腺苷酸环化酶激活剂毛喉素（Forskolin）美国Cerilliant公司TCDD美国Cerilliant公司胰酶美国Sigma公司双抗美国Solarbio公司细胞级二甲基亚砜（DMSO）美国Solarbio公司ELISA试剂盒美国CaymanChemical公司荧光素酶检测试剂盒Steady-GloLuciferase美国Promega公司细胞计数试剂盒（CellCountingKit,CCK-8）日本同仁公司Real-timePCR试剂盒日本Takara公司SYBRPremixExTaqTMII酶(TliRNaseHPlus)日本Takara公司实时荧光定量（qRT-PCR）试剂盒美国ThermoFisher公司11 2.1.2实验仪器PikoReal荧光定量PCR仪美国ThermoFisher公司MiniG离心机德国IKA公司5417R型台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司微量移液器德国Eppendorf公司THERMOHERAcell®150iCO2培养箱美国ThermoFisher公司SN-25全自动雪花制冰机深圳三利公司HPX-9082MBE数显电热培养箱上海博迅实业有限公司YDS-30液氮罐成都金凤液氮仪器有限公司VORTEXGenius3旋涡振荡器德国IKA公司XDS-1倒置生物显微镜重庆光学仪器厂Synergy多功能酶标仪美国BioTek公司细胞超净台苏州净化设备有限公司CO2培养箱日本索尼公司显微镜美国ThermoFisher公司2.2实验方法2.2.1采样点选择广东省东莞市地处珠江三角洲，经济发达，工业集中，产业链条较为完整，对外贸易发达。年平均气温为24ºC，年平均降雨量为1750.4mm。雨季：4月到9月，旱季：10月到次年3月。该市共有污水处理厂36座，均使用生物降解法。常用的处理工艺主要有活性污泥法、厌氧/缺氧/好氧（A/A/O）法、膜生物反应器法、氧化沟法(OD)等，其中A/A/O处理工艺有14座、OD处理工艺有5座、周期循环活性污泥法（CASS）处理工艺有11座、循环式活性污泥法（CAST）处理工艺有4座、曝气生物滤池处理工艺有1座、改良序批式活性污泥法处理工艺有1座。调查对象为A污水处理厂选用A/A/O处理工艺，工艺流程包括格栅、厌氧2池、缺氧池、好氧池、出水，规划总占地面积为108734m，一期设计规模7万吨/日；B污水处理厂采用OD处理工艺，工艺流程包括格栅、厌氧池、缺氧池、12 2氧化沟、出水，规划总占地面积为160396.131m，一期设计规模6万吨/日。A,B污水厂的出厂水均采用一级B类污水排放标准（见表1）。表1《标准》基本控制项目最高允许排放浓度（日均值）序号基本控制项目一级标准A标准B标准1COD（mg/L）50/60602BOD5（mg/L）10/20203悬浮物（mg/L）10/20204TN（mg/L）15205pH6～96～96粪大肠菌群数（个/L）1031042.2.2样本收集实验样品分别于2017年春季（3月）、夏季（7月）、秋季（10月）进行的采集。样品采集过程中同时收集相应的采样信息(表2)，包括：pH、室外温度、化学需氧量(ChemicalOxygenDemand,COD)、生化需氧量(5-dayBiologicalOxygenDemand,BOD5)、总氮量(TotalNitrogen,TN)等。表2污水厂基本控制项目的理化参数ParametersWWTPAWWTPBA1A5B1B5pH6.7～96.7～96.386.38Temperature(ºC)15～27.515～27.514～30.114～30.1COD(mg/L)120～25012～40100～12020BOD5(mg/L)60～705-640～608～15TN(mg/L)3520--2.2.3样本编号春季，A处理厂采样点编号为A1、A2、A3（图2），夏秋季采样点编号为A1、A2、A3、A4、A5（图3）；春季，B处理厂采样点编号为B1、B2、B3，夏秋季采样点编号为B1、B2、B3、B4、B5。水样为瞬时水样，采集后，把水样13 储存于棕色玻璃瓶中，4ºC保存。在采集前用污水进行润洗，用瓶盖密封。收集的样品需要在24h内进行预处理。图2春季A、B污水厂的工艺流程及采样点设置图3夏秋季A、B污水厂的工艺流程及采样点设置14 2.2.4样品预处理对采集的水样预先使用纤维滤膜过滤一次，过滤后的水样用固相萃取柱（SolidPhaseExtractionColumn,SPE）进行富集，SPE柱实验前分别用8ml乙酸乙酯、甲醇、超纯水活化，一部分水样用于生物测试，另一部分水样用于化学测试。(1)实验开始时，水样以10ml/min的过滤速度通过SPE柱，即用SPE柱进行富集。(2)在实验过程中用锡箔纸包裹小柱，避免富集物的光解，样品处理完成后密封置于冰箱-20ºC保存。(3)生物实验，把样品从-20ºC取出，用5mL乙酸乙酯洗脱样品三次，再通过旋转蒸发仪蒸发，最后用氮气吹干，用DMSO定容至1ml，并转移至1.5ml的棕色进样瓶中，置于-20ºC冰箱保存，用于生物测试。(4)每次实验用2L超纯水做空白对照。0.5L水样通过SPE柱富集后，采用气质联用GC-MS法检测水中典型8种EDCs浓度。2.2.5EDCs检测方法采用气质联用GC-MS法检测水中典型8种EDCs（BPA、NP、OP、DES、[35]E1、E2、EE2、E3）浓度，分析方法见龚剑等。具体实验步骤如下，(1)GC条件：载气为氦气，流速1mL/min；水样以无分流方式进样；程序升温初始温度50ºC，保持1min，以20ºC/min升到200ºC，然后以3ºC/min升到280ºC保持2min，最后以30ºC/min升到290ºC保持5min。(2)MS条件：传输线温度为280ºC，离子源温度为250ºC，离子源为电子轰击源(EI)，电子轰击能量为70eV；采用全扫模式(m/z=50~550)对样品进行定性，采用选择离子监测模式(SIM)对样品进行定量。(3)在分析过程中同时运行QA/QC控制样品：方法空白、空白加标和样品重复样，并在分析前对所有样品添加回收率指示物标样。空白加标中目标化合物OP、NP、BPA、DES、E1、E2、EE2和E3的平均回收率和相对标准差（n=3）分别为94.5%±4.4%、100.1%±7%、100.6%±8.8%、104.2%±17.4%、92.1%±8.8%、81.7%±2.9%、124.3%±10%、97.7%±12.2%。方法空白中仅检测出NP-1-1和BPA，平均浓度分别为1.6ng·L和10ng·L远低于样品中的含量，已在样品15 中扣除了空白。(4)所有的样品中回收率指示物NP-d4、BPA-d16、E1-d4的回收率分别为90%±5.2%、93.6±8.1%、104.2%±10%。NP和BPA的校正曲线线性范围分别-1-1为100~2000ng·mL、20~500ng·mL，其他目标化合物的校正曲线线性范围-12均为5~100ng·mL，拟合度R均大于0.99。BPA、NP、OP、DES、E1、E2、-1EE2和E3的检出限LOQ分别为：<1.0、5.0、1.6、<1.0、1.5、1.1、3.0和3.2ng·L。2.2.6细胞株的培养与传代H295R,MVLN与H4IIE细胞获赠于韩国首尔大学公共卫生学院环境毒理学实验室KyunghoChoi教授。将细胞从液氮罐中取出，并置于37ºC恒温水浴锅中快速融化，1500r/min离心5min，弃上清后，加入12ml的培养基，吹匀后转移至培养皿后放入培养箱进行培养。H295R培养液的配制为2.5%的Nu-serum、1%的ITS-Premix、1%的双抗与DMEM/F12培养基，在37ºC，5%CO2细胞培育箱培养，每周换液二至三次。5待细胞密度达到3×10ml进行传代。MVLN细胞完全培养基配置：DMEM/F12基础培养液加入10%FBS，1%丙酮酸钠0.1%胰岛素与0.5%的双抗。细胞置于37ºC，5%CO2培育箱中传代培5养。待细胞密度达到1.25×10ml进行传代。H4IIE细胞培养基的配置：10%的FBS、1%的双抗与DMEM培养基，在374ºC，5%CO2细胞培育箱培养。待细胞密度达到8×10ml进行传代。2.2.7H295R细胞试验H295R细胞作为筛选环境类固醇激素干扰物的有力体外工具，本文从激素和基因表达水平两个层次检测污水处理厂对此类干扰物的去除效果。H295R细5胞以3×10cells/mL接种于24孔板中，每孔1ml，贴壁24h后染毒。每个测试样品准备3个浓度梯度，设置DMSO溶剂对照组及空白对照组，以及阳性对照组（Forskolin处理），每个处理组设三个重复。为避免H295R细胞毒性的影响，首先进行CCK-8细胞活力测试，在无毒剂量下（细胞存活率>80%）分析水中EDCs对H295R细胞类固醇激素雌二醇（Estradiol,E2）和睾酮（Testosterone,T）[34]的水平及类固醇合成基因表达量的影响。染毒48h后收集培养基用于检测激16 素水平的变化，收集细胞用于检测类固醇合成的基因表达量变化。(1)激素水平的测定①收集的培养液中E2和T经乙醚萃取后用酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测，从H295R培养基取500µl的样品放入玻璃管内，加入400µl的超纯水漩涡混匀。②加入2.5ml的乙醚抽提两次，离心（10min/2100rpm/4ºC）使样品液相分析，再用氮气吹干样品。③加入300µl的ELISAbuffer溶解，用作E2检测。FOR按1:150，SC及其他污水水样按1:75的比例从E2的水样中抽取相应的液体放入新的ELISAbuffer溶解液中用作T检测。④最后将样品统一放入-80ºC保存。根据说明书的指示，使用E2/TELISA试剂盒检测激素水平，每个样品做三个副孔。(2)ELISA分析测定①提前配好EIAbuffer、E2的Tracer、Antiserum，T的Tracer、Antiserum、Washbuffer等液体。②将标准品和样品分别用新的取样吸头取50µl加入到相应的微孔中，在每一微孔中分别加入50µlTracer、50µlAntiserum。③加完样之后，用锡箔纸封住，置于摇床，室温孵育120min。再快速弃去孔内反应物，每孔用300µl洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。④在每孔中加入200µl底物液。加完底物后室温孵育90min，加50µl终止液到每个检测孔中终止酶反应。⑤最后加终止液后10分钟之内，在酶标仪415nm处测定吸光度值。(3)基因表达量的测定细胞中总RNA用Trizol试剂提取，逆转录成cDNA后进行实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem,qRT-PCR)。qRT-PCR检测的10个类固醇合成基因有StAR、HMGR、3βHSD2、CYP21、[35,36]17βHSD4、17βHSD1、CYP19、CYP17、CYP11B2和CYP11A。17 (4)细胞总RNA提取[27]采用Trizol试剂提取总RNA，RNA逆转录成cDNA再进行PCR。①将细胞统一收集到灭霉灭菌的1.5ml的EP管中，第一步加入500μlTrizol，用枪头反复吹打至混匀，室温静置5min使细胞充分裂解后，加入100μl氯仿，随后用力震荡15s，室温静置5min，以12000×g/4ºC离心15min。②吸取上清液200μl转移至另一批新的EP管中，加入等体积（约200μl）的异丙醇，混匀之后室温静置10min，然后，12000×g/4ºC离心10min。③弃上清液，加入1ml的75%乙醇洗涤，温和混匀后，10000×g/4ºC离心3min。④弃上清，倒扣后直立，干燥10min，加入20～50μlDEPC水溶解，离心混匀进一步离心，56ºC助溶10min，把所有的样品置于冰上。⑤RNA浓度及纯度检测，用分光光度计测定RNA纯度和浓度，取RNA的纯度在1.8～2.0范围内的进行下一步的逆转录。(5)cDNA的制备（实验全程冰上操作）①加入一定量的总mRNA于EP管中。②加入5XPrimeScriptRTMasterMix4µl。③加入DEPC水至总体积为20µl。逆转录反应体系：37ºC15min，85ºC5sec，4ºC（holding），反应结束后，把cDNA置于-20ºC或-80ºC保存。(6)引物的合成与稀释类固醇基因引物序列由上海捷瑞公司合成。将新合成的引物进行离心，再用DEPC水溶解，配成100µM的工作储备液，最后调整为10µM工作液。(7)qRT-PCR反应体系①95ºC预变性30s；②95ºC变性5s，60ºC退火30s，共40个循环。RT-PCR使用SYBRGreen实时PCRMasterMix试剂盒进行操作实验（表3）。挑选的类固醇合成基因和内源基因采用智能循环系统RT-PCR技术检测。PCR反应混合物（10μl体系）含有5μlSYBRGreen，稀释的cDNA1μl和1μl正义/18 反义引物（引物与探针的设计、合成详细内容见附表），DEPC水补足10µl。经过热循环及扩增程序后，qRT-PCR的结果基于循环阈值（CT）为每个反应测−ΔΔCT定值。扩增产物以β-actin作为内参，用2法计算相应的倍数变化。表310µlPCRreactionsystemComponentsVolume/Reaction(µl)SYBRpremixExTaqⅡ(TliRNasePlus)(2×)5PCRForwardPrimer(10µm)0.4PCRReversePrimer(10µm)0.4DNA模板1d3H2O3.2Total102.2.8MVLN细胞试验用MVLN细胞检测污水中雌激素受体结合活性，为避免FBS中phenols对试验结果的影响，试验前24h将FBS换成charcol-strippedFBS。试验时，MVLN5细胞用胰酶消化后离心制备单细胞悬液，以1.25×10cells/mL接种在96孔培养板中（每孔250µl），贴壁24h后染毒72h。每个测试样品准备3个浓度梯度，设置DMSO溶剂对照组及空白对照组，每个浓度三个重复。为避免MVLN细胞毒性的影响，用CCK-8检测细胞活力，在无毒剂量下（细胞存活率>80%），用Steady-GloLuciferase试剂盒检测细胞内荧光量。实验中同时用E2稀释6个浓度梯度，做标准曲线，样品的雌二醇当量（EstradiolEquivalencyquotient,EEQ）-1（ng·L）按如下公式计算：EC20(E2)9[37]EEQ272.3810；（S）为样品中的EC20。EC(S)EC2020通过样品的雌激素活性比（RP）进一步计算出雌激素的活性当量（EEQC），计EC(i)算公式为RP；EEQCRPici；（ci为样品中目标物浓度），EEQCEC(E2)50[38]能够进一步反映出EDCs中的物质对雌激素活性的贡献。19 2.2.9H4IIE细胞试验用H4IIE细胞检测污水中多环芳烃受体诱导的内分泌干扰效应，试验时，4H4IIE细胞用胰酶消化后离心制备单细胞悬液，以8×10cells/mL接种在96孔培养板中（每孔250µl），96孔板的四周加入相同体积的PBS，贴壁24h后染毒72h。每个测试样品准备3个浓度梯度，设置DMSO溶剂对照组及空白对照组，每个浓度三个重复。为避免细胞毒性的影响，用CCK-8检测细胞活力，在无毒剂量下(细胞存活率>80%)，同样用Steady-GloLuciferase检测细胞内荧光量。实验中同时用TCDD稀释6个浓度梯度，做标准曲线。仪器分析检测得到多环芳烃（PAHs）的浓度(Ci)，对应的毒性效应采用TCDD毒性当量TEQ值表：TEQPAHERODTEFiCi。2.3统计学方法所有的数据用SPSS15.0软件进行统计分析，GraphPadPrism软件作图。实验结果用xs表示。两个统计变量的相关性评价用Spearman相关分析。3．结果3.1EDCs浓度及去除率化学分析EDCs结果显示，在春季A、B污水厂进水中OP、NP和BPA含-1量最高（图3），在A污水厂进水中NP、BPA和OP浓度依次为10782ng·L、-1-1-19892ng·L和4543ng·L，B污水厂中NP、OP和BPA浓度依次为2664ng·L、-1-1999ng·L和317ng·L。A、B污水厂进水中雌激素类化合物浓度较低，DES、EE2均低于检出限。雌激素类物质含量最高的是A污水厂进水中的E3，浓度为-124.5ng·L。A、B两污水厂对酚类的去除率均在90%以上，而A污水厂出水中-1-1-1NP、BPA、OP依然高达808ng·L、584ng·L、74.8ng·L；B污水厂出水中-1-1-1NP、BPA、OP浓度分别为61.8ng·L、12.6ng·L、5.6ng·L。处理后，除E1-1在A污水厂出水中0.8ng·L，但其它雌激素化合物在两厂出水中均低于检出限，去除率为100%（图4）。20 图4春季两污水处理厂中8种EDCs在各个处理阶段浓度及去除率变化夏季在A与B两个污水厂的进出水中OP、NP和BPA含量最高，在A与B-1-1-1两个污水厂最高浓度依次为835.4ng·L、3289.6ng·L和42834.3ng·L。BPA类物质的浓度远远高于春季。DES、E2与EE2在两个污水厂中均未检出。A污水厂对NP的去除率为75.4%，而B污水厂对NP的去除率为92.5%。雌激素方面，A污水厂对E3的去除率为97.5%，而B污水厂对E3的去除率为77.4%（图5）。图5夏季两污水处理厂中8种EDCs在各个处理阶段浓度及去除率变化秋季A,B污水厂进水中OP、NP和BPA含量最高，在A污水厂进水中NP、-1-1-1BPA和OP浓度依次为30347.9ng·L、215554.3ng·L和55277.7ng·L，B污水-1-1-1厂中NP、OP和BPA浓度依次为4849.6ng·L、10277.3ng·L和2478.5ng·L。A,B污水厂进水中雌激素类化合物浓度较低，其中E1在A污水厂进水中的浓度-1相对较高为99ng·L，DES与EE2均低于检出限。经处理后，出水口处酚类物21 质的总体浓度要高于雌激素类物质的浓度，以B污水厂表现最为明显。去除率方面，A,B污水厂对EDCs的去除率最低为91.6%，最高为100%（图6）。图6秋季两污水处理厂中8种EDCs在各个处理阶段的浓度及去除率变化3.2类固醇激素受体结合活性检测3.2.1H295R细胞激素合成及相关基因的转录CCK8细胞毒性结果显示所有样品及其稀释样对H295R无细胞毒性作用。对激素水平的检测结果显示，春季A污水厂三个采样点水样初始浓度处理后E2水平均显著增加，T浓度水平呈下降趋势，A3处T水平相对于溶剂对照组T水平下降0.68倍。B污水厂中进水B1及出水B3采样点水样初始浓度处理下E2水平均呈上升趋势，B3处E2水平是溶剂对照组E2水平的1.8倍；T浓度水平没有显著变化或呈轻微的下降趋势(图7)。22 图7春季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中E2、T浓度的影响夏季结果显示，E2在A、B厂中呈明显的上升趋势相比较与T。T浓度水平在A、B污水厂的出水A5、B5处的变化相对于SC处的变化不明显，分别为0.96倍、0.97倍。在A污水厂中，从进水A1到出水A5采样点水样初始浓度处理下E2水平均呈下降趋势，其中A1处E2水平相对于SC组E2水平，倍数变数最大为2.12；而B污水厂中的各个采样点水样初始浓度处理下E2水平均呈平稳上升的趋势（图8）。图8夏季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中E2、T浓度的影响23 秋季结果显示，A、B污水厂中，各个采样点与溶剂对照组相比，T浓度水平呈下降趋势；而A、B污水厂中进水到出水采样点水样初始浓度处理下E2水平均呈显著上升。A5、B5处相对于溶剂对照组分别上升2.02倍、1.99倍（图9）。图9秋季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中E2、T浓度的影响对H295R细胞染毒48h后10种类固醇基因相关酶的表达量检测结果显示，A,B两污水厂春季水样提取物对类固醇基因StAR、17βHSD4、17βHSD1和CYP11A基因的表达没有显著变化（见附表1），HMGR、CYP11B2和CYP19基因表达均显著上升，而3βHSD2、CYP17和CYP21基因表达量在A厂污水处理后显著下降而在B厂出厂水处理后显著上升。HMGR酶是一种催化胆固醇合成的限速反应酶，在春季样品中，HMGR基因在B厂出水相对于进水中表达水平呈下降趋[39]势，而3βHSD2基因的表达水平呈上升趋势。CYP21、CYP17在A、B两厂的进出水中皆呈下降趋势。在A、B厂的出水口处CYP11B2的表达量呈现出上升[40]的趋势。CYP19基因表达升高，机体中E2的含量增加，导致雌激素分泌过多[41]。CYP19在A厂整体呈上升趋势（如图10）。24 图10春季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中类固醇合成基因HMGR,3βHSD2,CYP11B2,CYP17,CYP21,CYP19表达量的影响在夏季样品中，CYP11B2、CYP21在B厂的出水中表达水平整体呈下降水平。HMGR、CYP17与3βHSD2基因在A、B厂的出水中表达水平整体呈上升水平。CYP21、CYP19在A厂的进水表达中呈下降水平。在A厂中，与进水处A1相比，出水处A5的CYP11B2、CYP19、HMGR基因上调相对明显，分别为1.83倍、1.51倍与1.41倍（图11）。25 图11夏季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中类固醇合成基因HMGR,3βHSD2,CYP11B2,CYP17,CYP21,CYP19表达量的影响在秋季样品中，CYP11B2在A、B厂各阶段的处理工艺中的表达皆呈上升趋势，且CYP11B2在A厂各处理阶段的上升趋势整体高于B厂。与CYP11B2表达相反，HMGR和3βHSD2在A、B厂各处理阶段中的表达皆呈下降趋势。CYP21在A厂进出水的表达中皆呈下降水平（图12）。图12秋季污水处理厂各采样点水样萃取物暴露后对H295R细胞中类固醇合成基因HMGR,3βHSD2,CYP11B2,CYP21表达量的影响26 3.3雌激素类结合活性检测MVLN细胞染毒72h后，检测荧光量，计算雌激素当量EEQ值。春季结果-1显示，A厂中EEQ值先上升后下降，A2处的雌激素活性最高（48.86ng·L）；-1B厂从B1到B3，雌激素活性依次下降。A、B厂出水EEQ分别为19.25ng·L、-114.21ng·L（图13）。在春季雌激素活性当量中，进水A1处的值远远高于出水A3处的值。夏季EEQ检测结果显示，A厂中A3处的雌激素活性最高；在B厂中B1处的雌激素活性最高，两厂出水的EEQ值均远远低于各厂的进水的EEQ值。夏季B厂，EEQ沿OD处理工艺在不同的流程中出现一定的波动，B1处的雌激素活性当量值最高，在B3处呈下降趋势，B4处呈轻微上升，B5处雌激素活性当量值再次下降。秋季EEQ检测结果显示，两厂的EEQ值在进水时达到最-1-1高，分别为34.72ng·L、39.70ng·L。图13春、夏、秋季A、B两厂中8种EDCs在各个处理阶段的EEQ27 3.4多环芳烃类结合活性检测H4IIE实验结果显示，A厂中A2处的多环芳烃受体结合活性最高；B厂从进水B1处到出水B3处，多环芳烃受体活性先降低后升高。夏季实验结果显示，-1B厂在进水B1处的多环芳烃受体活性最高（63757ng·L）且B厂各处理阶段整体的多环芳烃受体活性高于A厂。秋季实验结果显示，A厂中厌氧池A2处和好氧池A4处的多环芳烃受体活性明显高于进出水处（图14）。B厂在进水B1处的多环芳烃受体活性远远高于出水B5处。除了春季B厂出厂水B3中AhR受体活性高于进厂水，其他水样都显示经处理后，出厂水中AhR活性显著低于进厂-1水中AhR受体活性。春夏秋季A厂进厂水中AhR活性依次为394ng·L、128-1-1-1-1ng·L、503ng·L，低于B厂进厂水中AhR活性，依次为3880ng·L、63757ng·L、-113330ng·L。-1图14春、夏、秋季A、B两厂中8种EDCs在各个处理阶段的TCDDEQ（ng·L）含量28 3.5相关性检验结果通过Spearman分析发现，春季A厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的2变化中，R分别为0.60、0.42、0.59，P>0.05，酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化之间没有相关关系（图15）；夏季A厂酚类物质OP、BPA与E2浓2度的变化中，R分别为0.87、0.77、0.92，P<0.05，酚类物质OP、BPA与E2浓度的变化之间有相关关系；且只有在夏季是烷基酚类物质与E2浓度的变化之间有相关关系。春夏秋季B厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化中，P>0.05，酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度的变化之间没有相关关系；春夏秋季烷基酚类物质与E2浓度的变化之间没有相关关系（图16）。图15OP、NP、BPA在春、夏、秋季A厂中各个处理阶段的浓度与E2浓度变化的相关关系29 图16OP、NP、BPA在春、夏、秋季B厂中各个处理阶段的浓度与E2浓度变化的相关关系其中，A厂春秋季，烷基酚即OP与NP相加之和（Alkylphenol，AP）与2E2浓度的变化中，R分别为0.62、0.79，P>0.05，烷基酚物质与E2浓度的变化2之间没有相关关系。夏季，烷基酚物质与E2浓度的变化中，R为0.79，P<0.05，烷基酚物质与E2浓度的变化之间有相关关系(图17)。B厂春夏秋季，AP与E22浓度的变化中，R分别为0.01、0.46、0.07，P>0.05，烷基酚物质与E2浓度的变化之间没有相关关系(图18)。30 图17AP在春、夏、秋季的A厂中各个处理阶段的浓度与E2浓度变化的相关关系图18AP在春、夏、秋季B厂中各个处理阶段的浓度与E2浓度变化的相关关系4.讨论对两污水处理厂春、夏、秋三个季节的进水中八种EDCs检测结果显示，两个污水处理厂进水中酚类化合物浓度较高，而雌激素化合物浓度较低。春季NP-1在A污水厂进水中的浓度（10782ng·L）高于夏季NP在A污水厂进水中的浓-1度（3227ng·L），春夏两季NP在A污水厂进水中的浓度皆低于秋季NP在A-1污水厂进水中的浓度（215554.3ng·L）。NP、BPA在B污水厂进水中的浓度随着春、夏、秋三个季节的变化逐年增加。而BPA主要来源于塑料水瓶、食品[13]容器、各种家用产品(如光盘、消费电子产品)、医疗设备(如牙科填充物)。而[14]NP主要来源于工厂生产烷基酚乙氧酚表面活性剂的代谢物。这与东莞污水厂附近的工厂中排放的废水废气有一定的关系。MVLN细胞结果中，春夏季A污水厂中的雌激素活性先上升后下降；而B污水厂中随着雌激素的降解或吸附，雌激素活性降低，出水处的雌激素活性明显[42]低于B1。张照韩等等研究也发现经过二沉池后EEQ轻微上升，推测可能是沉31 降过程中，污泥中所含的雌激素活性物质重新溶解所致。而本研究中A污水厂进入二沉池后EEQ明显下降，推测可能是吸附在污泥上的雌激素活性物随着污泥沉淀而致。H4IIE细胞结果中，夏季与秋季在B污水厂中的多环芳烃类物质结合活性的整体趋势先下降后上升在B4处再次下降最后在B5处上升。说明A、B污水厂分别在缺氧处、好氧处实现对EDCs的去除即通过生物降解的方式实现对[43]污染物的去除。孙倩等人研究发现BPA在废水处理过程中主要是生物降解。与我们的结论一致。化学分析结果显示，A污水厂中整体的EDCs含量高于B污水厂，可能与A污水厂经常受到工业废水污染有关。有研究显示污水处理工艺及处理时的温度，[44]pH值，季节，污泥停留时间等均会影响有机污染物的去除效果。本研究中秋-1季，BPA在A/A/O处理工艺下的A厂出水处的浓度为87.6ng·L；BPA在OD-1处理工艺下的B厂出水处的浓度为47.3ng·L。由此可进一步推出OD处理工艺对酚类物质（BPA）的去除可能略优于A/A/O处理工艺对酚类物质（BPA）的去除。雌激素类物质DES在春夏秋季的A、B污水厂中均未检出。-1-1此外，NP在A,B污水厂进水中分别高达10782ng·L、2664ng·L，高于[1,45]云南、浙江等其他污水厂进水中的浓度。BPA及OP的浓度也高于其它污水中浓度，而A、B污水厂中雌激素化合物在进水中浓度均低于北京、捷克、阿根[46-48][49]廷等其他污水厂。王凌云等等报道深圳污水厂进水中EE2含量高达-1-160.4~895.5ng·L，而NP含量较低8.1~34.6ng·L。A,B污水厂出水中酚类浓度-1-1依然很高，尤其是A污水厂出水中NP、BPA浓度依然高达808ng·L、584ng·L，[50][51]远高于受体水域东江中此类化合物的浓度。龚剑等人研究发现在东莞东河段的沉积物中BPA的污染水平高于珠江广州河段，天然雌激素类物质则在珠江广州河段污染较严重。本研究显示东莞污水排放可能是导致这种分布特征的原因之一。三次采样污水浓度以BPA、NP、OP为主，高于广州珠江水系中酚类物质[52]的浓度，这可能也与我国目前这些化学品的消费量增加有关。H295R细胞试验结果显示，春季A、B污水厂进水粗提物经处理后，相比于对照组，E2浓度显著增加而T浓度呈下降趋势，出水粗提物处理后，与进水的变化一致，提示经过处理后，A、B污水厂对通过内固醇激素途径导致的雌激素效32 [29]应物去除率不高。Kimetal.用H295R细胞研究了钢铁厂污水及城市污水的内分泌干扰活性，也观察到了类似的结果，并推测产生这个效应的主要物质是水中多环芳烃类及酚类物质。而本研究中A、B污水厂出水粗提物中依然存在较高浓度的BPA、NP和OP，这些化学物单独处理H295R细胞后，通过不同的机制导致E2[53]浓度的上升。化学分析结果显示，一方面相对于进水，出水中酚类化合物浓度均大大降低，但夏季A、B污水厂对BPA的去除率则分别为99.8%、45.2%；对NP和OP的去除率均在75.4%以上；对雌激素类物质的去除率最低为77.4%。另一方面生物分析结果中，通过内固醇途径产生的雌激素效应没有显著降低。分析原因，出水中OP、NP和BPA的浓度较高。此外，污水中其他具有此类雌激素效应的污[54][55]染物如多环芳烃等不容忽视。张晓伟等人同样研究发现BPA使H295R细胞E1和E2的浓度增加，尽管它们各自的前体雄烯二酮和睾酮均有所下降，但BPA对H295R细胞的芳香化酶活性没有影响，且BPA能够抑制E2代谢，间接影响雌激素效应也可能导致雌激素效应。类固醇合成基因表达量检测结果显示，秋季A污水厂的出水处理后3βHSD2、CYP21、HMGR表达量显著下降，A/A/O处理工艺在A厂A5处的去除率最低为91.6%，最高为100%，这与类固醇合成基因表达量检测结果基本一致。HMGR基因表达的是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，是一种[27]催化胆固醇合成的限速反应酶，CYP19基因表达的芳香化酶可催化睾酮转化为[56,57]雌二醇，这两个基因的高表达解释了E2浓度的增加。而CYP11B2基因的高表达揭示除了性激素，污水中还有一些化合物可通过醛固醇激素水平，影响机体正[31]常的代谢平衡。3βHSD2、CYP17和CYP21是类固醇合成通道上三个重要的基因，这三种基因在A3处高表达而在B3处低表达，揭示A,B污水厂中类固醇合成干扰物的干扰机制并不完全一致。-1MVLN细胞结果显示，A、B污水厂出水中EEQ依然高达19.25ng·L和14.21-1[58-60]ng·L，明显高于其他等污水处理厂出厂水EEQ及自然水域中EEQ值。但是春季A污水厂中OP、NP和BPA的去除率分别为98.4%、92.5%、94.1%；春季B污水厂中的OP、NP和BPA的去除率分别为99.4%、97.7%、96%；A、B污水厂对雌激素化合物的去除率最低为94%，由此可以看出酚类化合物和雌激素[61]化合物浓度均有显著降低，但是雌激素活性并没有降低。杨先海等研究发现酚33 [62]类物质，包括BPA也具有雌激素活性。隋倩等等通过对4类32种EDCs的生态风险商和雌二醇当量浓度进行评分和排序，得出炔雌醇、雌酮，NP、BPA是中国城市污水处理厂优先控制的4种污染物。尽管夏季，A/A/O对BPA的去除率为99.8%，而春季，A/A/O对NP的去除率为92.5%。本研究结果显示A、B污水厂中优先控制的污染物是壬基酚和双酚A。虽然化学分析结果显示A、B污水厂出水中雌激素化合物已经基本去除，但是雌激素效应依然存在。究其原因，[63]OP、NP或BPA也具有雌激素受体结合活性。且有研究显示，污水中的酚类[64]化合物具有不同程度的雌激素效应。H4IIE细胞试验结果显示，春季A、B污水厂在A3处、B3处的多环芳烃类物质结合活性最低。春季A、B污水厂在A2、B2处对EDCs去除率最低分别为89%、57.1%；而春季A、B污水厂在A3、B3处对EDCs去除率最低分别为92.5%，[65]96%。说明经过A2、B2处理后多环芳烃类化合物有所减少。此外，李清雪等等研究发现污水厂中含有高浓度的多氯联苯、PAHs、PAEs、酚类和有机氯农药。由此推测污水厂的出水处仍具有多环芳烃受体活性的物质。Spearman分析发现，夏季A厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度变化有相关关系，秋季A厂酚类物质OP、NP、BPA与E2浓度变化无相关关系。烷基酚类物质出现同样现象。由此推测分析这可能8种内分泌干扰物之外的物质引起的内分泌干扰效应。5．小结1.A/A/O与OD污水处理工艺对八种EDCs整体去除率大于90%，且出水部分以酚类物质为主。2.化学分析法与生物分析法相互补充，不能相互替代。即使化学分析部分中去除率为100%，两厂的出水中仍具有一定的生物活性。两种方法结合，更能有效的检出污水中的EDCs。参考文献[1]LvX,XiaoS,ZhangG,etal.Occurrenceandremovalofphenolicendocrinedisruptingchemicalsinthewatertreatmentprocesses[J].Scientificreports,2016,6:22860.34 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基因序列(5"to3")碱基数CYP17antisenseTCACCGATGCTGGAGTCAAC20CYP19senseAGGTGCTATTGGTCATCTGCTC22CYP19antisenseTGGTGGAATCGGGTCTTTATGG22CYP21senseCGTGGTGCTGACCCGACTG19CYP21antisenseGGCTGCATCTTGAGGATGACAC223βHSD2senseTGCCAGTCTTCATCTACACCAG223βHSD2antisenseTTCCAGAGGCTCTTCTTCGTG2117βHSD1senseCTCCCTCTGACCAGCAACC1917βHSD1antisenseTGTGTCTCCCACGCAATCTC2017βHSD4senseTGCGGGATCACGGATGACTC2017βHSD4antisenseGCCACCATTCTCCTCACAACTC22StARsenseGTCCCACCCTGCCTCTGAAG20StARantisenseCATACTCTAAACACGAACCCCACC24HMGRsenseTGCTTGCCGAGCCTAATGAAAG22HMGRantisenseAGAGCGTTCGTGGGTCCATC20附表2.1春季不同样品在10种类固醇合成基因的表达情况SamplesStARHMGR3βHSP2CYP2117βHSD417βHSD1CYP19CYP17CYP11B2CYP11ABL1.1±0.160.9±0.231.24±0.161.54±0.210.99±0.260.79±0.030.8±0.190.92±0.150.79±0.120.9±0.19SC1.26±0.911.2±0.861.09±0.671.12±0.741.44±11.18±0.751.07±0.691.38±0.841.13±0.681±0.64******FOR10.99±0.071.87±0.42.14±0.348.05±0.810.84±0.210.92±0.233.7±1.381.4±0.234.57±2.431.75±0.36*A11/91.35±0.591.23±0.611.49±0.560.66±0.21.2±0.220.96±0.072.04±1.121.08±0.21.49±0.471.22±0.28A11/30.79±0.160.74±0.10.77±0.220.39±0.161.16±0.390.69±0.231.03±0.370.85±0.160.63±0.210.97±0.32**A10.84±0.330.86±0.360.51±0.050.51±0.21.38±0.230.87±0.231.17±0.460.52±0.141.1±0.070.66±0.02*A21/90.97±0.520.92±0.430.83±0.370.52±0.240.93±0.370.75±0.361.66±0.570.7±0.291.52±0.30.61±0.29A21/30.91±0.260.9±0.230.76±0.170.62±0.140.95±0.540.83±0.131.38±0.370.7±0.361.08±0.380.64±0.22**A20.83±0.190.72±0.210.75±0.270.61±0.11.11±0.221.01±0.21.51±0.760.57±0.161.87±1.50.57±0.23****A31/91.21±0.261.06±0.191.35±0.250.95±0.011.09±0.281.12±0.112.06±0.371.1±0.142.44±0.730.63±0.16A31/30.74±0.660.82±0.741.19±0.220.52±0.470.72±0.751.09±0.392.05±0.291.14±0.472.39±0.940.67±0.29****A31.05±0.111.21±0.230.99±0.20.87±0.221.07±0.131.14±0.112.3±0.050.6±0.141.82±0.730.74±0.21**B11/91.34±0.252.11±0.31.18±0.170.98±0.081.42±0.081.11±0.051.66±0.081.28±0.11.25±0.260.97±0.19*B11/31.42±0.252±0.431.11±0.150.96±0.191.36±0.251.22±0.221.66±0.241.18±0.151.3±0.120.87±0.18**B11.17±0.151.58±0.060.7±0.180.92±0.051.18±0.241.05±0.171.38±0.60.7±0.070.78±0.320.67±0.16*B21/91.11±0.11.41±0.261.74±0.740.36±0.161.33±0.250.81±0.153.02±0.71.22±0.152.58±1.371.18±0.32*B21/31.54±0.251.36±0.281.75±0.330.44±0.141.37±0.230.8±0.113.77±1.351.12±0.082.24±1.341.44±0.15****B21.52±0.11.34±0.141.79±0.350.43±0.111.36±0.431.02±0.184.01±1.280.86±0.082.67±1.31.13±0.24*B31/91.57±0.261.46±0.342.17±0.470.47±0.221.19±0.181.01±0.194.1±1.11.19±0.282.85±0.111.31±0.34*B31/31.62±0.21.1±0.162.07±0.430.49±0.091.35±0.050.95±0.194.48±1.021.03±0.212.49±0.171±0.08**B31.3±0.210.93±0.121.42±0.080.32±0.031.19±0.190.83±0.073.36±0.940.75±0.12.37±0.720.93±0.24*：P<0.0542 附表2.2夏季不同样品在10种类固醇合成基因的表达情况Sample17B-HSDStARHMGR3βHSD2CYP2117B-HSD1CYP19CYP17CYP11B2CYP11As4**1±0.061±0.111±0.11.5±0.331±0.151±0.091±0.151±0.091±0.161±0.13BL1.08±0.10.93±0.170.69±0.250.66±0.070.92±0.20.97±0.110.83±0.090.93±0.030.63±0.110.86±0.11SC7**1.38±0.353.37±0.041.8±0.16***********1.5±0.221.55±0.36.95±10.64±0.080.52±0.051.5±0.243.48±0.2***FOR*1.55±0.51.92±0.050.49±0.03*0.66±0.060.83±0.050.51±0.021.3±0.140.49±0.061.1±0.050.67±0.06**A14**1.74±0.20.37±0.041.64±0.59*0.82±0.170.91±0.220.4±0.081.02±0.251.12±0.120.88±0.160.77±0.19**A231.77±0.11.46±0.18**0.95±0.210.99±0.120.51±0.060.61±0.021.15±0.060.68±0.061.34±0.370.86±0.13*A39*0.31±0.061.31±0.0***0.84±0.030.95±0.091.21±0.280.88±0.170.7±0.120.5±0.061.52±0.280.73±0.07*A45**1.51±0.240.98±0.11.41±0.311.83±0.31***0.95±0.340.66±0.111.63±0.21.93±0.220.68±0.221.04±0.12***A510.58±0.1****0.66±0.060.53±0.090.5±0.060.89±0.131.73±0.120.4±0.060.68±0.031.11±0.330.92±0.13B150.88±0.2****0.59±0.080.43±0.030.47±0.020.63±0.051.43±0.060.3±0.060.64±0.080.88±0.171.12±0.09B22*0.33±0.13**0.77±0.240.69±0.030.52±0.030.51±0.21.03±0.171.97±0.120.61±0.020.58±0.150.82±0.14*B3*0.44±0.110.46±0.00.33±0.12***0.69±0.140.56±0.080.73±0.231.74±0.210.5±0.10.83±0.160.66±0.08**B42**0.47±0.01.49±0.162.12±0.440.58±0.05*0.63±0.080.7±0.110.41±0.060.58±0.040.73±0.330.84±0.03***B55*：P<0.05附表2.3秋季不同样品在10种类固醇合成基因的表达情况SampleStARHMGR3βHSD2CYP2117βHSD417βHSD1CYP19CYP17CYP11B2CYP11As1±0.161±0.151±0.161±0.091±0.111±0.161±0.011±0.211±0.051±0.08BL*0.74±0.230.77±0.060.85±0.020.74±0.140.75±0.180.93±0.130.84±0.151±0.051.07±0.080.83±0.13SC2.49±0.164.48±0.235.71±0.213.45±0.2215.45±0.221.64±0.161.03±0.120.78±0.141.18±0.131.18±0.24******FOR0.45±0.0414.95±0.22A10.8±0.080.88±0.030.66±0.110.87±0.061.43±0.170.94±0.040.77±0.050.93±0.09****A20.81±0.220.85±0.170.54±0.20.55±0.110.81±0.231.21±0.20.81±0.210.79±0.095.97±0.281.01±0.231.21±0.171.13±0.121.33±0.15***A30.9±0.240.68±0.160.37±0.11.31±0.071.08±0.195.4±0.090.94±0.21***0.23±0.02**A40.63±0.070.57±0.170.5±0.030.9±0.090.6±0.10.62±0.020.73±0.192.64±0.120.6±0.05*0.42±0.070.15±0.050.24±0.040.65±0.09***A50.5±0.050.5±0.060.77±0.070.7±0.083.16±0.220.44±0.1*****B10.55±0.030.55±0.110.58±0.060.71±0.180.73±0.031.23±0.140.85±0.080.86±0.144.47±0.220.79±0.021.33±0.15*B20.65±0.040.73±0.040.6±0.090.72±0.031.29±0.240.93±0.020.88±0.073.17±0.250.79±0.02*0.52±0.061.41±0.09*B30.55±0.070.46±0.020.67±0.230.82±0.030.66±0.060.8±0.033.28±0.130.64±0.09**1.32±0.24*B40.75±0.110.99±0.120.73±0.120.59±0.20.92±0.210.65±0.111.29±0.063.83±0.21±0.11***B50.68±0.040.52±0.020.46±0.031.32±0.230.72±0.061.6±0.090.6±0.11.07±0.042.71±0.20.85±0.04*：P<0.0543 综述环境内分泌干扰物（Endocrinedisruptingchemicals,EDCs）是对保持动态平衡的生物体内天然激素起干扰作用的外源物质，可通过核受体或者内分泌激素的[1]合成、分泌、传递和清除两种途径影响生物的发育、繁殖和行为。目前在城市污水、地下水、地表水或饮用水中均检测出EDCs的存在，部分EDCs在城市污-1[2]水中浓度高达µg·L。研究显示，城市生活污水和工业废水是水环境中EDCs[3]的主要来源。而城市污水处理工艺很大程度上影响着这些物质的去除效率。目前水中EDCs的去除方法包括物理法、化学氧化法和生物降解法。实际操作中，考虑到物理法与化学氧化法运行成本高、经济和管理上存在困难，相比而言，生物降解更经济适用，所以生物降解法使用率较高，包括传统活性污泥法（Conventionalactivatedsludge,CAS）、氧化沟法（Oxidationditch,OD）、厌氧/缺氧/好氧法（Anaerobic/Anoxic/Oxic,A/A/O）。以及在传统的处理工艺上，发展的新工艺如循环式活性污泥（Cyclicactivatedsludgetechnology,CAST）、膜生物反应器法（MembraneBio-reactor,MBR）和强化除磷脱氮膜生物反应器法（Anoxic-anaerobic-anoxicmembranebioreactor,3AMBR）。除此之外，还发展了一些新型的物理化学法，如分子印迹（Molecularlyimprinted，MIP）、非分子印迹（Non-imprinted，NIP）、紫外/过氧化氢（UV/H2O2）。目前这些工艺主要针对脱氮除去磷，对微污染物如EDCs去除效果缺乏研究。本文概述了传统生物降解法传统及新型处理工艺对水中典型EDCs的去除机制及效率，对今后的发展方向提供几点建议。1.水中EDCs的种类、来源与危害1.1水中EDCs的种类与来源目前研究的EDCs主要有（1）激素类物质，包括天然及合成激素类物质，天然雌激素如雌酮（Estrone,E1）、17β-雌二醇（17β-Estradiol,E2）与雌三醇（Estriol,E3）等；天然雄激素如睾酮（Testosterone,T）和双氢睾酮（Dihydrotestosterone,[4]DHT）等；天然植物雌激素如拟雌内酯等；人工合成激素类如17α-乙炔基雌二[5]醇(17α-Ethinglestradiol,EE2)，己烯雌酚（Diethylstilbestrol,DES）等。天然类44 激素主要来源于人和脊椎动物体内天然合成的激素经过自身的新陈代谢排出体外，进入外部环境；人工合成的激素一部分来源于人类、家畜和水产品，他们通过外部的摄取进入体内，再通过排泄物（粪便和尿液）进入环境，一部分源于污[6]水的排放。（2）人工合成化学物如有机农药（Organicpesticides,OCPs）(包括除草剂、杀虫剂）、多氯联苯类（Polychlorinatedbiphenyls,PCBs）、邻苯二甲酸酯类（PhthalateEsters,PAEs）、多环芳烃类（PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs）及酚类等。农药类环境内分泌干扰物主要通过地表径流、土壤淋溶侵蚀、喷洒漂移及挥发等过程进入水环境。PAEs作为增塑剂广泛用于食品材料、容器、医疗用具与人造革等领域。常见的PAEs有邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（Di-2-ethylhexylphthalate,DEHP）、邻苯二甲酸二丁酯（Di-n-butylphthalate,DBP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethylphthalate,DEP）与邻苯二甲酸二辛酯(DioctylPhthalate,DOP)。水中PAEs主要来源于该类化合物工业废水、垃圾渗滤及塑料管材质品的分解释放。酚类，如烷基酚、氯酚及双酚A。烷基酚（Alkylphenols,APs）类化合物包括壬基酚（Nonlyphenol,NP）和辛基酚（Octylphenol,OP），其作为氧化剂和稳定剂广泛应用于橡胶、乳化剂、塑料的生产过程，故工业废水和生活用水中清洁剂分解产物是水中APs类物质的主要污染源。双酚A（BisphenolA,BPA），主要用于合成环氧树脂、增塑剂、聚碳酸酯等高分子材料，是广泛使用的一种工业化学品，也是一种确定的内分泌干扰物，运输和处理[7]双酚A和含BPA的产品其废弃释放额外的来源。1.2水中EDCs的危害1.2.1对水生动物的潜在危害水环境中EDCs被认为是水生生物繁殖障碍的原因之一。EDCs可影响鱼类性腺发育异常，导致生殖发育异常。相关研究发现，EDCs可影响物种性别比例，-1[8]即使ng·L浓度水平的E2或EE2能够导致雄鱼雌性化。黑头呆鱼（Fathead[9,10]minnow）暴露在低浓度的EE2环境下，导致睾丸发育不全。斑马鱼暴露于[11]EE2会造成斑马鱼精子数量的减少，繁殖能力下降。然而，斑马鱼暴露在-120ng·L低剂量的DEHP条件下，会引起斑马鱼的负调节食欲刺激；另一方面，[12,13]DEHP可降低金鱼的精子产量、运动速度及促黄体生成激素水平。在美国45 Elizabeth港口的水体污染处检测出PAHs类与PCB类的联合毒性使大西洋的[14]Killifish的数量呈下降趋势。此外，EDCs对水生生物具有神经或免疫毒性。-1斑马鱼暴露在10000～100000ng·L的BPA环境下时，其下丘脑中GnRH3神经[15]-1与三叉神经元数明显增加；而金鱼暴露在54000～5400000ng·L的BPA环境[16]下时，其淋巴细胞显著增殖，巨噬细胞吞菌能力受到抑制。1.2.2对人的潜在危害环境内分泌干扰物主要通过食品和水直接摄入进入人体，可通过核受体表现出拟或抗天然激素作用，也可通过改变激素的合成、代谢等途径导致体内天然激[17]素失衡，临床上表现为生殖障碍、发育异常及易患激素相关癌症如乳腺癌、卵[18]巢癌、睾丸癌及前列腺癌等问题。人群流行病学调查显示，OCPs、BPA、二[1,19,20]恶英或植物雌激素使女性不孕、早期卵巢功能或性激素水平异常。男性暴[21][22]露于环境中EDCs，可导致精子量减少，前列腺癌发病率增加；邓芳等研究显示环境中EDCs与儿童的性早熟有着非常密切的关系。2.EDCs去除效率对比生物降解法中CAS法是利用悬浮生长的微生物絮体处理污水中有机污染物的好氧处理方法，具有低成本高效能的优点；A/A/O法能同时去除有机物脱氮除磷，在厌氧、缺氧和好氧的条件下交替运行，并且丝状菌不会大量繁殖；OD法是一种收尾相连的循环流曝气沟渠，具有较长的水力停留时间与污泥龄；A/O法将反硝化段设置在生物反应程序的前面，是一种行之有效的脱氮工艺。CAST法在反应池中活性污泥过程将按照曝气和非曝气阶段不断间歇反应重复运行，能很好缓冲进水水质与水量的波动；MBR法是一种膜分离技术与生物处理技术有机相结合的废水处理系统；3AMBR是将MBR技术与传统A/A/O工艺结合的新工艺。间歇循环延长曝气系统（Intermittentcyclicextendedaerationsystem,ICEAS）通过[23]低溶氧间歇曝气法抑制亚硝酸盐氧化菌生长实现生活污水脱氮的目的。紫外/过氧化氢（UV/H2O2）是一种新发展的处理工艺，该工艺利用•OH自由基氧化降[24]解污染物。MIP通常用作固相萃取分析化学介质，特定于某个目标化合物，即使在许多竞争性物质的废水，仍能去除目标化合物。NIP作为抛光步骤，用以消[25]除各种新兴污染物，提高处理过废水的整体质量。46 2.1激素类物质活性污泥通过异养生物和硝化细菌降解污水中的激素类物质,活性污泥对T[6]的去除率为78.2%～100%。A/A/O中严格的厌氧/缺氧/好氧环境构建了系统中良好的脱氮除磷菌群结构，这种特性污泥可能更有利于激素类物质的吸附。A/A/O[26]对EE2的去除率可达95%；传统OD法通过沟渠内不同的溶解氧浓度梯度，在空间上产生好氧区和厌氧区，再通过硝化和反硝化菌实现对激素类物质的去除，已[27]有文献显示，OD法对E2的去除率小于76.4%；研究表明，相同的处理工艺对[26]同类物质的去除效果受温度、污泥停留时间等多种因素影响。聂亚峰等研究发[28]现用A/A/O去除E3在夏季的去除率为41.3%，在冬季的去除率为97.6%。徐楠等研究发现E2用活性污泥法在水力停留时间为1h时去除率为95%，在水力停留时间为5h时去除率为可达100%。新工艺MBR法对EDCs的去除是由有机物共代谢和硝化共代谢共同作用的结[29]果。MBR法对E1、E2与E3的去除均在90%以上；而另一种新工艺MIP法通过模板形成聚合物配体，选择性的与相关分子结合以维持官能团与模板结合的位[30]置，用MIP法对E2的最高去除率为97.4%；UV/H2O2作为一种高级氧化技术，通过产生•OH，将污染物降解为二氧化碳，水和其它小分子无机物质，在对E1、[24]E2、E3的去除过程中，最高去除率可达95.9%。同样，改良的处理工艺在运行[29]过程中，去除率也会受污泥停留时间、pH等因素的影。Trinh等研究发现，MBR法在污泥停留时间为10～15天时，使激素类物质的去除率在82%至99.3%之间浮动。在改变溶液的pH值的情况下，会导致吸附物的离子化或MIP的表面电荷的变[31]化，使E2的去除率在91.7%与97.4%之间浮动。表1激素类物质在各种生物处理工艺中的去除效率-1-1处理工艺内分泌干扰物进水（ng·L）出水(ng·L)去除率(％)参考文献TreatmentprocessEDCsInfluentEffluentRemovalReferences[6]CASE113～3513～7877.8～99.1[6]E220～1994～10746.2～9847 -1-1处理工艺内分泌干扰物进水（ng·L）出水(ng·L)去除率(％)参考文献TreatmentprocessEDCsInfluentEffluentRemovalReferences[8]EE2<102.674[6]EE210～951～820～98.9[8]E3>100<1090[6]E33-9<1>66.7[8]T0.2～9040～0.01891～100[6]T119～6350～2678.2～100[26]A/A/OE151.712.775.4[28]E2--95～100[26]E27.70.7>90[27]E2314.485.8[26]E318.4～459.110.8～387.241.3～97.6[27]E348.82.694.7[28]EE277.7<494.7[26]EE277.17.1>95[27]EE213.43.375.4[28]ODE141.335.613.8[28]E276.216.278.7[27]E245.710.876.4[28]EE2133.199.155.6[27]3AMBRE1126.816.287.2[29]MBRE1100～3002～694～99.3[29]E250～1004.5～982～95.5[29]E31000～150010～1598.5～99.3[31]MIPE2--91.7～97.4[31]NIPE2--98[24]UV/H2O2E1--29.65～86.348 -1-1处理工艺内分泌干扰物进水（ng·L）出水(ng·L)去除率(％)参考文献TreatmentprocessEDCsInfluentEffluentRemovalReferences[24]E2--50.3～95.9[24]EE2--36.95～87.22.2人工合成化学物活性污泥法通过好氧菌对人工合成化学物中的有机物来进行吸附、氧化并进行有效的分解。活性污泥法对不同的物质，去除效果差异较大，最高达96.5%，[32,33]最低仅为35%。A/A/O工艺中厌氧区的设置可促进异养生物菌的繁殖，而人[34]工合成化学物如BPA的去除效果与异养生物菌的活性有关。A/A/O法对BPA的[27]去除率最低为80.4%。OD法主要通过生物的分解代谢，实现对EDCs（包括BPA）[35]的去除，OD法对BPA的去除率最高为84%。A/O工艺中反硝化池里的有机物和曝气池中的硝酸盐回流到缺氧池后进行[36]反硝化脱氮，实现对EDCs的去除。A/O对ΣPAEs的去除率为30%。同样，污泥[37]停留时间影响去除效率，罗云龙等研究发现，BPA用活性污泥法的去除率随着[38]污泥停留时间的延长由62.5%提高到99.6%，而Vasilios等研究发现，污泥停留时间为8天时，BPA的去除率高达99%，污泥停留时间为18时，BPA的去除率为93%。新工艺CAST将泥水分离与生物反应过程结合在同一池中进行，再通过序批[36]曝气－非曝气方式运行。CAST法对PAEs的去除率为72%。MBR中膜的截留作用使系统可维持较长的水力停留时间，促进细菌尤其是周期较长的硝酸细菌富集[29,增殖，进而强化污染物去除效果，MBR对NP、BPA的去除率分别为74.2%，97%39]。ICEAS法在反应器的进水阶段增加了一个预反应区，即生物氧化、硝化、反硝化作用及固液分离等均在一个反应池中进行，ICEAS对Phenols的去除率最高为[27]84%。UV/H2O2处理过程中，天然有机物大多被氧化，芳香物质含量降低，且[40]高分子天然有机物转化为可降解的化合物，UV/H2O2对NP、BPA的去除率均在[41]75%以上。新工艺在去除人工合成化学物的过程中，仍受到一些因素的影响。ICEAS在去除人工合成化学物的过程中，受到水力停留时间与污泥停留时间的综[27]合影响，使Phenols的去除率为40%～84%。UV/H2O2工艺中的紫外照射时间与49 -1H2O2投加量的不同（如10～50mg·L），使NP的去除率在75%至85.7%之间浮动。表2人工合成化学物在各种生物处理工艺中的去除效率-1-1处理工艺内分泌干扰物进水(ng·L)出水(ng·L)去除率(％)参考文献TreatmentprocessEDCsInfluentEffluentRemovalReferences[37]CASBPA<0.013～2.14<0.03～1.1062.5～99.6[42]BPA416～205035～8691.6～95.8[38]BPA260～158010～7093～99[38]NP1.22～23.820.28～0.6082～100[32]DEHP39680387090.2[32]DEP1964068096.5[32]DBP1244052095.8[33]ΣOCPs960.25313.6935[33]ΣPCBs63.9830.6452[26]A/A/OBPA836.93.799.6[27]BPA924.3181.580.4[38]BPA260～158010～7093～99[26]NP4941429.593.2[38]NP1770～3330350～59068～88[36]ΣPAEs--32[27]ODBPA--<80[35]BPA--82～84[36]A/OΣPAEs--30[36]CASTΣPAEs--72[39]MBRBPA194050074.2[29]BPA1000～150030～5095～98[39]NP470079083.2[27]ICEASPhenols--40～8450 -1-1处理工艺内分泌干扰物进水（ng·L）出水(ng·L)去除率(％)参考文献TreatmentprocessEDCsInfluentEffluentRemovalReferences[41]UV/H2O2BPA2500<500>80[41]NP3500-4000500-100075～85.7注：-：未获得相关数据2.3污泥污水中部分EDCs通过吸附、沉淀等途径转移进入污泥相，可导致污泥中EDCs残留浓度较高。有研究显示，在我国的松花江流域污水厂的污泥中检出六-1[36][27]种不同的PAEs类物质，最低含量为385.57ng·g；黄斌等研究发现，在云南-1滇池附近污水厂的污泥中发现BPA的含量高达14.7～557.5ng·g。另有研究显示，[43]PCB-28、PCB-52与PCB-101在污泥中的检出率为100%。在南非的NzheleleRiver-1-1与MvudiRiver发现PAHs含量分别高达13710ng·g、21600ng·g，而PAH在污泥中[44]的半衰期从0.2个月到14个月不等。目前，对污泥的处理方法包括物理法（热处理、超声波联合预处理）、化学（加碱预处理、臭氧氧化）或生物法（生物膜反应器与厌氧流化床技术）。处理后的污泥主要用于填埋、土地利用或堆肥、焚[45][46]烧或建材利用。2010年之后，我国污泥处理与资源回收率依然只有25%，对污泥的处置主要以填埋为主，污泥中EDCs导致的二次污染不容忽视。3.结论不同的处理工艺，对EDCs去除效果不一。A/A/O对BPA类物质的去除效果较好；CAST对PAEs类物质的去除效果较好；MBR法对激素类及合成类EDCs物质的去除效果都不错，UV/H2O2对人工合成的化学物的去除效果高于对激素类物质的去除效果。相同的处理工艺，对同类物质的去除效率受多个因素影响，如运行操作过程中污泥停留时间、温度、pH值等。在生物法处理过程中，污水中EDCs的主要去除方式是生物降解或污泥吸附，物质的理化性质影响去除的方式。通过吸附、沉淀等途径转移进入污泥相的EDCs，可造成潜在的二次污染。4．展望综合以上陈述以及中国的实际情况，提出了一下几点意见51 （1）对新建污水处理厂，在满足污水处理基本要求的前提下，利用体外高通量筛查体系通过生物学效应预判污水中EDCs种类，选择最佳处理工艺；对已有污水处理厂，应该控制操作条件，达到最佳去除效果。（2）相对于传统的生物处理工艺，改良后的工艺MBR法对常见EDCs除效果较好。（3）生物降解法虽不会产生副产物，但吸附在污泥中的EDCs可造成二次污染，我国应该加大污泥处理率，改变填埋为主的处理方式。综述参考文献[1]LvX,XiaoS,ZhangG,etal.Occurrenceandremovalofphenolicendocrinedisruptingchemicalsinthewatertreatmentprocesses[J].Scientificreports,2016,6(1):22860.[2]MartinJ,Camacho-munozD,SantosJL,etal.Occurrenceofpharmaceuticalcompoundsinwastewaterandsludgefromwastewatertreatmentplants:removalandecotoxicologicalimpactofwastewaterdischargesandsludgedisposal[J].Journalofhazardousmaterials,2012,239-240:40-47.[3]WangX,LiM,LiuJ,etal.Occurrence,distribution,andpotentialinfluencingfactorsofsewagesludgecomponentsderivedfromninefull-scalewastewatertreatmentplantsofBeijing,China[J].Journalofenvironmentalsciences,2016,45:233-239.[4]TiwariM,SahuSK,PanditGG.Distributionandestrogenicpotentialofendocrinedisruptingchemicals(EDCs)inestuarinesedimentsfromMumbai,India[J].Environmentalscienceandpollutionresearchinternational,2016,23(18):18789-18799.[5]SunL,YongW,ChuX,etal.Simultaneousdeterminationof15steroidaloralcontraceptivesinwaterusingsolid-phasediskextractionfollowedbyhighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].JournalofchromatographyA,2009,1216(28):5416-5423.[6]ManickumT,JohnW.Occurrence,fateandenvironmentalriskassessmentof52 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致谢在论文完成之际，向所有帮助和关心过我的导师、亲人、同学以及朋友致以最诚挚的感谢！首先，感谢唐焕文教授和刘小山副教授，他们开阔的视野、严谨的学术态度以及渊博的的学识深深的影响着我，三年来两位老师在课题方向的确定、实验进展、实验技术、论文撰写等方面给了我极大的帮助，同时也付出了大量心血。非常感谢两位老师在研究生期间灌输给我的科研研究的启蒙思想，感谢老师辛勤、无私的付出，所以，在此向两位老师表示最崇高的敬意和衷心的感谢！在完成论文的三年期间，也得到了实验室其他老师的无私帮助与支持。与此同时，感谢学校环境与健康研究所和科研平台中心提供良好的实验平台与实验环境。另一方面，在读研期间，同样也离不开朝夕相处的同伴。感谢东莞市环境卫生重点实验室（603实验室）小伙伴们的陪伴与支持，因为有你们的陪伴，让得我的研究生三年虽然短暂，但是充实而又快乐。最后，感谢我的父母，因为他们的支持，给了我学习的动力，让我无忧无虑的投入到科研学习中去，也使我度过了三年的美好的校园时光。正是大家一如既往的支持才使得我的毕业论文最终完成。最后，再次感谢两位老师三年来对我的谆谆教诲与无私栽培。58 附录一：缩写词中英文对照缩略词英文全称中文全称EDCsEndocrineDisruptionChemicals内分泌干扰物CYP11B2AldosteroneSynthase醛固酮合成酶D-PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液H295RHumanAdrenocorticalcells人肾上腺皮质癌细胞MVLNHumanbreastcarcinoma人乳腺癌细胞H4IIERathepatomacellline大鼠肝癌细胞RT-PCRReverseTransciptasePolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液盐水cDNAComplementaryDNA互补DNAStARSteroidogenicAcuteRegulatoryProtein类固醇急性调节蛋白DEPCDiethylPyrocarbonate焦碳酸二乙酯BOD5BiochemicalOxygenDemandafter5day五日生化需氧量CODChemicalOxygenDemand化学耗氧量DMSODimethylsμlfoxide二甲基亚砜EEQEstradiolequivalents雌二醇当量值SPESolidphaseextraction固相萃取59 附录二：在读期间科研情况1参与的课题1.1氢醌致骨髓间充质干细胞DNA甲基化和组蛋白甲基化的相互作用及对Wnt信号通路的调控研究。1.2氢醌致TK6细胞恶性转化过程中能量代谢的表型特征及SIRT1介导的相关代谢蛋白的改变。1.3氢醌致TK6细胞恶性转化过程中能量代谢的表型特征及相关调控机制的初步研究。2发表的学术论文2.1LiuX,JungD,Zhouk,etal.CharacterizationofendocrinedisruptionpotentialsofcostalsedimentsofTaean,Korea,employingH295RandMVLNassaysreconnaissanceat5yearsHeibeiSpiritOilSpill,MarinePollutionBulletin,2018,127：264-272.2.2ChenS.LiangH.YangH.Zhouk,etal.LincRNa-p21:functionandmechanismincancer,MedicalOncology,2017,34(5):98.3在校获奖情况3.12016-2017年，获得广东医科大学硕士研究生学业奖学金三等奖及“优秀研究生”称号3.22017-2018年，获得广东医科大学硕士研究生学业奖学金二等奖60'