毕业论文玉米芯诱导里氏木霉合成纤维素酶.doc 37页

'SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ毕业论文玉米芯诱导里氏木霉合成纤维素酶学院：专业班级：学生姓名：学号：指导教师：201年月32 目录摘要纤维素类物质是自然界中最具潜力的一种可再生资源，其有效利用是目前人们关注的热点。作为降解纤维素的多组分酶系，纤维素酶降解纤维素特异性高，反应条件温和，环境污染小。但由于其组分复杂，合成代谢网络研究尚不清楚。此外，真菌纤维素酶多数是诱导酶，其合成须在诱导物存在下才能进行，通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的有效方法。因此，研究以天然纤维素物质为底物的纤维素酶合成过程机理，充分挖掘现有生产菌株产纤维素酶的潜力，是解决纤维素酶诱导合成问题的关键。本文对天然纤维素物质玉米芯诱导里氏木霉产纤维素酶的过程进行了分析，通过测定玉米芯酶解液中糖的组分，并以所测定到的组分为诱导物进行诱导产酶，发现除纤维素成分外，半纤维素水解产物半乳糖对纤维素酶的合成有诱导作用。通过优化半乳糖的诱导浓度，发现5g/L的半乳糖对纤维素酶的诱导最好。关键词：里氏木霉、纤维素酶、玉米芯、诱导32 目录AbstractCelluloseisanaturalsubstanceinthemostpotentialasarenewableresource,anditsefficientuseiscurrentlythefocusofattention.Asamulti-componentenzymesdegradecellulose,cellulosedegradationofcellulosehighspecificity,mildreactionconditions,environmentalpollution.However,duetothecomplexityofitscomponents,anabolicNetworkResearchunclear.Inaddition,mostofthefungalcellulaseenzymeinduction,inductionofthesynthesismustbecarriedoutunderthepresence,andbyaddingtheinducerofcellulasesynthesispathwaytoimprovethecellulaseactivityregulatingeffectiveway.Therefore,thestudyofnaturalcellulosicmaterialsassubstratescellulasesynthesismechanismtofullyexploittheexistingstrainsproducingcellulaseproductionpotentialistosolvetheproblemofliquidfermentationofcellulasekey.Inthispaper,naturalcellulosesubstancescorncobinducedTrichodermareeseicellulaseproductionprocesswasanalyzedbymeasuringthesugarincorncobhydrolyzatecomponents,andthegrouptowhichthemeasuredinducerforinductionintoproductionenzymes,foundthatinadditioncelluloseingredients,hemicellulosehydrolyzategalactoseoncellulasesynthesisinduced.Byoptimizingtheconcentrationofgalactoseinduction,found5g/Lofgalactoseinductionofcellulasebest.Keywords:Trichodermareesei,cellulase,corncob,inducing32 目录目录摘要IABSTRACTII目录III第一章绪论研究进展，立项依据11.1里氏木霉简介11.2木质纤维素原料的组成11.3纤维素酶研究进展21.3.1纤维素酶的性质和种类31.3.2纤维素酶的作用机理41.3.3纤维素酶的来源41.3.4纤维素酶的应用51.4里氏木霉产纤维素酶的诱导物61.4.1纤维素61.4.2槐糖71.4.3乳糖71.4.4纤维二糖71.5立项依据71.6本文研究问题8第二章材料方法102.1菌种102.2主要实验仪器102.3实验药品112.4实验试剂122.4.1柠檬酸缓冲液122.4.2DNS反应液122.4.3微量元素122.5实验培养基122.5.1PDA培养基122.5.2菌丝培养基（G/L）132.5.3诱导培养基（G/L）132.6实验方法：1332 目录2.6.1预培养132.6.2菌丝的获取132.6.3取样142.6.4酶活的定义及测定方法14第三章结果与讨论183.1玉米芯酶解液中糖组分的分析183.1.1不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况183.1.2不同诱导物诱导产Β-葡萄糖苷酶的情况193.1.3不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况203.2不同组分对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响213.2.1不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况213.2.2不同混合诱导物诱导产Β-葡萄糖苷酶的情况223.4半乳糖诱导浓度对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响233.4.1不同半乳糖浓度对滤纸酶活的影响233.4.2不同半乳糖浓度对Β-葡萄糖苷酶活的影响24结论25参考文献26致谢27附录…………………………………………………………………………...……...3032 第一章绪论研究进展，立项依据第一章绪论研究进展，立项依据1.1里氏木霉简介里氏木霉（Trichodermareesei）是多细胞的真核微生物，菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色。分生孢子梗菌丝的短侧枝，透明，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲；分生孢子椭圆形或长形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色。其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等[1]，已有多年历史。里氏木霉是迄今为止,产纤维素酶能力最强的常用的微生物。其纤维素酶产量高;产生的纤维素酶是胞外酶,易与菌体分离纯化从而得到所需的酶;里氏木霉及其代谢物安全无毒,不会影响生产人员和环境[1]。里氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的里氏木霉重组菌株是安全无害的。·1.2木质纤维素原料的组成[2]木质纤维素原料主要由3种成分组成即：纤维素（占干重的30～60％）、半纤维素（占干重的20～40％）、木质素（占干重的10～30％）。纤维素是由葡萄糖单体以β-1，4-糖苷键连接而成的直链多糖，聚合度很大（分子量达200-2000kDa），其基本组成单位是纤维二糖。纤维素大分子之间排列整齐形成结晶结构，这种结晶结构严重影响了它的水解性能。纤维素水解时主要产物是葡萄糖。半纤维素一般由较短、高度分枝的杂多糖链组成，主要有木聚糖、阿拉伯-木聚糖、葡萄-甘露聚糖、半乳-葡萄-甘露聚糖等，多以β-1，4-糖苷键连接。在植物细胞壁中，它位于纤维素之间，好像是一种充填在纤维素框架中的填充料。半纤维素比纤维素较容易水解，水解时可以产生木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖等，其中木糖占一半以上，因此木糖利用对开发利用半纤维素至关重要。32 第一章绪论研究进展，立项依据木质素是芳香族多聚物，由苯丙烷单元通过醚键和碳-碳键连接的复杂的无定形高聚物。木质素通过酯键、醚键和糖苷键与纤维素和半纤维素相连，其对化学和酶降解的抗性非常强，不能被微生物发酵转化生成乙醇，但可以被白腐菌等真菌降解。其水解产物极其复杂，主要形成多种芳香类化合物，多为发酵抑制物。·1.3纤维素酶研究进展现有的纤维素酶酶活低，生产成本高，是制约其工业化应用的瓶颈，目前从酶制剂公司购买纤维素酶制剂用于木质纤维素降解产糖，在经济上无法达到商业化要求。围绕提高纤维素酶活力、降低生产成本已展开了不少研究工作：针对纤维素酶活力提高方面，Adsul和He[3,4]等采用化学、物理诱变结合的方法分别对Penicilliumjanthinellum和T.reeseiRutC30进行改造，结果FPA和CMCase酶活力均比改造前提高了2倍。此外，采用基因工程的方法来高效表达纤维素酶及采用蛋白质工程和定向进化的方法改造纤维素酶也有相关文献报道[5-7]。国内山东大学曲音波教授课题组已筛选得到一株具有自主知识产权的斜卧青霉Penicilliumdecumbens菌株，并一直致力于该菌株的改造、发酵工艺及其纤维素酶合成调控机理研究[8-10]，以期早日得到可工业化生产的工程菌株。虽然这些研究取得了不错的结果，但大部分仅限于基础实验研究，离工业化应用还有很长一段距离。针对降低纤维素酶生产成本方面，美国能源部与全球两大酶制剂公司(GenencorInternational和NovozymesBiotech)于2004年合作开发了一项新技术，对纤维素酶三个组分（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）进行合理搭配。这些酶共同作用袭击纤维素链，破坏其晶体结构，切断成纤维二糖，再切成葡萄糖单分子[11]。这项突破虽大大降低了纤维素酶成本，但还不能满足工业化要求，需进一步降低成本以支撑其市场竞争力。近年来，许多科学家提出了采用现场（On-site）生产的方式来降低纤维素乙醇生产中纤维素酶的成本。该方法的优点在于生产出的粗酶液不需经过分离、储藏和运输，而直接用于下游工艺，从而大大降低了纤维素酶的生产成本。纤维素酶现场生产技术的核心仍是优良的纤维素酶工业生产菌株。因此，必须就现有生产菌株，研究其生长代谢的一般规律，充分挖掘其生产纤维素酶的潜力，最大限度地提高其纤维素酶的生产能力，从而降低纤维素酶的生产成本。真菌纤维素酶大多是胞外酶，且是诱导酶，纤维二糖、槐糖、乳糖等均是纤维素酶合成的有效诱导物[12-14]32 第一章绪论研究进展，立项依据。作为纤维素酶分解的底物，纤维素本身即是良好的诱导剂，但由于天然纤维素是不溶性的，这种不能透过细胞膜的非水溶性聚合物是如何诱导纤维素酶合成的？Suto等[15]提出了T.reesei纤维素酶的诱导过程：纤维素与分生孢子接触后，被孢子表面的纤维二糖水解酶降解为纤维寡糖，随后被组成型β-葡萄糖苷酶转化成葡萄糖与槐糖。葡萄糖作为碳源，槐糖作为诱导物进入细胞，诱导纤维素酶的合成，合成的纤维素酶分泌到胞外，然后再降解纤维素，生成大量的纤维寡糖和葡萄糖，如此循环直至纤维素被耗尽。对于这种理论，如何从分子层面来解释纤维素酶的诱导机理？近年来，随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学的迅速发展，抗体技术、RT-PCR技术、反义RNA技术等的出现以及各种检测技术的发展，为纤维素酶的各组分及其相关基因的特异性识别和定量检测提供了合适有效的工具。El-Gogary和Carle-Urioste等[16-19]通过抗体竞争和反义RNA实验证实，细胞壁上的少量结构纤维素酶CEL7A(CBH1)和CEL6A(CBH2)可启动纤维素的降解，然后释放寡糖，进一步诱导纤维素酶的合成。Seiboth等[18]证明cel7a和cel6a是T.reesei与纤维素降解的启动有关的基因，敲除这两个基因，该菌无法利用纤维素进行生长。另有实验表明T.reesei菌株的分生孢子中含有可水解纤维素的表面结合活性蛋白[17]。通过非离子洗涤剂除去这些蛋白后，破坏了分生孢子启动纤维素降解的作用。研究发现，这种活性蛋白是CEL6A酶。向T.reesei导入cel6a基因的多拷贝数后可增强CEL7A和CEL6A的分泌，并提高纤维素酶活性，而敲除该基因的菌株其生长及纤维素酶合成均表现出明显的延迟。由此可见，CEL7A和CEL6A以及它们对应的基因cel7a和cel6a在以纤维素为底物合成纤维素酶的过程中起着至关重要的作用。此外，三个正转录激活子（XYR1，ACE2和HAP2/3/5复合体）与两个抑制子（ACE1和碳代谢物抑制子CRE1）以及它们对应的基因xyr1、ace2、hap2、hap3、hap5、ace1和cre1被报道参与纤维素酶基因表达调控体系[19-24]。因此，纤维素酶的整个表达过程不是简单的由碳源代谢抑制控制，同时还需要激活因子的调控。最近，Foreman等[25]又识别了几个基因，它们的调控作用表明其与诱导纤维素酶表达有很大关系。在这些基因中，cel5b基因的mRNA在以甘油、葡萄糖、槐糖和乳糖为底物生长时可适度的表达，并可受到纤维素的诱导。另外，CEL5B酶中含有通过糖基化磷脂酰肌醇残基固膜的保守序列。这些特性使其成为产生纤维素酶诱导剂的令人感兴趣的研究对象。·1.3.1纤维素酶的性质和种类纤维素酶是指一类能水解纤维素中β-1,4-32 第一章绪论研究进展，立项依据葡萄糖苷键的多组分酶系的总称，主要由外切葡聚糖苷酶（EG）、内切葡聚糖苷酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BG）组成。[26]纤维素酶分子大小范围很广，内切酶分子量介于23～146KD之间，外切酶为38～118KD，β-葡萄糖苷酶为90～100KD（胞内）和47～76KD（胞外酶）。但纤维粘细菌内切型酶分子量小至6.3KD，蚕豆腐皮镰胞的β-葡萄糖苷酶竟高达400KD。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，所含碳水化合物的比例不同在很大程度上决定了酶的多形性，根本上表现为分子量的差别。·1.3.2纤维素酶的作用机理目前，纤维素的微生物降解机理被普遍接受的理论主要有三种:协同理论，碎片理论和原初反应假说[27]，其中以协同理论最为广泛接受。Gilligan和Reese(1954年)首先证明真菌纤维素酶在消化纤维素时具有协同性，他们发现纤维素复合酶对Walseth纤维素(部分降解的酸化底物)的水解程度大于单组分酶。White和Brown(1981年)用电子显微镜证明了内切—外切酶组分间在水解结晶纤维素时的这种协同作用。Faterstam等(1980年)发现两种外切酶(CBHⅠ和CBHⅡ)联合降解结晶纤维素的速度和程度是单组分酶的两倍。Wood(1985年)在研究Trichodermareesei和Penicilliumfuniculosumde的纤维素酶时，发现培养滤液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同性，即外切—外切协同性(exo-exo-synergism)。碎片理论认为：纤维素酶是由葡聚糖内切酶(Cx酶)、葡聚糖外切酶(C1酶)、β-葡萄糖苷酶三个主要成分所组成的诱导型复合酶系。其中C1酶起水化作用，它作用于不溶性的固体表面，使形成结晶结构的纤维素链开裂，长链分子的末端部分游离，从而使纤维素链易于水化。Cx酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的β-1，4-寡聚物，葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。该假说的基本降解模式如下:C1—结晶纤维素→Cx—无定形纤维素→β-葡萄糖苷酶—纤维二糖→葡萄糖原初反应假说认为结晶纤维素的降解是一个多步骤过程，并认为原初反应即无序反应(Amorphogenesis)使纤维素的结晶状态发生改变，便于随后的纤维素水解。·1.3.3纤维素酶的来源[28]32 第一章绪论研究进展，立项依据纤维素酶来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。细菌产生的纤维素酶的量较低，主要是EG，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，大多数细菌的EG对结晶纤维素没有活性，而且这些酶主要是胞内酶或吸附于细胞壁上，很少能分泌到细胞外，增加了提纯的难度，在工业上很少采用。目前研究较多的是纤维素粘菌属、生孢纤维粘菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属。放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维素酶或产量极低，产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌(Actinomycesmelanocyclus)、玫瑰色放线菌(Actinomycesroseodiastaticus)和纤维放线菌(Actinomycescellulosae)。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居多，里氏木霉、康氏木霉(Trichodermakoningii)和绿色木霉(Trichodermaviride)等是木霉属中酶活性较高的菌种。真菌产生三类纤维素酶，能分泌到菌体外，一般不聚集形成多酶复合体，但相互发生强烈的协同作用。目前已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉(Aspergilliusniger)、镰刀霉(Fusariumsp.)、拟青霉(Paecilomycessp.)和斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)等的纤维素酶。酵母虽然不产纤维素酶，但可以利用酵母表达系统表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，经正确加工修饰后可直接分泌到培养基中，表达水平高。如用酵母表达的CBHⅡ、EGⅠ的产量可达100mg/L以上，并具有正常的生物学活性。·1.3.4纤维素酶的应用·1.3.4.1在食品工业上的应用是纤维素酶应用最广泛的行业，纤维素酶既可以将纤维素水解成葡萄糖，又可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物的提取率。用纤维素酶进行果蔬处理可以避免香味和维生素的流失，同时可以提高消化性和口感。采用纤维素酶水解法对海藻粉进行处理可以充分获得还早中的油脂资源。速溶茶饮在加工生产时常用热水浸提法提取茶饮的有效成分，采用沸水浸泡和纤维素酶法结合既可以缩短提取时间又可以保证茶饮原有色、香、味。将纤维素酶应用于果蔬榨汁可提升提取率。·1.3.4.2在酿酒工业上的应用[29]我国酿酒所用原料主要是玉米、高粱、淀粉质原料，这些原料中含有1%到3%的纤维素，在纤维素酶的作用下可转化为可发酵性糖。纤维素酶可以破坏这些原料的细胞壁结构促成淀粉的释放，有利于糖化酶的作用。另外纤维素酶的使用使发酵液、糖化液的粘度降低，有利于酒糟的分离。32 第一章绪论研究进展，立项依据以大豆为原料酿造酱油过程中添加纤维素酶可使细胞中的蛋白质和碳水化合物释放。这样既可以提高酱油浓度，改善酱油质量，又能缩短生产周期，从而提高生产率。·1.3.4.3在造纸工业上的应用纤维素酶作为一种特殊的催化剂，在纸浆造纸工业生产过程中已经有了不少实际应用。如制浆、树脂障碍控制、漂白、废纸脱墨以及废水处理等。酶法脱墨是一种新型的脱墨工艺，与常规碱法脱墨相比有明显优势，它可以在提高脱墨效率的同时降低能耗，减轻环境污染，并且具有游离度高、滤水性能好、物理性能优、白度高和残余油墨量低的优点。纤维素酶、木聚糖酶及淀粉酶在混合办公废纸、新闻纸脱墨中的协同作用，可优化混合办公废纸酶法脱墨的工艺条件。·1.3.4.4在纺织工业上的应用[30]传统的纤维练漂实在碱性介质中进行的，虽然处理结果可达到要求，但碱性废水治理困难。棉织物经纤维素酶处理后，去除了表面绒毛，织物变得光洁均匀、富有光泽、手感柔软，经多次洗涤没有起球现象。纯大麻织物在经纤维素酶处理后，不仅手感柔顺、丰满，而且还保持了大麻夏布原有的风格。采用纤维素酶处理牛仔类棉织物，不仅能在纤维表面层进行可控的“刻蚀”，使织物产生不均匀的褪色，具有穿着感，而且对织物内部纤维的强力不会过度损伤。·1.4里氏木霉产纤维素酶的诱导物[31]纤维素酶是诱导酶，必须在诱导剂的作用下才能大量表达。不同的诱导剂对里氏木霉表达纤维素酶的诱导效果和使用价值是不同的，诱导里氏木霉产纤维素酶的物质主要是一些糖类，包括聚糖、寡糖和单糖等。其中以纤维素、槐糖的诱导效果最好,乳糖和纤维二糖的诱导效果次之。·1.4.1纤维素纤维素是由葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的葡萄糖线性高聚体，是纤维素酶最天然的诱导剂。纤维素不溶于水，且不能透过细胞膜，因此纤维素对纤维素酶的诱导机制主要依赖于纤维素酶分解产生的寡糖和单糖,相比于乳糖和纤维二糖,纤维素能够诱导出较高的纤维素酶。32 第一章绪论研究进展，立项依据·1.4.2槐糖槐糖是2个葡萄糖分子由β-1，2糖苷键连接所形成，被认为是里氏木霉产纤维素酶的强力的诱导剂。槐糖对β-葡萄糖苷酶的诱导能力较差，且不能诱导其他菌种产生纤维素酶（如青霉和曲霉）。在纤维二糖为诱导剂，甘油为碳源的培养基上，有槐糖的形成，认为是β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，使纤维二糖和葡萄糖转变成了槐糖，因此槐糖被认为纤维素酶的直接诱导剂。·1.4.3乳糖乳糖是一分子葡萄糖和一分子半乳糖经过β-1，4半乳糖苷键连接形成。乳糖能够诱导里氏木霉产生β-1，4-半乳糖苷酶和纤维素酶，乳糖不能够直接进入胞内，β-1，4-半乳糖苷酶分解乳糖为半乳糖和葡萄糖，胞外乳糖的分解是里氏木霉生长和产纤维素酶的限速步骤。乳糖的诱导能力相当于纤维素诱导能力的1/3到1/2，但由于其较低的价格和诱导能力，成为最广泛应用的诱导剂。·1.4.4纤维二糖纤维二糖是2个葡萄糖分子由β-1，4糖苷键连接形成。纤维二糖能够诱导纤维素酶的形成，但诱导能力较差，曾经认为纤维二糖是纤维素酶的直接诱导剂，但高浓度的纤维二糖不但没有提高纤维素酶的酶活，反而降低了里氏木霉产纤维素酶的能力，表明高浓度的纤维二糖反而抑制里氏木霉产纤维素酶。在低浓度的纤维二糖流加培养条件下，能够诱导较高的酶活。·1.5立项依据纤维素类物质是自然界中最具潜力的一种可再生资源，其有效利用是目前人们关注的热点。作为降解纤维素的多组分酶系，纤维素酶降解纤维素特异性高，反应条件温和，环境污染小。我国农作物秸秆每年约6亿吨[32]，如果其中30%通过纤维素酶转化为可发酵糖，相当于2亿吨葡萄糖，可大大减少对粮食产品的需求，有效保障粮食安全。随着人们对纤维素酶分子结构及作用机理等各方面的深入研究，纤维素酶必将在食品、环保、能源和资源开发等各领域发挥越来越大的作用。现有的纤维素酶生产方法主要采用微生物液体发酵法，生产菌株以里氏木霉Trichodermareesei（T.reesei）及其近缘菌株应用最为广泛[33]32 第一章绪论研究进展，立项依据。目前纤维素酶生产的瓶颈问题是酶活性低、对木质纤维素分解能力弱、生产周期长及生产成本高，严重影响了其工业化应用。由于纤维素酶是一类能水解纤维素中β-1,4葡萄糖苷键多组分酶系的总称，其组分复杂，合成代谢网络研究尚不清楚，且在水解纤维素过程中各酶组分之间存在协同作用。纤维素酶生产过程受菌株本身特性、细胞内微环境、宏观环境以及纤维素类底物特性等多种因素共同影响，是一个非常复杂的体系，纤维素酶合成的过程调控涉及基因、蛋白质及外界环境等多个层面。此外，真菌纤维素酶多数是诱导酶，其合成及表达须在诱导物存在下才能进行，通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的有效方法。由于诱导物种类繁多，诱导表达调控机制呈复杂的网络状，目前关于纤维素酶诱导物和诱导机理的研究仍没得出确定的结论。况且天然纤维素类物质作为生产纤维素酶最具潜力的原料，其成分除纤维素还包括半纤维素和木质素等。有文献报道半纤维素可诱导木聚糖酶的合成，而木聚糖酶和纤维素酶的合成又有相互促进的关系。本课题组在研究T.reeseS313以不同纤维素类底物发酵产纤维素酶的过程中，也发现半纤维素含量较高的玉米芯作为底物时，纤维素酶活高于其他木质纤维素底物时的酶活。但是，玉米芯是如何诱导或影响纤维素酶合成的一问题均有待进一步深入研究。因此，研究以天然纤维素物质为底物的纤维素酶合成过程机理，充分挖掘现有生产菌株产纤维素酶的潜力，是解决纤维素酶液体发酵问题的关键。研究真菌纤维素酶诱导机理，不但为最终揭示纤维素酶表达调控及合成机理提供有力的理论依据，为纤维素酶高效表达提供新的思路，还对纤维素酶高效低成本生产及木质纤维素原料的高效利用，解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题和实现人类可持续发展有重要意义。·1.6本文研究问题鉴于国内外的研究现状,我们提出“高含量的半纤维素是导致玉米芯纤维素酶活提高的原因，其水解产物半乳糖、木聚糖很可能是除纤维二糖和槐糖外的主要诱导物，且几个诱导物之间可能存在协同作用”这一假说。并以T.reeseiRutC30及其突变株S313（其纤维素酶系组成较平衡且酶活较高）为研究对象，通过基因序列比对，获得导致突变株高产的关键基因，并对这些基因进行功能分析。采用HPLC、HPLC-MS、NMR、FT-IR等分析手段对以玉米芯为底物的发酵液酶组分和代谢物进行分析比较，确定其中起诱导作用的关键组分。采用RT-PCR分别分析关键诱导物对纤维素酶编码基因mRNA32 第一章绪论研究进展，立项依据的表达变化。探讨玉米芯中各诱导物对纤维素酶诱导合成的相互作用，构建多诱导因子共同作用的玉米芯纤维素酶诱导模型。本研究具有重要的理论和实际意义，有助于纤维素酶合成机理的彻底阐述，并为纤维素酶早日实现工业化生产提供可靠的理论依据。32 第二章材料方法·第二章材料方法·2.1菌种里氏木霉RutC30(TrichodermareeseiRutC30)保藏于中国科学院天津工业生物技术研究所。·2.2主要实验仪器仪器名称生产厂家SIGMA3-18K型离心机G154DW型高压蒸汽灭菌锅ZWY2112B型全温振荡器ZDP-A2080A型恒温培养箱DHG-9140A型电热鼓风干燥箱SBA-40D生物传感分析仪Pectramaxplus384酶标仪SW-CJ-1FD洁净工作台85-Z型恒温磁力搅拌器PL303型电子天平S20型pH计电子计重天平恒温水浴锅移液枪INFORSAG工业摇床冰箱电磁炉德国SIGMA公司美国Zealway仪器有限公司上海至诚分析仪器制造有限公司上海至诚分析仪器制造有限公司上海一恒科学仪器有限公司山东省科学院生物研究所美谷分子仪器（上海）有限公司苏净集团苏州安泰空气技术有限公司上海司乐仪器有限公司瑞士MettlerToledo公司瑞士Seveneasy公司上海舜宇恒平科学仪器有限公司长风牌芬兰Dragon公司32 第二章材料方法·2.3实验药品药品名称生产厂家葡萄糖硫酸铵硫酸镁吐温—80酵母膏多聚蛋白胨磷酸氢二钾无水氯化钙氢氧化钠微晶纤维素柠檬酸3,5-2硝基水杨酸酒石酸钾钠苯酚焦亚硫酸钠葡萄糖标准液木聚糖（D+）半乳糖L-阿拉伯糖D-甘露糖D-（+）-纤维二塘硼酸三氯化铁氯化锰钼酸铵硫酸铜氯化锌天津市风船化学试剂科技有限公司天津市北方天医化学试剂厂天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天医化学试剂厂天津市北方天医化学试剂厂生物生工上海市松江区香闵璐698号天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天医化学试剂厂天津市科威有限公司天津市光复精细化工研究所天津市北方天医化学试剂厂成都市科龙化工试剂厂天津市风船化学试剂科技有限公司天津市津东天正精细化工试剂厂天津市科威有限公司山东省科学院生物研究所天津市光复精细化工研究所天津市光复精细化工研究所上海蓝季科技发展有限公司上海蓝季科技发展有限公司上海蓝季科技发展有限公司天津市元力化工有限公司天津市福晨化学试剂厂天津市福晨化学试剂厂天津市风船化学试剂科技有限公司天津市光复精细化工研究所天津市北方天医化学试剂32 第二章材料方法·2.4实验试剂·2.4.1柠檬酸缓冲液Trichodermareesei纤维素酶活的测定采用0.05M，pH4.8的柠檬酸缓冲液。Citricacidmonohydrate210gDIwater750mlNaOHadduntilPHequals4.3(50~60g)Diluteto1LandcheckPHto4.5.·2.4.2DNS反应液蒸馏水1416ml3,5-二硝基水杨酸10.6gNaOH19.8g混匀，添加；酒石酸钾钠306g苯酚7.6ml焦亚硫酸钠8.3g·2.4.3微量元素FeSO4·7H2O 5.0mg/l，MnSO4·H2O 1.6mg/l，ZnSO4· 7H2O 1.4mg/lCoCl2 2.0mg/l，（加蒸馏水200ml使之溶解，用HCl或H2SO4调pH4.5）·2.5实验培养基·2.5.1PDA培养基先将马铃薯洗净去皮,称取200g并切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞，包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出倒入试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。32 第二章材料方法·2.5.2菌丝培养基（g/L）Glucose3Polypepton1Yeastextract0.5Tween-801(NH4)2SO41.4KH2PO42CaCL2(无水)0.26MaSO4·7H2O0.3Traceelementsolution25ml/L·2.5.3诱导培养基（g/L）MgSO4·7H2O0.075Tween-800.25(NH4)2SO40.35CaCL20.0625Traceelementsolution6.25ml/L以上培养基用0.05MPH=4.8的柠檬酸buffer配制·2.6实验方法：·2.6.1预培养Strain：RutC30孢子悬液接种于装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，孢子的接种量为108/L在28℃，180rpm条件下摇床培养24h。.·2.6.2菌丝的获取取10ml上述预培养的菌丝体过滤，用0.9%NaCl洗涤两次。诱导培养基：pH5.0的50mM柠檬酸钠缓冲液体系，0.035%(NH4)2SO4，0.05%KH2PO4，0.0075%CaCl2‧2H2O，0.0075%MgSO4‧7H232 第二章材料方法O，0.025%吐温80，0.025%微量元素溶液，1%诱导物（玉米芯CC,微晶纤维素C,木聚糖X,半乳糖G,甘露糖M,阿拉伯糖A）诱导条件：将上述经洗涤后的菌丝体（接种量为2.0mg干重/ml），转移至诱导培养基中，26℃培养。·2.6.3取样分别在诱导培养9h、24h、48h、72h小时取样，10000rpm、5min离心，取上清液保存于冰箱中（每个时间点及类别做好标记）。·2.6.4酶活的定义及测定方法·2.6.4.1滤纸酶活测定（totalenzymeactivity）滤纸酶活测定包括以下三部分实验试管的平行和相同处理：发酵液检测，空白和对照，葡萄糖标准。底物：WhatmanNo.1滤纸条，1.0×6.0cm(≈50mg)诱导菌液管：1）试管内添加1.0ml0.05M，pH4.8柠檬酸钠缓冲液。2）再添加0.5ml的稀释酶液。该步要配置至少两个稀释度的酶液，一个稀释度的酶液在该反应条件下60min内释放的葡萄糖略少于2.0mg，另一个稀释度的酶液在60min内释放的葡萄糖略多于2.0mg。（以酶液的稀释度对对应生成的葡萄糖作图，求得释放2.0mg葡萄糖的酶液的稀释度。）每个试管内，添加一条称量好的滤纸条带混合。3）试管口用塑料膜封上，50℃水浴反应60min。4）立即添加3.0mlDNS反应液。5）沸水浴加热5min，终止反应。6）转移至冷水浴，冷却。7）取0.17mL反应后的混合液，加入1mL去离子水或蒸馏水，充分混匀。8）取0.2ml于96孔板在540nm下读取吸光度。9）由标准曲线读取样品的葡萄糖含量。32 第二章材料方法空白和对照试管：调节零点对照品空白对照底物对照柠檬酸缓冲液1.5ml柠檬酸缓冲液1.0ml柠檬酸缓冲液1.5ml稀释酶液0.5ml底物滤纸条50℃水浴反应60minDNS反应液3.0mlDNS反应液3.0mlDNS反应液3.0ml沸水浴5min沸水浴5min沸水浴5min蒸馏水1ml蒸馏水1ml蒸馏水1ml用于调节零点样品的读数需减去空白对照和底物对照的读数，消除背景误差。葡萄糖标准溶液：1.葡萄糖标准贮液：10mgml-1，（550mg葡萄糖定容到50ml水）-20℃密封保存2.葡萄糖标准液标准液序号标准贮液稀释度标准液浓度Glu11:1.5（1.0mL+0.5mLbuffer）6.7mg/ml（3.35mg/0.5mL）Glu21:2（1.0mL+1.0mLbuffer）5.0mg/ml（2.5mg/0.5mL）Glu31:3（1.0mL+2.0mLbuffer）3.3mg/ml（1.65mg/0.5mL）Glu41:5（1.0mL+4.0mLbuffer）2.0mg/ml（1.0mg/0.5mL）0号管1号管2号管3号管4号管0.5ml待测液—Glu1Glu2Glu3Glu4柠檬酸缓冲液1.5ml1ml1ml1ml1mlDNS反应液3ml3ml3ml3ml3ml沸水浴加热5min蒸馏水1ml1ml1ml1ml1ml勿必使样品在540nm下的吸光度位于0.1~1.0范围内，以A540对葡萄糖浓度（mg/0.5ml）作图。32 第二章材料方法（备注：包括发酵液检测管、空白和对照管、葡萄糖标准液管一起于50℃水浴中反应60min，并且立即一起加入DNS终止反应后，一起在沸水浴中煮5min）酶活的计算FPU酶活的定义以国际单位为依据：1IU=1μmol/min转化的底物=1μmol/min生成的葡萄糖的含量=0.18mg/min生成的葡萄糖的含量分析FPU的反应中释放的葡萄糖的含量为2mg,2mg葡萄糖=2/0.18μmol.该量的葡萄糖是0.5ml的酶液在60min水解滤纸得到的：=0.37μmolmin-1ml-1(IUml-1)FPU=0.37/酶液的稀释度units/ml酶液的稀释度=酶液的体积/稀释液的总体积（备注：当发酵液中葡萄糖含量少于2mg时，酶活不能用“filterpaperunits”，而用60min平均每分钟释放的mmol葡萄糖来代替）·2.6.4.2β-葡萄糖苷酶活性分析1．底物：15.0mM纤维二糖，溶解于0.05M，pH4.8的柠檬酸缓冲液，该反应液需要现用现配。2．方法：1）添加1ml酶液溶解于柠檬酸缓冲液中。至少要准备2个稀释度的酶液，一个稀释度在反应条件下释放略少于1.0mg的葡萄糖，另一稀释度则释放略高于1.0mg的葡萄糖。2）加热至50℃，添加1.0ml的底物溶液，混匀。3）50℃水浴反应30min。4）沸水浴加热5.0min，终止反应。5）冷却，通过HPLC测定葡萄糖的含量。32 第二章材料方法空白对照：纤维二糖空白对照酶液空白对照纤维二糖底物溶液1ml柠檬酸缓冲液1ml柠檬酸缓冲液1ml酶液1ml酶活的计算β-葡萄糖苷酶单位酶活定义:β-葡萄糖苷酶的酶活定义以国际单位（IU）为基准。1IU=1μmol/min转化的底物=2μmol/min生成的葡萄糖的含量在测定β-葡萄糖苷酶酶活的过程中，释放的葡萄糖的绝对量为1.0mg:1.0mg葡萄糖=1.0/0.18μmol葡萄糖=0.5/0.18μmol转化的纤维二糖该反应是被1.0ml的酶液在30min内转化的，即1.0mg葡萄糖=0.5/(0.18×1.0×30)μmolmin-1ml-1，纤维二糖的转化=0.0926μmolmin-1ml-1。因此该反应中使用的酶液含有0.0926单位的酶活。则：β-葡萄糖苷酶酶活=0.0926/酶的稀释倍数unitsml-1。酶的稀释倍数=样品中添加的酶液体积/稀释液的总体积32 第三章结果与讨论·第三章结果与讨论·3.1玉米芯酶解液中糖组分的分析·3.1.1不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况图3-1不同诱导物诱导产滤纸酶活的情况由图3-1可以看出，玉米芯对滤纸酶（内切酶和外切酶）有明显的诱导作用，而且随着时间的增长，诱导作用越明显；微晶纤维素对滤纸酶（内切酶和外切酶）有较明显的诱导作用，但是较玉米芯的诱导作用弱,而且随着时间的增长，诱导作用不是很明显，而且在诱导72h以后，诱导作用有减弱的趋势；半乳糖对滤纸酶（内切酶和外切酶）有较弱的诱导作用，在24h时达到诱导的最大值，而且以后不会随着时间的增长有所变化；而木聚糖、阿拉伯糖、甘露糖这三种糖对滤纸酶（内切酶和外切酶）没有直接的诱导作用，基本上接近0。·3.1.2不同诱导物诱导产β-葡萄糖苷酶的情况32 第三章结果与讨论图3-2不同诱导物诱导产β-葡萄糖苷酶的情况由图3-2可以看出，玉米芯对β-葡萄糖苷酶有明显的诱导作用，而且随着时间的增长，诱导作用也不断增长；微晶纤维素对β-葡萄糖苷酶有较明显的诱导作用，但是较玉米芯的诱导作用弱,而且随着时间的增长，诱导作用的增长逐渐减缓；半乳糖对β-葡萄糖苷酶有较较低水平的诱导作用但是随着诱导时间的增长，诱导作用的增长趋势不是很明显；而木聚糖、阿拉伯糖、甘露糖这三种糖对β-葡萄糖苷酶没有直接的诱导作用。·3.1.3不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况32 第三章结果与讨论图3-3不同诱导物诱导产木聚糖酶的情况由图3-3可以看出，玉米芯、微晶纤维素、木聚糖都可以诱导里氏木霉产生木聚糖酶，其中玉米芯对木聚糖酶的诱导作用相当明显，在前24h内增长迅速，在24h以后诱导产生木聚糖酶的速率逐渐减缓；微晶纤维素有较高水平的诱导合成木聚糖酶的能力，但是在前48h内增长缓慢，48h以后诱导合成的木聚糖酶迅速增长；木聚糖对木聚糖酶的合成有较低水平的诱导作用，但是随着时间的增长，合成的木聚糖的量较少：在木聚糖中添加微晶纤维素可以较高水平的提高木聚糖酶的合成能力。·3.2不同组分对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响·3.2.1不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况32 第三章结果与讨论图3-4不同混合诱导物诱导产滤纸酶活情况由图3-4可以看出玉米芯对里氏木霉诱导产滤纸酶（内切酶和外切酶），有很强的诱导作用，但是诱导作用随着诱导时间的增长逐渐减缓；在微晶纤维素中分别添加的混合诱导物中，当添加木聚糖和阿拉伯糖时，诱导产生滤纸酶（内切酶和外切酶）诱导作用不是很明显;当混合诱导物中添加木聚糖和半乳糖时对霉诱导产滤纸酶（内切酶和外切酶）有较低水平的诱导作用，但是随着时间的增长量比较缓慢；当混合物为木聚糖和甘露糖时，对里氏木霉诱导产滤纸酶（内切酶和外切酶）也有较低水平的诱导作用，但是随着时间的增长，诱导作用产生的滤纸酶（内切酶和外切酶）的量较少，即诱导作用较弱；当混合成分为半乳糖和阿拉伯糖时，诱导产生的滤纸酶（内切酶和外切酶）的量基本无变化；当混合物成分为半乳糖和甘露糖时，在前48h内，诱导作用不是很明显，但是在48h以后，诱导产生的滤纸酶（内切酶和外切酶）有显著的增长。·3.2.2不同混合诱导物诱导产β-葡萄糖苷酶的情况32 第三章结果与讨论3-5不同混合诱导物诱导产β-葡萄糖苷酶的情况由图3-5以看出玉米芯对里氏木霉诱导产β-葡萄糖苷酶，有很强的诱导作用；在微晶纤维素中分别添加的混合诱导物中，当分别添加为木聚糖和阿拉伯糖、木聚糖和半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖时，虽然24h之前诱导作用不是很明显但是24h之后诱导作用有较小幅度的增长；当混合诱导物中分别添加木聚糖和甘露糖、半乳糖和甘露糖时，在前24h内，诱导产生β-葡萄糖苷酶的诱导作用也不是很明显，但是在24h之后，诱导作用有较大幅度的提高。·3.4半乳糖诱导浓度对里氏木霉诱导产纤维素酶的影响·3.4.1不同半乳糖浓度对滤纸酶活的影响32 第三章结果与讨论CC10g/LC10g/LG12g/LG25g/LG310g/L图3-6不同半乳糖浓度对滤纸酶活的影响由图3-6可以看出在仅有玉米芯、微晶纤维素对对滤纸酶（内切酶和外切酶）有直接的诱导作用，而且诱导作用比较强，但是微晶纤维素的诱导作用不如玉米芯的显著；在不同的半乳糖浓度的诱导作用下，当半乳糖浓度为2g/l时，对滤纸酶有较低水平的诱导作用，但是随着时间的增长，诱导作用的增长不是很明显；当半乳糖的浓度为5g/l时对滤纸酶（内切酶和外切酶）有比较明显的诱导作用，当半乳糖浓度为10g/l时，对滤纸酶也有较低水平的诱导作用，而且随着时间的增长，诱导作用的增长也不是很显著，但是其整体诱导效果要比半乳糖浓度为2g/l时强。·3.4.2不同半乳糖浓度对β-葡萄糖苷酶活的影响32 第三章结果与讨论图3-7不同半乳糖浓度对β-葡萄糖苷酶活的影响由图3-7可知在诱导物仅为玉米芯、微晶纤维素时β-葡萄糖苷酶有直接的诱导作用，而且诱导作用非常明显，而且微晶纤维素的诱导效果明显的要比玉米芯的诱导作用弱；在半乳糖浓度分别为2g/l、5g/l、10g/l的条件下不同的半乳糖浓度对β-葡萄糖苷酶虽然都有较低水平的诱导作用，但不同的浓度的半乳糖的诱导作用有些许的差异。其中，在2g/l、5g/l、10g/l三个浓度梯度中，当半乳糖的浓度为5g/l时，对β-葡萄糖苷酶的诱导作用最为显著。32 第三章结果与讨论·结论1、复合物玉米芯是几种酶最好的诱导物。2、木聚糖、甘露糖、阿拉伯糖对滤纸酶（内切酶和外切酶）、β-葡萄糖苷酶没有直接的诱导作用。3、半乳糖可较低水平的诱导滤纸酶（内切酶和外切酶）、β-葡萄糖苷酶。4、木聚糖、纤维素和玉米芯可诱导木聚糖酶的合成，在木聚糖中添加微晶纤维素可以提高木聚糖酶的诱导水平，但是，在微晶纤维素中添加木聚糖不会使纤维素酶的诱导水平提高。32 参考文献·参考文献[1]WilsonDB.Cellulasesandbiofuels.CurrentOpinioninBiotechnology,2009,20(3):295-299.[2]谢天文,刘晓风,袁月祥,闫志英,贺蓉娜,廖银章.真菌产纤维素酶的诱导物及其调控机理研究进展.应用与环境生物学报,2010,16(3):440-444.[3]AdsulMG,BastawdeKB,VarmaAJ,GokhaleDV.StrainimprovementofPenicilliumjanthinellumNCIM1171forincreasedcellulaseproduction.BioresourceTechnology,2007,98:1467-1473.[4]HeJ,YuB,ZhangKY,DingXM,ChenDW.StrainimprovementofTrichodermareeseiRutC-30forincreasedcellulaseproduction.IndianJMicrobiol,2009,49:188-195.[5]SchmollM,ZeilingerS,MachRL,KubicekCP.CloningofgenesexpressedearlyduringcellulaseinductioninHypocreajecorinabyarapidsubtractionhybridizationapproach.FungalGeneticsandBiology,2004,41:877-887.[6]AdsulMG,BastawdeKB,VarmaAJ,GokhaleDV.StrainimprovementofPenicilliumjanthinellumNCIM1171forincreasedcellulaseproduction.BioresourceTechnology,2007,98:1467-1473.[7]KubicekCP,MikusM,SchusterA,SchmollM,SeibothB.MetabolicengineeringstrategiesfortheimprovementofcelluloseproductionbyHypocreajecorina.BiotchnologyforBiofuels,2009,2:19-33.[8]刘自勇,孙宪昀,曲音波.斜卧青霉114-2cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较.微生物学报,2008,48(5):667-671.[9]SunXY,LiuZY,ZhengK,SongX,QuYB.ThecompositionofbasalandinducedcellulasesystemsinPenicilliumdecumbensunderinductionorrepressionconditions.EnzymeandMicrobialTechnology,2008,42:560-567.[10]ChenM,QinYQ,LiuZY,LiuK,WangFS,QuYB.Isolationandcharacterizationofaβ-glucosidasefromPenicilliumdecumbensandimprovinghydrolysisofcorncobresiduebyusingitascellulasesupplementation.EnzymeandMicrobialTechnology,2010,46:444-449.[11]DOE/SC-0095,BreakingtheBiologicalbarrierstocellulosicethanol.AJointResearchAgenda,June2006.32 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参考文献MorikawaY.IdentificationofspecificbindingsitesforXYR1,atranscriptionalactivatorofcellulolyticandxylanolyticgenesinTrichodermareesei.FungalGenetBiol,2009,46:564-574.[24]PortnoyT,MargeotA,Seidl-SeibothV,LeCromS,BenChaabaneF,LinkeR,SeibothB,KubicekCP.DifferentialregulationofthecellulasetranscriptionfactorsXYR1,ACE2,andACE1inTrichodermareeseistrainsproducinghighandlowlevelsofcelulase.EukaryotCell,2011,10(2):262-271.[25]ForemanPK,BrownD,DankmeyerL,DeanR,etal.Transcriptionalregulationofbiomass-degradingenzymesinthefilamentousfungusTrichodermareesei.JBiolChem,2003,278:31988-31997.[26]肖春玲.微生物纤维素酶的应用[J].微生物学杂志,2002,22(2):33-35[27]陈燕勤,毛培宏,金湘,等纤维素酶及其分子生物学研究[J].化学与生物工程,2004(2):1-3[28]戴四发.纤维素酶研究现状及其在畜牧业中的应用[J].安徽技术师范学院学报,2001,15(3):32-38[29]韦小英,杨崎峰.纤维素酶水解蔗渣浆的影响因素研究[J].广西轻工业,2001(2):44-46[30]张瑞萍.毛巾织物的生物酶整理[J].印染,1999(10):12-15[31]李辉,王义强.里氏木霉产纤维素酶的诱导和合成机理研究进展[J].中国酿造，2011(6):9-10[32]KruszewskaJ,PalamarczykG,KubicekCP.Stimulationofexoproteinsecretionbycholineandtween-80inTrichodermareeseiQM-9414correlateswithincreasedactivitiesofdolicholphosphatemannosesynthase.JGenMicrobiol,1990,136:1293-1298.[33]DogarisI,VakontiosG,KalogerisE,MammaD,KekosD.InductionofcellulasesandhemicellulasesfromNeurosporacrassaundersolid-statecultivationforbioconversionofsorghumbagasseintoethanol.IndustrialCropsandProducts,2009,29:404-411.32 附录致谢衷心感谢马立娟和孟春晓老师对我做毕业论文期间的精心指导。他们的言传身教将使我终生受益。二位导师广博的学识和严谨的治学态度将使我受益终生。感谢实验室的全体老师和同学多年来的关心和支持！感谢所有关心和帮助过我的人们！32 附录附录实验数据：1玉米芯酶解之后糖组分1.1滤纸酶活1.2β-葡萄糖苷酶活1.3木聚糖酶活32 附录2混合糖2.1滤纸酶活2.2β-葡萄糖苷酶活3半乳糖3.1滤纸酶活3.2β-葡萄糖苷酶活32 附录32'