GBT23196-2008蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱-紫外检测法.pdf 8页

'ICS65．140B47a雪中华人民共和国国家标准GB／T23196—2008蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱一紫外检测法Determinationofferulicacidcontentinpropolis--HPLC-UVmethod2008-12-31发布2009—06-01实施宰瞀徽鬻瓣警麟瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1” 刖昌GB／T23196--2008本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。本标准起草单位：杭州澳医保灵药业有限公司、中华全国供销合作总社蜜蜂产品标准化技术委员会、中国农业科学院蜜蜂研究所、江苏出入境检验检疫局、南京大学、江苏老山生物科技有限公司。本标准主要起草人：虞英民、胡晓岚、朱金梁、徐承智、周金慧、李公海、陈坤、练鸿振。 蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱一紫外检测法1范围本标准规定了蜂胶中阿魏酸含量的液相色谱测定方法。本标准适用于蜂胶中阿魏酸含量的测定。本标准的检出限：4}tg／kg。2规范性引用文件GB／T23196—2008下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB／T66822008，ISO3696：1987，MOD)3原理蜂胶中的阿魏酸经甲醇超声提取、沉淀、离心，再用0．45pm滤膜过滤后得澄清液，经反相色谱柱分离后，用液相色谱一紫外检测器测定，外标法定量，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯；水为GB／T6682规定的一级水(为蒸馏水或同等纯度水)；未指明用何种溶剂配制时，均指水溶液。4．1甲醇：色谱纯。4．20．085％磷酸溶液(体积分数)：量取o．85mL磷酸，用水定容至l000mL，经0．45pm滤膜过滤。4．3乙腈：色谱纯。4．470％甲醇(体积分数)：量取70mL分析纯甲醇，加30mL水混合均匀。4．5阿魏酸标准物质：纯度≥99％。4．6阿魏酸标准储备溶液(200．0}tg／mL)：准确称取10．0mg(精确到0．1mg)阿魏酸标准物质(4．5)于50mL棕色容量瓶中，加70％甲醇(4．4)使其溶解并定容至刻度，混匀，此溶液可在温度低于4℃冰箱中冷藏保存两个月。4．7阿魏酸标准工作溶液：分别吸取适量的阿魏酸标准储备溶液(4．6)1mL、2．5mL、5．0mL、10．0mL、20．0mL、40．0mL、80．0mL至100mL容量瓶中，用70％甲醇(4．4)定容至刻度，配成2．0／19／mL、5．0／Lg／mL、10．0btg／mL、20．0tlg／mL、40．0／19／mL、80．0btg／mL、160．0pg／mL标准工作溶液，现配现用。5仪器与设备5．1液相色谱仪：配有紫外检测器。5．2分析天平：精确至0．1mg。5．3过滤膜(聚偏氟乙烯微孔滤膜F型，425mm)：0．45pm。5．4超声仪。】 GB／T23196—20085．5离心机。5．6匀浆仪。6试样的制备与保存6．1试样的制备从全部蜂胶样品中取出约100g样品，装入洁净容器中分成两份，密封，并做标记。6．2试样的保存将试样于一10℃以下保存。7测定步骤7．1试样处理将试样置冰柜中一10℃以下冷冻，取出冷冻贮存的试样20g～30g，迅速用匀浆仪打碎，称取试样0．5g(精确到0．1mg)，置于50mL棕色容量瓶中，加入35mL甲醇(4．1)，超声15min(频率为25kHz，功率为50w)，加入10mL水，摇匀，冷却到室温后，用水定容至刻度，混匀；以4500r／min的转速离心20min，上清液用0．45tim滤膜(5．3)过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。7．2色谱测定7．2．1液相色谱条件a)色谱柱：HypersilODS2，5pm，4．6mm×200mm。b)流动相：以0．085％磷酸溶液(4．2)为流动相A，以甲醇(4。1)为流动相B，以乙腈(4．3)为流动相C，按表1进行梯度洗脱。表1梯度洗脱方法时间／min流速／(mL／min)0．085％磷酸溶液(流动相A)／％甲醇(流动相B)／％乙腈(流动相c)／％0～201．083O1720～211．O—，l583—-OO—-10017—-021～361．5O100036～371．50—，83100—，00—·1737～521．583017c)梯度洗脱方法：见表1。d)进样量：20pL。e)检测波长：316rim。f)柱温：30℃。7．2．2液相色谱测定测定5个～7个系列浓度标准工作溶液(4．7)在上述色谱条件下的峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线，然后测定未知样品，用标准工作曲线对样品进行定量，使样品溶液中阿魏酸的响应值在本法的线性范围内。在上述色谱条件下，阿魏酸的保留时间约为13．9min，阿魏酸标准物质色谱图和含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图参见图A．1、图A．2。7．3平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。7．4空白试验除不称取试样外，均按上述步骤，应不干扰测定。2 8结果计算试样中阿魏酸含量利用数据处理系统计算或按式(1)计算x一生塑m式中：x——试样中阿魏酸的含量，单位为微克每克(p．g／g)；c——试样中阿魏酸的浓度，单位为微克每毫升(,ug／mL)50——试样定容体积(mL)；m——试样的质量，单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。9精密度GB／T23196—2008在对同一试样进行二次平行试验获得的二次测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％。本标准的研究资料参见附录B和附录C。 GB／T23196--2008附录A(资料性附录)标准物质色谱图和含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图A．1阿魏酸标准物质色谱图，见图A．1。555。454035l30暮。；20151。5o口{。尝鼍NfI】．o123456789lOj1121314151617181920时间／m,n图A．1标准物质色谱图A．2含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图，见图A．2。4555。454。35l300。。2。15lO5Oi⋯卧．罄．Jm01234567891011121314151617181920时闻／mm图A．2样品色谱图 B．1线性关系考察：见表B．1。附录B(资料性附录)方法学研究资料表B．1含量测定线性关系试验结果(H：7)GB／T23196—2008浓度／(pg／mL)2．05．010．020．040．080．01600峰面积1193342718405427931059571214452743881008443418线性方程，=52976x+25179R2—0．9996B．2紫外扫描图：见图B．1。遥罄督峰值检测序号波长／rim吸收值1316．400．42l2386．80一0．0033258．800．104图B．1紫外扫描图5 GB／T23196--2008附录C(资料性附录)阿魏酸CAS：1135—24—6英文名称：3一(4一hydroxy-3一methoxyphenyl)一2一propenoicacidferulicacid4-hydroxy-3一methoxycinnamicacid3-methoxy-4一hydroxy-cinnamicacid化学名称：3一(4一羟基一3一甲氧基苯基)2一丙烯酸阿魏酸4一羟基一3一甲氧基肉桂酸3一甲氧基一4一羟基肉桂酸相对分子质量：194．19分子式：C1。H1。0。结构式：。@妙o／H111jO性状描述：有顺反异构体。E型，正方棱状结晶，熔点为174℃；z型，黄色油状液体，溶于热水、乙醇、乙酸乙酯，乙醚中可溶，石油醚、苯中难溶。6'