GBT18873-2008生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则.pdf 9页

'ICS71．040．99N53囝亘中华人民共和国国家标准GB／T18873--2008代替GB／T18873--2002生物薄试样的透射电子显微镜一X射线能谱定量分析通则Generalguideoftransmissionelectronmicroscope(TEM)一X-rayenergydispersivespectrometry(EDS)quantitativemicroanalysisforthinbiologicalspecimens2008—06—16发布2009—03-01实施丰瞀嬲紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” GB／T18873--2008目次前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯··⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯”1范围⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯-·2术语和定义⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·3基本原理⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯-·4仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯·⋯5生物薄标样的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯6生物薄试样⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·7准备工作⋯⋯⋯⋯⋯⋯····⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8选择仪器测量条件⋯⋯⋯⋯·⋯⋯··⋯⋯⋯··9测量分析步骤⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯一10误差⋯⋯⋯··⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·11分析结果的发布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯··附录A(资料性附录)生物组织G因子计算法参考文献⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·【；l123456 前言GB／T18873--2008本标准代替GB／T188732002《生物薄试样的透射电子显微镜一x射线能谱定量分析通则》。本标准与GB／T188732002相比主要变化如下：——生物薄试样的厚度范围定在50nm～300nm(2002年版的2．1、2．2；本版的2．1、2．2)；——对生物薄试样的常见元素测试时，推荐的加速电压值定为35kV～80kV(2002年版的7．1．2、8．1；本版的7．1．2、8．1)；——机械推进式超薄切片机改成超薄切片机(2002年版的4、5．2；本版的4、5．2)；——不推荐使用金网(2002年版的5．3、6．2；本版的5．3、6．2)；——建议在电镜冷阱中加入液氮或使用冷冻样品台(2002年版的7．1．6；本版的7．1．6)。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国微束分析标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学上海医学院、上海市计量测试技术研究院、中国人民解放军军事医学科学院。本标准主要起草人：杨勇骥、俞彰、张训彪、张德添。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T18873--2002． 生物薄试样的透射电子显微镜一x射线能谱定量分析通则GB／T18873--20081范围本标准规定了透射电子显微镜一x射线能谱仪定量分析生物薄试样的技术要求和规范。本标准适用于生物薄试样所含非超轻元素的透射电子显微镜x射线能谱定量分析。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2．1生物薄试样biologicalthinspecimen指采用超薄切片机切成的、厚度为50nm～300nm的生物试样。2．2生物薄标样biologicalthinstandardspecimen指采用超薄切片机切成的、厚度为50nm～300nm的生物标准样品。2．3G因子(或平均加重权)Gfactor(oraverageaggravatingweight)生物试样和生物标样的化学组成成分的元素因子。G因子可用式(1)计算得到：G一∑C。z；／A，⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)式中：c。——薄试样或薄标样化学组成中元素i所占的质量百分比；z：——元素i的原子序数；A——元素i的原子量。3基本原理用聚焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，该区域中所含元素的原子受到高能电子束的激发产生特征x射线，其特征x射线能量对应于相关的元素；特征x射线的积分强度对应于元素的浓度。采用能谱仪将接收到的样品特征x射线峰强度与背景强度(即连续x射线强度)之差与在相同条件下电子束照射生物薄标样获得的特征x射线峰强度与背景强度之差进行比较，确定被测生物薄试样激发区域内各元素的含量。4仪器和设备——透射电子显微镜；——x射线能谱仪；——超薄切片机。5生物薄标样的选择5．1生物薄标样的化学成分要尽可能地与被分析生物薄试样相似，且有化学成分定值。5．2生物薄标样的厚度与被分析生物薄试样的厚度应相近，建议采用超薄切片机切成的厚度小于1 GB／T18873--2008300nm的生物薄标样。5．3生物薄标样所用的载网应是直径3mm的电镜用标准载网，推荐使用碳载网或尼龙载网。5．4用于制备生物薄标样的基质材料，其G因子应接近于生物软组织的G因子为3．28。5．5标样应具有较高的抗电子辐射及抗污染的能力。6生物薄试样6．1生物薄试样的厚度应小于300nm，建议采用超薄切片机切成的生物薄试样。6．2生物薄试样所用的载网应是直径3mm的电镜用标准载网，推荐使用碳载网或尼龙载网。7准备工作7．1电子显微镜系统7．1．1开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上。7．1．2选择测试薄标样所需的加速电压，检测生物薄试样所需的加速电压应选择在35kv～80kV之间。7．1．3调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。7．1．4对电子光学系统进行对中调整，使电子显微镜处于最佳工作状态。7．1．5在定量分析过程中，不能再对电子光学系统进行对中调整。7．1．6建议在电镜冷阱中加入液氮或使用冷冻样品台，以减少样品污染。7．2能谱分析系统7．2．1开机，一般预热30rain左右。7．2．2在不加电镜加速电压的条件下，检测x射线能谱仪的背景计数率，背景计数率应小于60cps。7．2．3x射线能谱仪的能量漂移范围在工作时间内应小于10eV。如峰位漂移较大，可调节能谱仪中的零位调节系统，使峰位漂移小于10eV。7．2．4校检脉冲处理器的状态，调节增益，并使噪音信号尽可能减小。7．2．5定量分析前，必须校检能谱仪的分辨本领。用Mn等标样检查Be窗探测器；用含F标样检查超薄窗探测器低能端的分辨本领。7．2．6检查所得结果，手动或自动输入到计算机中，以备定量分析时调用。注：如仪器有自动校正程序，则不需执行7．2．3和7．2．4。8选择仪器测量条件8．1选择加速电压因大多数生物试样在高加速电压下极易受损，如使用透射电镜对生物试样中常含的原子序数小于32的元素(如Na、Mg、P、S、C1、K、Ca等)进行测试时，推荐的加速电压值为35kV～80kV。8．2选择电子束束流在确定的加速电压下，选择电子束束流使x射线的计数率在800cps～3000cps。8．3选择电子束束斑直径8．3．1保证电子束束斑产生的激发区尺寸不超过待分析区的尺寸，且被分析元素的特征x线的强度足够高(能达到预期的分析精度)。8．3．2推荐采用的电子束束斑直径：对生物薄试样检测分析可采用正聚焦，束斑直径小于0．5v-m。如欲测量较大区域的元素成分，可采用相应的散焦束斑。如欲测量较小区域的元素成分，也可采用直径更小的电子束束斑。8．4选择被分析元素的×线系8．4．1被分析元素的原子序数z≤32时，采用K线系。2 GB／T18873--20088．4．2被分析元素的原子序数72≥Z>32时，采用L线系。8．4．3被分析元素的原子序数Z>72时，采用M线系。8．4．4选择不受重叠峰和逃逸峰重叠的谱线，在确定有峰重叠时应作谱峰剥离。8．5选择能谱仪收谱计数时间能谱仪收谱计数时间一般为100s。在测量低浓度含量元素并有精度要求时，应适当延长计数时间，并满足式(2)的要求：N。一Nb≥3(Nb)”2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)式中：N。——该元素谱峰处计数；Ne——背景计数。9测量分析步骤9．1确定分析部位9．1．1在透射电子显微镜或扫描透射电子显微镜中寻找试样的分析部位，确定后将分析部位置于电子显微镜的观察中心。9．1．2使电子束会聚，并保持图像清晰，调整电子束束斑到观察荧光屏的中心位置上，并使分析部位置于荧光屏的中心位置上。在寻找标样和试样时只能移动x、y轴，不能调整电子光学系统(包括物镜聚焦)。9．2定性分析选用适当的加速电压和计数时间，收谱后采用峰鉴别检查试样中所含元素的种类。9．3建立标准样品数据库根据定性分析结果，建立或调用相应的标准样品的数据文件。建立被分析样品的文件清单(元素、线系、测量条件、处理模式)等。9．3．1在完全一致的测量条件下(束流、加速电压、计数时间、放大器的增益、束斑大小及检出角)收集标准样品的x射线谱线，并可根据不同类型的试样建立不同类型的标样数据库。如测量条件发生变化，应建立新的标样数据库。9．3．2在对试样定量分析前，应调用相应程序测量有关标准样品，其分析结果的误差应小于允许误差。9．4定量分析9．4．1根据试样的特征，采用完全一致的测量条件及调人生物x射线能谱定量分析程序，建立分析试样所需的标准样品数据文件。9．4．2选用与已建立的标样数据库完全一致的测量条件进行谱的采集。9．4．3重叠谱峰剥离。如有谱线重叠时，应进行重叠峰的剥离。必要时应使用成分相近的标样进行验证。9．4．4背景测量。用设置两个背景窗口的方法进行背景扣除，背景窗口建议设置在感兴趣元素谱峰的附近两侧，如感兴趣元素较多，应尽可能将背景窗口分别设置在感兴趣元素谱峰的高、低能量段处。或用手动背景划线法扣除背景。9．4．5计算各元素的特征x射线相应强度比，并计算出试样中各元素的相应含量。10误差10．1误差计算公式在发布分析结果时，应同时给出生物薄试样定量分析的相对误差值，其相对误差值的计算公式如式(3)：3 GB／T18873--2008肛弼×eCb式中：cb——标样元素浓度；e——试样元素浓度；n——测量次数；N——扣除背景的被测元素的计数平均值。10．2为减小相对不确定度值，建议选取浓度值较低的标样作为测试用标样。11分析结果的发布”．1定量分析结果的报告应包括以下信息：a)分析报告的唯一编号；b)分析报告的页码；c)分析报告的日期；d)实验室名称和地址；e)送样人姓名，单位和地址；f)样品的接收Et期；g)样品原编号，分析编号及样品特征的描述；h)分析所依据的标准方法；i)选用标准样品的种类、级别、浓度、G因子；j)分析结果和必要的相对误差值；k)分析仪器及其工作条件，所用标样等}1)分析报告负责人的签字。11．2生物薄试样内非超轻元素的能谱探测极限约在0．1mmol／kg左右，对低于0．1％mmol／kg浓度的元素定量分析值应有分析方法的补充说明。 A．1导言附录A(资料性附录)生物组织G因子计算法GB／T18873--2008本附录给出了生物组织、生物标样G因子的计算方法。并已计算出了透射电镜一x射线能谱仪常测试的生物软组织的G因子。A．2生物组织的G因子计算生物软组织的G因子计算法如式(A．1)：G—z2／A一∑C,Z；／A。1式中：z——元素的原子序数；A——元素的原子量；c：——薄试样或薄标样化学组成中元素i所占的质量百分比z：、A——分别为元素i的原子序数与原子量。A．3生物软组织的G园子计算生物软组织的元素、所占质量百分比及计算结果如表A．1。表A．1生物软组织的元素、所占质量百分比及计算结果元素质量百分比孑A罾{AC。z：{A。H0．071l10．07C0．05361231．50N0．164914350．56o0．2564164I．00S+P0．0224031．57．70．15孑／A=∑GZi／A。3．28A．4生物软组织的G因子由表A．1，生物软组织的G因子为3．28。5 GB／T18873--2008参考文献[1]HutchinsonTE．Microprobeanalysisofbiologicalsystems．NewYork：AcademicPress，1981．Ez]HallTA，AndersonHC，AppletonT．TheuseofthinspecimensforX—raymicroanalysisinbi—ology．JMicrosc，1973：99～177．[33杨勇骥，郑尊，夏愿耀．建立一种新型Agarose薄标样一应用于生物EDX定量分析．第二军医大学学报，1991：12～67．[4]ChandlerJA．AmethodforpreparingabsolutestandardsforquantitativecalibrationandmeasurementofsectionthicknesswithX—-raymicroanalysisofbiologicaluhrathinspecimensinEM—MA．JMicrosc，1976：106～29l‘[5]ShumanH，SomlyoAV，SomlyoAP．Quantkativeelectronprobemicroanalysisofbiologicalthinsection：methodsandvalidity．Uhramicroscopy，1976：1～317．[6]HarveyDMR，FlowersTJ，KentB．ImprovementofquantitativeofbiologicalX—raymicroanal—ysis．JMicrosc，1984：143～249．6'