生物工程专业毕业论文.doc 29页

'——学院2014届本科毕业论文论文题目：环磷酸腺苷高产菌落研究学生姓名：——所在院（系）：生物工程系所学专业：生物工程专业导师姓名：——完成时间：2014年3月15日 环磷酸腺苷高产菌落研究——（——学院生物工程系104班）摘要微生物发酵法合成环磷酸腺苷（cAMP）高产菌种是关键，本文采用高效液相色谱法测定不同菌落发酵液中环磷酸腺苷的含量筛选出cAMP高产菌落。通过活化不同节杆菌，挑选单菌落，分别编号1至6后移种进行发酵，发酵结束后用高效液相色谱法测定发酵液中cAMP含量,结果6号菌落发酵液中cAMP含量最高为2.8957mg/ml，其次为4号菌落，环磷酸腺苷含量为2.5057mg/ml。本实验初步筛选出环磷酸腺苷高产菌落为6号菌落；同时也发现在实验中无菌操作是否规范、能否避免染菌是我们实验成败的关键。关键字：环磷酸腺苷，节杆菌，发酵，高效液相 THEEFFECTOF：UsinghighperformanceliquidCyclicadenosinephosphatehigh-yieldstrainsscreened——(——School,DepartmentofBiologicalEngineering，Class104)ABSTRACTMicroorganismfermentationwassynthesizedadenosinemonophosphate(cAMP)highyieldstrainisthekey,thispaperadoptshighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodfordeterminingthecontentofcentraladenosinephosphateofdifferentcoloniesfermentedliquidscreenedcAMPhigh-yieldcolony.Throughactivationofdifferentsection,selectsinglecolony,number1to6backkindofferment,respectivelyafterfermentationcAMPcontentinthefermentedliquidbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC)method,theresults6coloniescAMPcontentinthefermentedliquidupto2.8957mg/ml,followedbycolony,4cyclicadenosinephosphatecontentis2.5057mg/ml.Thisexperimentpreliminaryscreeningcyclicadenosinephosphatehigh-yieldcolonyfor6colonies;Alsofoundintheexperimentofsterileoperationwhetherstandard,whethertoavoiddyebacteriumiskeyofsuccessorfailureinourexperiment.Keywords:Cyclicadenosinemonophosphate,Arthrobacterium,BiologicalFermentation，HPLC 目录1引言：11.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能11.2环磷酸腺苷生产机制22.材料与方法32.1实验材料32.2实验仪器32.3实验方法32.3.1培养基32.3.2移种与接种32.4高效液相检测环磷酸腺苷含量42.4.1色谱测定条件42.4.2样品处理42.4.3标样的配制42.4.4标样的线性关系52.4.5标准曲线绘制53.实验结果与分析53.1实验结果53.1.1摇瓶发酵各参数测定53.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量63.2结果分析及讨论124结论13参考文献14致谢:1516 环磷酸腺苷高产菌落研究李成喜（新科学院生物工程系104班）1引言：环磷酸腺苷是核苷酸类药物,在临床上,主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死,尤其适用于对洋地黄类强心药中毒或不敏感的患者[1]。同时cAMP是机体代谢的重要调节因子，其广泛参与酶活性调节、基因表达以及细胞增殖与分化等，因而备受关注。上个世纪五、六十年代起,国外就陆续有文献报道环磷酸腺苷的合成。但传统的cAMP以化学合成为主，生产成本高，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用[2]。现在也有从大枣中提取，原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低。本研究利用节杆菌通过微生物发酵生成cAMP，具有很大发展前景[3]。环腺苷酸(CyclicAdenosineMonophosphate,cAMP)是由E.W.Sutherland于1957最早从哺乳动物组织中发现的，并于1958年分离出环腺苷酸。Sutherland也因发现cAMP于1971年获得生理和医学诺贝尔奖[4]。之后，人们相继从植物和微生物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质。世界各国的研究人员通过对cAMP大量的研究,结果表明cAMP在很多领域中起着重要的作用。所以cAMP的生产和检测是十分重要而且必要的。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）分析cAMP含量不仅简便快速,而且选择性好、准确度高。1.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能环磷腺苷，即：腺嘌呤核苷-3′，5′-环磷酸酯,简称cAMP，是由单核苷酸AMP分子中的磷酸与核糖形成3"，5"－环式结构（见图1）其分子式为:Cl0H12N5O6P，水合物为类白色或淡黄色结晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚熔点为219～220℃(分解)，比旋度为－51.3°(C=0.67)；它对酸、碱、热都相当稳定，是当前分子生物学研究的热点之一[3,4]。cAMP是人体中的一种重要生物活性物质，它在细胞内外快速双向流动，细胞内产生的cAMP可透过细胞膜进入体液中，胞外的cAMP可被细胞摄取。同时环磷酸腺苷酸也是细胞内传递激素和递质的中介因子，并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，在蛋白质的合成过程中,基因的转录和翻译都受到cAMP的影响。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。环磷酸腺苷还16 可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。因此,研究工作和医学临床试验均需大量的cAMP。图1环腺苷酸结构式1.2环磷酸腺苷生产机制环磷酸腺苷的合成主体上可分为两大类，一是通过化学法合成；二是通过生物体合成。从上个世纪五、六十年代起，一系列的化学方法被用于合成环磷酸腺苷，如：碱性水解法、活性酯类法、DCC脱水法和三氯氧磷法[6]等。生物体合成是利用生物细胞的新陈代谢生成环磷酸腺苷。利用微生物合成cAMP，可分为发酵法，酶法。发酵法又分分段合成法和全合成法；酶法又分腺苷酸环化酶法和RNA分解法。本研究主要是利用微生物发酵法中的分段合成法，通过在含有碳源氮源的基本培养基上添加前体物质，通过培养微生物细胞获得大量的环磷酸腺苷。微生物cAMP的生物合成途径[7]如图2所示。图2细菌的cAMP生物合成途径与反馈调节（）（Acase为腺苷酸环化酶；PDase为磷酸二酯酶）cAMP的积累机制：16 (1)底物的摄取；(2)cAMP合成酶的开始；(3)生成的cAMP向细胞外分泌漏出。2.材料与方法2.1实验材料实验室存放活化后的节杆菌斜面。2.2实验仪器超净工作台、恒温培养箱、回转式摇床、离心机、立式灭菌锅、还原糖自动测定仪、高效液相色谱仪、平板式加热器、双筒显微镜、培养皿、pH试纸、试管、移液管、酒精灯、吸耳球、烧杯、量筒、玻璃棒2.3实验方法2.3.1培养基种子培养基：葡萄糖2%，蛋白陈1%，酵母膏5%，pH7.0[7,8]；种子培养基的配制：称取4.0g葡萄糖，2.0g蛋白胨，10.0g酵母膏，溶于200ml蒸馏水中，调ph至7.0后分装于6个250ml的三角瓶中，再用8层纱布和双层报纸包扎瓶口灭菌备用。发酵培养基：葡萄糖5%，KH2PO41%，K2HPO41%，ZnSO4·7H2O 0.01%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，次黄嘌呤0.3%[7,8,9]；发酵培养基的配制：称取30g葡萄糖，6gKH2PO4，6gK2HPO4，0.06gZnSO4·7H2O，6g蛋白胨，3g酵母膏，1.8g次黄嘌呤，溶于600ml蒸馏水中，为了加快磷酸盐的溶解可适当加热，完全溶解后调ph至7.5后分装于18个250ml的三角瓶中，每瓶30ml，用8层纱布和双层报纸包扎瓶口，并包6支5ml移液管与发酵培养基一起灭菌备用。2.3.2移种与接种将活化后的斜面种子移种至种子培养基8层纱布包扎三角瓶口28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，再接种至发酵培养基，接种量10%(V/V)[7]，8层纱布包扎三角瓶口30℃恒温摇瓶震荡培养72以上小时。移种：超净工作台紫外照射30分钟至1小时，关紫外灯开照明灯，开鼓风机。挑选6个长势较好的不同菌落分别进行移种,每个菌落移种一个发酵瓶.具体操作如下:左手持活化试管，并将三角瓶封口解开，放置酒精灯火焰附近。右手16 取接种环在火焰上灼烧灭菌、伸入斜面试管内部冷却。用接种环轻轻划取斜面上的菌苔，再伸入三角瓶种子培养液轻轻搅动使菌体溶到培养液中；重复2到3次。移种完成后将三角瓶瓶口外层的2层报纸弃去，直接用8层纱布包扎，但不要污染瓶口处纱布。从超净工作台中取出种子培养瓶后28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，待生长到对数生长后期时移种至发酵培养液中。接种：超净工作台准备如移种方法。在超净工作台中解开封口，每瓶种子液接种3瓶发酵样瓶，分别编号11至13，21至23，31至33，41至43，51至53，61至63并用记号笔做好标记。用移液管吸取3ml种子液分别接种到已编号的发酵样瓶，同样弃去封瓶口的上层的2层报纸，在不污染瓶口纱布的情况下包扎瓶口后30℃恒温摇瓶震荡培养72小时以上。2.4高效液相检测环磷酸腺苷含量2.4.1色谱测定条件柱温为室温；柱压：19.11MPa；流速：1mL/min；波长：254nm；进样量：20μL；色谱柱：SinoChromODS-BP5μm；柱长：150×4.6mm。[4,5]流动相为V(甲醇):V(磷酸溶液)=25:75；磷酸溶液浓度为0.6%。流动相中只包含甲醇和磷酸溶液。将配置好的流动相加热至70度左右，根据需要选择0.45μm的滤膜，然后对流动相进行抽滤。抽滤后对流动相进行超声脱气10至20分钟，备用[10,11]。2.4.2样品处理发酵结束后得到的发酵液用5ml移液管移取3ml于3ml离心管中，每次移取发酵液时要用待移发酵液润洗2至3次。离心管在5000转每分钟下离心15分钟。离心结束后取上层清液，再经0.45μm针式虑头过滤后待测。2.4.3标样的配制精密称取cAMP标准品1000mg，用去离子水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到环腺苷酸标准品溶液，浓度为10mg/ml。精密称量次黄嘌呤标准品54mg，用去离子水溶解定容与100ml容量瓶中，得到次黄嘌呤标准溶液,浓度为0.54mg/ml。[3,11]2.4.4标样的线性关系精密吸取cAMP标准液1ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml分别定溶于50ml容量瓶中配制成0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg/ml六份标准液，在上述色谱条件下进样20μl[4,5]，记录色谱峰面积。环磷酸腺苷16 和次黄嘌呤的高效液相扫描图谱如3.1.2中图4，图5所示。在0.2mg/ml至6.4mg/ml浓度范围内，色谱峰面积与样品中环磷酸腺苷含量线性关系良好，线性关系图如2.4.3中图3所示。2.4.5标准曲线绘制照2.3.1色谱条件，将处理好的样品溶液与标准品溶液放入自动进样器分别进行扫描测定其峰面积。以峰面积为横坐标，浓度（mg/mL）纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，y=22948.598x-1475339.6，R²=0.9979。标准曲线见图3，样品扫描结果见3.1.2。图3环腺苷酸标准曲线3.实验结果与分析3.1实验结果3.1.1摇瓶发酵各参数测定发酵结束后，按编号排好发酵瓶进行参数测定。第一步：用50ml量筒量取各个发酵瓶中发酵液体积，做好记录。第二步：用玻璃棒蘸去适量发酵液，滴在5.0至9.0量程的ph试纸上30秒内与标准比色卡对比测定ph，做好记录。第三步：用5ml移液管移取3ml发酵液于3ml离心管中5000转每分钟，离心15分钟。用移液管移取发酵液前，先用待移发酵液润洗2到3次。第四步：取上层清液适量按上述色谱测定条件进样做高效液相测定。第五步：取上层清液适量于还原糖自动测定仪中测定发酵液中剩余还原糖的残糖量，做好记录。结果如表1。表1摇瓶发酵体积、pH、残糖结果16 编号发酵液体积（ml）Ph残糖量11276.72.67812265.501326.56.72.64521276.72.82822296.72.94723286.72.86331277.02.96832246.73.02833275.5041276.72.6004226.56.72.54043286.72.64251296.72.70152296.72.72253276.72.71261296.71.57162286.72.24763256.72.2163.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量环磷酸腺苷标准品高效液相图如图4，次黄嘌呤标准品的高效液相图如图516 图4环腺苷酸标准品的高效液相图图5次黄嘌呤标准品的高效液相图不同菌落发酵液样品高效液相图谱如图6至图23所示。图6菌落11高效液相图图7菌落12高效液相图16 图8菌落13高效液相图图9菌落21高效液相图图10菌落22高效液相图图11菌落23高效液相图16 图12菌落31高效液相图图13菌落32高效液相图图14菌落33高效液相图图15菌落41高效液相图16 图16菌落42高效液相图图17菌落43高效液相图图18菌落51高效液相图图19菌落52高效液相图16 图20菌落53高效液相图图21菌落61高效液相图图22菌落62高效液相图图23菌落63高效液相图由高效液相图分析得到各编号发酵液中环腺苷酸的含量如表216 表2发酵液中cAMP含量编号cAMP含量（mg/ml)112.249120.406132.344211.640221.338231.418310.591320.557330.547412.530422.583432.404511.995521.765531.980613.018622.729632.940菌落1至6发酵液环磷酸腺苷的平均含量如表3所示表3环磷酸腺苷平均含量菌落编号环磷酸腺苷平均含量(mg/ml)菌落12.296516 菌落21.4653菌落30.574菌落42.5057菌落51.9133菌落62.89573.2结果分析及讨论由3.1.2中不同菌落发酵液样品高效液相图6至图23分别与图4环磷酸腺苷、图5次黄嘌呤的标样图进行对比可以看出,发酵液中产生的两个吸收峰与标样图的吸收峰几乎在同一位置，说明发酵液中由微生物合成了一定量的环磷酸腺苷，同时也说明了发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余。在发酵培养基的配制中添加了0.3%的次黄嘌呤，由于微生物是将次黄嘌呤作为中间物进行代谢利用，而不是作为碳源、氮源，所以需求量少。因此在发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余是正常情况。将各发酵液的高效液相图中cAMP的波峰面积算出，再利用2.2.4中的标准曲线求得发酵样品中环磷酸腺苷的含量。最后得到的各发酵样品中cAMP含量如3.2.1中表1所示。由表1测定结果可以看出编号12和编号33的发酵瓶有些异常，ph和还原糖的残糖量都异于其他编号。这两瓶发酵液中还原糖的残余量为零，涂片后显微镜观察发现有其他非棒状杆菌和少量棒状杆菌，由此断定染菌，认定这两瓶发酵失败。在计算菌落环磷酸腺苷的平均值时，编号12和编号23的cAMP含量值不计算在内。其他各瓶发酵液ph基本一致，均含有少量还原糖，发酵状况认为正常。由表2所得各瓶发酵液中环腺苷酸的含量对比发现还原糖的残糖量越低，则发酵液中环腺苷酸cAMP的含量越高。根据表3不同菌落发酵液中cAMP平均含量的计算结果，发现编号为6的菌落的发酵液中cAMP的平均含量最高为2.8957mg/ml，其次为菌落4环磷酸腺苷的平均含量为2.5057mg/ml，平均含量最低的是菌落3含量为0.574mg/ml。不同的菌落生产环磷酸腺苷的能力差别较大，同一菌落的不同发酵样瓶中环磷酸腺苷的含量也不尽相同。初步分析主要原因有两个，一是用于实验的菌落可能只达到菌落纯，未达到菌株纯；二是可能由于实验过程中偶然的外界因素对单个发酵瓶产生了影响。若对菌落6进一步进行纯种分离纯化实验，规范实验操作定能筛选出环磷酸腺苷高产菌株。16 染菌分析：由于各发酵培养基是一起进行高压真气灭菌，只有两瓶发酵失败，推断培养基灭菌是彻底的，染菌可能是在进行发酵接种时污染杂菌。在今后的无菌操作时，要特别加以小心注意。微生物发酵染菌是发酵过程中比较重要的问题，如何避免染菌是发酵成败的关键。可从以下几方面给于避免：一、确定种子不带杂菌，从而可从源头上避免杂菌污染；二、培养基灭菌要彻底，一般采用高压蒸汽121℃，15分钟到20分钟；三、在种子液进行移种和接种时的无菌操作要规范，通常在超净工作台中进行，发酵瓶瓶口要靠近酒精灯火焰；四、接种过程瓶口不要对着风屏，尽可能是与风向平行，超净工作台中鼓风机的采风口要保持清洁卫生，避免鼓入空气带菌。4结论国内外目前生产cAMP多数是用腺苷和5′-腺苷酸作为起始原料合成环磷腺苷。以化学合成为主，操作复杂，溶剂损耗量大，收率低成本高，产量小，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用。现也有人研究从大枣中提取环腺苷酸，但限于原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低不易推广。通过本次试验，初步说明环腺苷酸的生产除了通过化学合成和从生物细胞中提取外，还可以利用微生物发酵进行生产。通过初筛获得高产菌落6和菌落4，若能进一步对菌落进行分离纯化定能筛选出高产稳定的纯菌株。将环腺苷酸的生产与生物技术相结合，从而可以使环腺苷酸的生产周期短，分离提纯容易，产品具有无化学残留污染的优点，具有广阔的发展前景。16 参考文献[1]王丽，蒋宗勇，林映才.环腺苷酸（cAMP）及其抗病生物学作用.饲料工业，2009[2]牟德华，朱艳丽.大枣环腺苷酸及其生物学功能.食品科技.2007,河北科技大学生物科学与工程学院[3]张明娟，李薇，庞晓明.枣果中环磷酸腺苷(cAMP)的提取工艺及含量测定.食品与发酵工业.2012，北京林业大学生物科学与技术学院[4]李学贵,蒋文强,王传芬.HPLC法测定大枣提取液中环腺苷酸含量的研究.山东化工.山东轻工业学院食品与生物工程学院[5]崔志强,孟宪军,王传杰.HPLC法测定冬枣环磷酸腺苷含量.食品研究与开发.沈阳农业大学食品学院[6]赵晋，田茂奎，唐巍.环磷腺苷合成工艺研究概述.理工科研，2008，西南大学化学化工学院[7]张克旭.环腺昔酸(cAMP)发酵的菌种选育与调节机制.发酵科技通讯，1980，天津轻工学院[8]应汉杰.一种微生物生产环腺苷酸的方法.南京工业大学.专利申请[9]CHEN,X.C.ETAL.:"Mediumoptimizationfortheproductionofcyclicadenosine3",5"-monophosphatebyMicrobacteriumsp.no.205usingresponsesurfaceMethodology"BIORESOURCETECHNOLOGYvol.100,no.2,2009,pages919-924[10]蒲云峰，万英，侯旭杰.HPLC法测定不同品种红枣中cAMP含量.食品研究与开发.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室[11]王荔，亓树艳，莫晓燕.大枣环磷酸腺苷提取纯化工艺的初步研究.食品科技.提取物与应用.2012,西安交通大学生命科学与技术学院16 致谢:经过近两个月的实验和整理论文，毕业设计即将结束，同时也标志着我的大学生活即将接近尾声。大学四年来在老师和同学们的帮助下，我努力学习掌握各种专业知识以及培养自己各方面的能力，尽自己的能力完成了我的学业。这次的毕业设计是一次交流和学习的机会，整个实验和论文整理过程是一个不断学习、不断提高自己、积累自己经验的过程，我从中学到了很多新知识，更培养了自己的信心和毅力。在今后的工作和学习中，我会继续发扬这段时间各项好的习惯和作风，努力做好以后的每一项工作。本文是在——师的悉心指导下完成的，在跟随常老师做实验期间从她身上我学到的不仅仅是知识和实验技能的操作,更多的是做人为事的道理。常老师治学严谨,要求严格，为人和蔼,对我今后的学习工作都有很大帮助，同时在完成本实验时也得到了康老师和实验室其他老师在实验试剂、实验药品、实验仪器和实验操作等方面提供的帮助和指导，及试验组全体同学的协助，在此一并表示衷心的感谢！16本科毕业设计（论文）开题报告学生姓名学号专业班级指导教师职称单位课题性质设计□论文□课题来源科研□教学□生产□其它□毕业设计（论文）题目 开题报告（阐述课题的目的、意义、研究现状、研究内容、研究方案、进度安排、预期结果、参考文献等）一、论文研究的目的、意义1、现实意义：指出现实当中存在这个问题，需要去研究，去解决，本课题的研究有什么实际作用。2、理论意义：论文的理论和学术价值。二、研究现状1、国内研究现状：（国内对此课题研究到了什么程度）2、国外研究现状：（国外对此课题研究到了什么程度）三、研究内容此部分即为论文大纲（大纲格式如下：）绪论(论文研究的目的、意义论文研究的内容论文的研究方法)1．。。。。。（只写该标题的名称即可）1．1．。。。1．1．1．。。。。1．2．。。。。1．2．1．。。。。2．1．。。。2．1．1．。。四、研究方案此部分内容为研究方法，即通过何种途径完成本篇论文。如观察法、调查法、实验法、 经验总结法、个案法、比较研究法、文献资料法等。在介绍方法时简单写一下通过此方法研究出了什么内容。五、进度安排在毕业任务书中有，粘贴过即可。六、预期结果本部分为你的论文预期达到什么程度。（即达到本科毕业论文答辩水平）七、参考文献参考文献的格式一定要写对。1、期刊格式：[序号]主要责任者．文献题名[J]．刊名，年，卷（期）：起止页码．如：[1]周颖，王姣.谈邮政储蓄银行对银行业竞争格局的影响[J].商业时代，2006[2]景玉琴.构建中小企业政策性金融支持体系[J].上海金融学院学报，20042、著作格式：[序号]主要责任者．文献题名[文献类型标识]．出版地：出版者，出版年.起止页码．如：[1]陈晓红.中小企业融资[M]北京.中国金融出版社，20013、报纸文章：[序号]主要责任者.文献题名[N].报纸名，出版日期（版次）．4、电子文献：[序号]主要责任者.电子文献题名[电子文献及载体类型标识].电子文献的出处或可获得地址，发表或更新日期/引用日期（任选）． 指导教师意见：指导教师签名：年月日教研室意见：审查结果：同意□不同意□教研室主任签名：年月日 电子科技大学毕业设计(论文)成绩考核表题目：教学中心：学生姓名：学号：专业：指导教师：职称：所在单位： 指导教师意见：签字：年月日评审意见：评阅人：年月日 答辩意见：答辩小组组长签名：年月日毕业设计（论文）成绩1．设计说明书（论文报告）分总分：（等级：）2．答辩分3．平时成绩分学校意见：年月日1．学生毕业设计（论文）正本存教学中心。2．本表一式两份，一份存入学生档案，一份学校存档。3．此表须用钢笔填写。 附件2：2008级统招本科生毕业论文(设计)中期检查表（学生用表）学院检查时间年月日论文题目指导教师学生姓名专业班级学号目前已完成的任务是否符合任务书要求的进度是否尚需完成的任务能否按期完成任务能不能存在的问题及拟采取的办法存在的问题拟采取的办法对指导教师的建议学生（签名）：年月日 本科生毕业论文(设计)中期检查表（教师用表）学院检查时间年月日论文题目指导教师学生姓名专业班级学号指导情况指导方式工作进度完成情况提前完成按计划完成延期完成没有完成质量评价（学生前期已完成的工作的质量情况）优良中差工作态度情况（学生对毕业论文的认真程度、纪律及出勤情况）认真较认真一般不认真选题是否有变化有无选题变化原因目前存在的问题，拟采取解决问题的方案及措施对该同学阶段性工作的评价指导教师（签名）：年月日（此表一式两份，一份学院存档，一份交教务处实践科存档。） 致谢我历时将近两个月时间终于把这篇论文写完了，在这段充满奋斗的历程中，带给我的学生生涯无限的激情和收获。在论文的写作过程中遇到了无数的困难和障碍，都在同学和老师的帮助下度过了。在校图书馆查找资料的时候，图书馆的老师给我提供了很多方面的支持与帮助，尤其要强烈感谢我的论文指导老师—XX老师，没有她对我进行了不厌其烦的指导和帮助，无私的为我进行论文的修改和改进，就没有我这篇论文的最终完成。在此，我向指导和帮助过我的老师们表示最衷心的感谢！ 同时，我也要感谢本论文所引用的各位学者的专著，如果没有这些学者的研究成果的启发和帮助，我将无法完成本篇论文的最终写作。至此，我也要感谢我的朋友和同学，他们在我写论文的过程中给予我了很多有用的素材，也在论文的排版和撰写过程中提供热情的帮助！ 金无足赤，人无完人。由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和同学批评和指正！'