db13 t 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定.pdf 16页

'免费标准网(www.freebz.net)ICS67.100X16DB13河北省地方标准DB13/T1080-2009乳及乳制品中p一内酞胺酶的测定Detectionof(3-lactamasesinmilkandmilkproducts2009-05-27发布2009-06-11实施河AL省质RIP技术11/I--督局发布免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009.舀L.J.目月U青本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。本标准第一法主要起草人:周正、周巍、李丛芬、穆燕魁、张岩。本标准第二法主要起草人:李挥、张敬轩、庞坤、范斌、张岩。本标准第三法主要起草人:闰静辉、陈英珠、昊萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚璞。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009乳及乳制品中p一内酞胺酶的测定第一法杯碟法1范围本标准规定了乳及乳制品中R一内酞胺酶的检验方法一杯碟法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性且对舒巴坦敏感的卜内酞胺酶的检验。木方法的检出限为4U/:nLo2原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制p一内酞胺酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对加人R一内酞胺酶抑制剂与未加人抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的R一内酞胺酶。3设备和材料3.1抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱:36℃土19Co3.3高压灭菌器。3.4无菌培养皿:内径90mm，具陶瓦盖。3.5无菌牛津杯:外径(8.0土0.1)mm，内径(6.0土0.1)mm，高度(10.010.1)mm,3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。3.7无菌吸管:1mL(0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)。3.8加样器:55L^205L,205L-2005L及配套吸头。4培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。4.1试验菌种:藤黄微球菌(Micrococcusluteus,CMCC(B)28001)，使用菌株代数3-14代。4.2磷酸盐缓冲溶液:按附录A中A.1规定。4.3生理盐水(8.5g/L):按附录A中A.2规定。4.4青霉素标准溶液:按附录A中A.3规定。4.5(3一内酞胺酶标准溶液:按附录A中A.4规定。4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.5规定。4.7营养琼脂培养基:按附录A中A.6规定。4.8抗生素检测用培养基I:按附录A中A.7规定。4.9空白牛奶:按附录A中A.8规定5操作步骤5.1菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经3611℃培养18h^-22h，用无菌生理盐水洗下菌苔即为免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1X1010CFU/mL,4℃保存，贮存期限2周。5.2样品的制备将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为:A,B,C,D，每个样品做三个平行。5.3对照的制备5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加人到1.5mL离心管中共四管，分别标为:A,B,C,D，每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加人p一内酚胺酶标准溶液255L，共做四管，分别标为A,B,C,D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用平板的制备取90mm灭菌培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基丑，凝固后上层加入5mL含有浓度为1X108CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基I，每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯。5.5样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、p一内酞胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加人到5.2各离心管中:A青霉素55LoB舒巴坦255L、青霉素5pLocp一内酞胺酶25pL(终浓度4U/mL)、青霉素55LoDR一内酞胺酶255L(终浓度4U/mL)、舒巴坦255L、青霉素5pLo将上述A-D试样混匀后各取200林L加人放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36土1℃培养18-22h,测量抑菌圈直径。取三组平行试验平均值。6结果观察各平行试验结果差异应小于2.0mm;阴性对照与阳性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。表1实验现象对应表阴性对照阳性对照A抑菌圈直径应在20土2.0mm范围内B、D均产生抑菌圈B.D均产生抑菌圈C抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0mmC抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0mmA抑菌圈与B抑菌圈差异小于3.0mmA抑菌圈与B抑菌圈差异大于等于3.0mm7结果报告7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象一致可判定检验结果阴性。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009第二法高效液相色谱一质谱/质谱法1范围本标准规定了乳及乳制品中具有活性的p一内酞胺酶的高效液相色谱一串联质谱的定性检测方法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性的p一内酞胺酶的定性检验。本方法对p一内酞胺酶的检测低限为4U/mL02规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法(GB/T6682-2008,ISO3696:1987,MOD)03原理利用p一内酞胺酶酶解青霉素族药物的原理，在试样中加人一定量氨节青霉素，酶解后，试样中氨节青霉素经乙睛一水溶液提取，提取液浓缩后，用缓冲溶液溶解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱一质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨节青霉素酶解率，间接定性p一内酞胺酶。4试荆除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛:高效液相色谱级。4.2甲醇:高效液相色谱级。4.3甲酸:高效液相色谱级。4.4氯化钠。4.5氢氧化钠。4.6磷酸二氢钾。4.7磷酸氢二钾。4.80.1mol/L氢氧化钠:称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mLo4.9乙睛+水(15+2，体积比)。4.10乙睛+水(30+70，体积比)。4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0):称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL,用氢氧化钠调节pH至7.0士0.104.120.01mol/L乙酸钱溶液(pH=4.5):称取0.77g乙酸按，超纯水溶解，稀释至1000mL，用甲酸调节pH=4.5土0.104.13氨节青霉素标准品:纯度大于等于95%04.14标准储备溶液(1005g/mL):称取适量标准品(4.14)，用超纯水溶解并定容至1000mL，置于一18℃冰箱避光保存，保存期5d04.15标准工作溶液:吸取适量的氨节青霉素标准储备液(4.15)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱，或相当者:500mg,6mL，使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1mL水淋洗小柱。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-20095仪器5.1液相色谱一质谱/质谱仪(LC-MS/MS):配有电喷雾离子源。5.2旋转蒸发器。5.3固相萃取装置。5.4低温冷冻离心机。5.5均质器。5.6涡旋混合器。5.7PH计。5.8氮吹仪。6试样制备与保存取代表性样品，混匀后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0-4℃冷藏存放。7分析步骤7.1氨节青霉素的加入称取lOg样品(精确到0.01g)于50mL离心管中，加人0.1mL氨节青霉素标准储备液(4.15)，混匀。7.2酶解将7.1试样置于37℃恒温水浴，酶解Iho7.3提取在7.2酶解后的试样中加人20mL乙睛(4.9)，均质提取30s,4000r/mh，低温冷冻离心5min，上清液转移至50mL离心管中;另取一离心管，加人10mL乙睛水溶液(4.9)，洗涤均质器刀头，用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器刀头溶液，在涡旋混合器上振荡Imin,4000r/min低温冷冻5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液(4.9)洗涤刀头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙睛水溶液(4.9)定容至50mL。准确移取25mL于100ml鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上(37℃水浴)蒸发除去乙睛，易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液。7.4净化迅速向已除去乙睛的鸡心瓶中加人25mL磷酸盐缓冲溶液(4.11),涡旋混匀1min，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH为8.5,通过经过预处理的固相萃取柱，流速控制在1rnllmin，先用2mL磷酸盐缓冲溶液(4.11)淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗，然后用3mL乙精洗脱，流速控制在1mL/min。将洗脱液于45℃下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液(4.12)定容至1mL，过0.225m滤膜，供LC-MS/MS分析。7.5测定7.5.1参考色谱条件7.5.1.1色谱柱:ODS-C18柱，250rnmx4.6mm，粒度55m，或相当者。7.5.1.2流动相:A组为0.01mol/L乙酸按溶液(甲酸调pH至4.5);B组为乙睛。A:B=90:1007.5.1.3流速:1.0m[2min07.5.1.4进样量:105L07.5.2参考质谱条件7.5.2.1离子源:电喷雾离子源。7.5.2.2扫描方式:正离子扫描。7.5.2.3检测方式:多反应监测(MRM)07.5.2.4毛细管电压:4000V0免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-20097.5.2.5雾化气压力:0.055MPa07.5.2.6干燥气流速:10Umin07.5.2.7离子源温度:350907.5.2.8定性离子对、定量离子对等参数见表10表1氨节青霉素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和碰撞电压”一’}’.-.一’定性}定量}碰撞气碰撞名称离子对离子对能量电压(m/z)(m/z)(V)(V)氨节青霉素350/192350/160ampicilin350/1607.5.3液相色谱一质谱/质谱测定7.5.3.1定性测定选择氨节青霉素的I个母离子，2个及以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在士2.5%之内;样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的色谱图中离子相对丰度比，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差%相对离子丰度>50>20-50>10-20成10允许的最大偏差士20士25士30士507.5.3.2足量测足用氨节青霉素标准储备溶液配成的基质标准溶液(4.16)进样分析，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行单点校准，外标法计算。7.5.4本底实验除不加氨节青霉素外，均按上述操作步骤进行。8结果计算与表述8.1试样中氨节青霉素含量的计算试样中氨节青霉素的含量(5g/kg或FLgfL):按式(1)计算X=A竺xV(1)AsxW式中:x—试样中氨节青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(W叭g或5叭);A—试样溶液中氨节青霉素的峰面积;AS一标准工作液中氨节青霉素的峰面积;CS—标准工作液中氨节青霉素的浓度，单位为微克每千克或微克每升(W叭g或Wg/L);V—试液最终定容体积，单位为毫升(mL);W—最终样液代表的试样质量，单位为克(g)0计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留3位有效数字。计算结果需折算回收率。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-20098.2重复性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%08.3回收率本方法在试样中添加0.5m叭g-2m叭g浓度时回收率为80%-110%9定性判定9.1氮节青霉素的酶解率酶解后试样中氨节青霉素的酶解率(%):按式(2)计算。=co-(C-(卫X100(2)Co式中:Y-酶解后试样中氨节青霉素的酶解率，单位为百分比(%);Co酶解前试样中氨节青霉素的加人浓度，单位为微克每千克或微克每升伽叭g或ILg/L);C-酶解后试样中氨节青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(FLg/kg或林昨);Cs-酶解后试样本底中氨节青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升伽眺g或W叭)。9.2结果判定酶解率多30%，则判定为阳性。酶解率<30%，则判定为阴性。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009第三法碘量法1范围本标准规定了鲜乳中p一内酞胺酶的快速碘量法检测方法。本标准适用于鲜乳中R-内酞胺酶的测定。本方法对p一内酞胺酶的检测低限为5U/mL,2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法(GBIT6682-2008,ISO3696:1987,MOD).3原理R一内酞胺酶能裂解青霉素的R一内酞胺环形成青霉a哇酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为白色。如果牛奶中的卜内酞胺酶浓度高于检测限，检测结果为白色。4试剂除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.，可溶性淀粉:按附录C中C.1规定。4.2碘:按附录C中C.2规定。4.3碘化钾:按附录C中C.3规定。4.4盐酸:按附录C中C.4规定。4.5青霉素钠:按附录C中C.5规定。4.6(3一内酞胺酶对照品:按附录C中C.6规定。4.7不含R一内酞胺酶的乳品:按附录C中C.7规定。5仪器5.，冷冻干燥机。5.2恒温干燥箱:40CC,5.3微量振荡器。5.4分析天平:精度0.001g05.5微波炉。5.6移液器:10AL,405L,150AL.5.7冰箱。5.8微孔板。6试样制备与保存取代表性样品，混匀后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0-4℃冷藏短期存放。7对照制备7.1取阳性对照，用移液器注人500pL水，振荡，充分溶解备用;7.2取阴性对照:用移液器注人5005L水，振荡，充分溶解备用;免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-20098测定8.1根据检测样品数量取适量的检测孔，每孔检测一个样;8.2取阳性对照1505L加人1个小孔中;8.3取阴性对照1505L加人1个小孔中;8.4样品处理:取奶样，去除悬浮物，用微量移液器吸取奶样1505L分别加人到检测孔中;8.5所有样品加完后，贴封口膜，置微量振荡器上振荡10分钟;8.6放人40℃恒温箱中，保温20分钟;8.7取出检测孔，除去封口膜，用微量移液器吸取1%的淀粉溶液，每孔加人405L，振荡混匀;8.8用微量移液器吸取碘液，每孔40pL，用移液器吹吸均匀;8.9振荡2分钟，观察结果。9检测注意事项混匀要彻底，但不要产生泡沫，严禁将样品溅出。10结果判定白色为阳性。蓝色为阴性。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009附录A(规范性附录)培养基A.1磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)无水磷酸二氢钾8.0g无水磷酸氢二钾2.0g蒸馏水加至1000mLA.2生理盐水(8.5叭)氯化钠8.5g蒸馏水1000mL121℃高压灭菌15min.A.3青霉素标准溶液准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1mg/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。A.4p一内酞胺酶标准溶液准确量取或称取适量R一内酞胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为160U/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。A.5舒巴坦标准溶液准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1mg/mL的标准溶液，分装后一20℃保存备用，不可反复冻融使用。A.6营养琼脂蛋白月东10g牛肉膏39氯化钠59琼脂15-20g蒸馏水1000mL将上述成分加人蒸馏水中，搅混均匀，分装试管每管约5^"8mL,120℃高压灭菌15min，灭菌后摆放斜面。A.7抗生素检测培养基11蛋白陈10g牛肉浸膏39氯化钠59酵母膏3g葡萄糖19琼脂14g蒸馏水1000mL将上述成分加人蒸馏水中，搅混均匀，120℃高压灭菌15min，其最终pH值约为6.6.A.8空白牛奶脱脂奶粉标准品2g蒸馏水20mL准确称取脱脂奶粉标准品2g,蒸馏水定容至20mL免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009附录B(资料性附录)氨节西林标准品的总离子流图和定量、定性离子对色谱图+刃TICM尹RM("->")hb-2.du二101201八109日1昭卜卜卜07曰06日0.5.，104Je03i02;0.IJ。f一、一’‘一介“一、‘一‘、叫一一一__一_冲__一。一升一一、.~.一，-一j0.51.522.533.544.555.566.577.588AcquisitionTime(min)，.氨节青霉素图A.1氨节青霉素标准溶液(10.L叭)的总离子流色谱图+MRM(350.0->160.0)hb-2.d350.0一>160.0.350.0一>192.0+MRM:2(1.826-2.386min,158scans)(3月.U.X103萝x102司二10ampicillin山!鸳X10’}160.060U，UJ.;八-舀.门101.86-+一’92.0JPIU0口1洲n︺-1刁.峙Jq!日1.4ji}<:10自1.2弋1!勺田0月…U气>es川:曰一︸!门0月J，·{}{内一口马‘J.:匡!曰、!0，::J1曰.︸，}.、1吐、n1350.0一~~尸.介一.—一~一产~-—一一一‘~一__上_一__.，.____.____竞__1.522.531.522.53150200250300350AcquisitionTime(min)AcquisitionTime(min)Mass-to-Charge(m/z)图A.2氨节青霉素标准溶液(105叭)的定量、定性离子对色谱图10免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)DB13/T1080-2009附录C(规范性附录)试剂C，.试剂保存试剂配制好，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0^-4℃冷藏存放。C内‘青霉素工作液配置取青霉素钠，充分溶解，配成20m岁mlC.396孔板点板吸取青霉素工作液加人到96孔板小孔中，50ul/孔。C.41%的淀粉溶液称取5g可溶性淀粉，溶于沸水，定溶500m10C.5碘液35gKI溶于800ml水，在加入13gI2，溶解，加人500ul盐酸，混匀，定溶到1000ml，闭光保氛C.6阳性样品取不含p一内酞胺酶的乳品0.5ml，加人100单位p一内酞胺酶，冷冻干燥。C.7阴性样品取不含R一内酞胺酶的乳品0.5ml，冷冻干燥。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)成UO创!0田0尸卜门尸泊自免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载'