《生物化学》第三版课后习题答案详解上册[1].doc 38页

'第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 第三章  氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基酸都是L型的。但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是两性电解质。当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[见表3-1]表3-1  氨基酸的简写符号名称      三字母符号      单字母符号      名称      三字母符号      单字母符号丙氨酸(alanine)      Ala      A      亮氨酸(leucine)      Leu      L精氨酸(arginine)      Arg      R      赖氨酸(lysine)      Lys      K天冬酰氨(asparagines)      Asn      N      甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)      Met      M天冬氨酸(asparticacid)      Asp      D      苯丙氨酸(phenylalanine)      Phe      FAsn和/或Asp      Asx      B                半胱氨酸(cysteine)      Cys      C      脯氨酸(praline)      Pro      P谷氨酰氨(glutamine)      Gln      Q      丝氨酸(serine)      Ser      S谷氨酸(glutamicacid)      Glu      E      苏氨酸(threonine)      Thr      TGln和/或Glu      Gls      Z                甘氨酸(glycine)      Gly      G      色氨酸(tryptophan)      Trp      W组氨酸(histidine)      His      H      酪氨酸(tyrosine)      Tyr      Y异亮氨酸(isoleucine)      Ile      I      缬氨酸(valine)      Val      V2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%  pKa=10.53(见表3-3，P133)  pH=10.53+lg20%= 9.833、计算谷氨酸的γ-COOH三分之二被解离时的溶液pH。[4.6]解：pH=pKa+lg2/3%  pKa=4.25  pH=4.25+0.176=4.4264、计算下列物质0.3mol/L溶液的pH：(a)亮氨酸盐酸盐；(b)亮氨酸钠盐；(c)等电亮氨酸。[(a)约1.46,(b)约11.5,(c)约6.05]5、根据表3-3中氨基酸的pKa值，计算下列氨基酸的pI值：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和精氨酸。[pI:6.02;5.02;3.22;10.76]解：pI=1/2（pKa1+pKa2）  pI(Ala)=1/2（2.34+9.69）=6.02  pI(Cys)=1/2（1.71+10.78）=5.02  pI(Glu)=1/2（2.19+4.25）=3.22  pI(Ala)=1/2（9.04+12.48）=10.766、向1L1mol/L的处于等电点的甘氨酸溶液加入0.3molHCl，问所得溶液的pH是多少？如果加入0.3molNaOH以代替HCl时，pH将是多少？[pH：2.71；9.23]7、将丙氨酸溶液（400ml）调节到pH8.0，然后向该溶液中加入过量的甲醛，当所得溶液用碱反滴定至Ph8.0时，消耗0.2mol/LNaOH溶液250ml。问起始溶液中丙氨酸的含量为多少克？[4.45g]8、计算0.25mol/L的组氨酸溶液在pH6.4时各种离子形式的浓度（mol/L）。[His2+为1.78×10-4，His+为0.071，His0为2.8×10-4]9、说明用含一个结晶水的固体组氨酸盐酸盐（相对分子质量=209.6；咪唑基pKa=6.0）和1mol/LKOH配制1LpH6.5的0.2mol/L组氨酸盐缓冲液的方法[取组氨酸盐酸盐41.92g(0.2mol)，加入352ml1mol/LKOH，用水稀释至1L]10、为什么氨基酸的茚三酮反映液能用测压法定量氨基酸？解：茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨脱羧反映，（其反应化学式见P139），其中，定量释放的CO2可用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。11、L-亮氨酸溶液（3.0g/50ml6mol/LHCl）在20cm旋光管中测得的旋光度为+1.81º。计算L-亮氨酸在6mol/LHCl中的比旋（[a]）。[[a]=+15.1º]12、标出异亮氨酸的4个光学异构体的（R，S）构型名称。[参考图3-15]13、甘氨酸在溶剂A中的溶解度为在溶剂B中的4倍，苯丙氨酸在溶剂A中的溶解度为溶剂B中的两倍。利用在溶剂A和B之间的逆流分溶方法将甘氨酸和苯丙氨酸分开。在起始溶液中甘氨酸含量为100mg，苯丙氨酸为81mg，试回答下列问题：(1)利用由4个分溶管组成的逆流分溶系统时，甘氨酸和苯丙氨酸各在哪一号分溶管中含量最高？（2）在这样的管中每种氨基酸各为多少毫克？[（1）第4管和第3管；（2）51.2mgGly+24mg Phe和38.4mgGly+36mgPhe]解：根据逆流分溶原理，可得：对于Gly：Kd=CA/CB=4=q(动相)/p（静相）  p+q=1=(1/5+4/5)      4个分溶管分溶3次：（1/5+4/5）3=1/125+2/125+48/125+64/125对于Phe：Kd=CA/CB=2=q(动相)/p（静相）  p+q=1=(1/3+2/3)      4个分溶管分溶3次：（1/3+2/3）3=1/27+6/27+12/27+8/27故利用4个分溶管组成的分溶系统中，甘氨酸和苯丙氨酸各在4管和第3管中含量最高，其中：第4管：Gly：64/125×100=51.2mg  Phe：8/27×81=24mg第3管：Gly：48/125×100=38.4mg  Phe：12/27×81=36mg14、指出在正丁醇：醋酸：水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的相对迁移率（假定水相的pH为4.5）：(1)Ile,  Lys;(2)Phe,Ser(3)Ala,Val,Leu;(4)Pro,Val  (5)Glu,Asp;(6)Tyr,Ala,Ser,His.[Ile>lys；Phe,>Ser；Leu>Val>Ala,；Val>Pro；Glu>Asp；Tyr>Ala>Ser≌His]解：根据P151图3-25可得结果。15．将含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、亮氨酸(pI=6.53)和赖氨酸(pI=5.98)的柠檬酸缓冲液，加到预先同样缓冲液平衡过的强阳离交换树脂中，随后用爱缓冲液析脱此柱，并分别收集洗出液，这5种氨基酸将按什么次序洗脱下来？[Asp,Thr,Gly,Leu,Lys]解：在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是减刑氨基酸(A2+)>中性氨基酸(A+)>酸性氨基酸(A0)。因此氨基酸的洗出顺序大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸，最后是碱性氨基酸，由于氨基酸和树脂之间还存在疏水相互作用，所以其洗脱顺序为：Asp,Thr,Gly,Leu, Lys。第四章  蛋白质的共价结构提要蛋白质分子是由一条或多条肽链构成的生物大分子。多肽链是由氨基酸通过肽键共价连接而成的，各种多肽链都有自己特定的氨基酸序列。蛋白质的相对分子质量介于6000到1000000或更高。蛋白质分为两大类：单纯蛋白质和缀合蛋白质。根据分子形状可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。此外还可按蛋白质的生物学功能分类。为了表示蛋白质结构的不同组织层次，经常使用一级结构、二级结构、三级结构和四级结构这样一些专门术语。一级结构就是共价主链的氨基酸序列，有时也称化学结构。二、三和四级结构又称空间结构（即三维结构）或高级结构。蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的，二氨基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列规定的。肽键（CO—NH）是连接多肽链主链中氨基酸残缺的共价键，二硫键是使多肽链之间交联或使多肽链成环的共价键。多肽链或蛋白质当发生部分水解时，可形成长短不一的肽段。除部分水解可以产生小肽之外，生物界还存在许多游离的小肽，如谷胱甘肽等。小肽晶体的熔点都很高，这说明短肽的晶体是离子晶格、在水溶液中也是以偶极离子存在的。测定蛋白质一级结构的策略是：（1）测定蛋白质分子中多肽链数目；（2）拆分蛋白质分子的多肽链；（3）断开多肽链内的二硫桥；（4）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基；（6）断裂多肽链成较小的肽段，并将它们分离开来；（7）测定各肽段的氨基酸序列；（8）利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构；（9）确定半胱氨酸残基形成的S-S交联桥的位置。序列分析中的重要方法和技术有：测定N-末端基的苯异硫氰酸酯（PITC）法，分析C-末端基的羧肽酶法，用于多肽链局部断裂的酶裂解和CNBr化学裂解，断裂二硫桥的巯基乙醇处理，测定肽段氨基酸序列的Edman化学降解和电喷射串联质谱技术，重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法以及用于二硫桥定位的对角线电泳等。在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有明显的序列相似性(称序列同源),两个物种的同源蛋白质，其序列间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统发生差异是成比例的。并根据同源蛋白质的氨基酸序列资料建立起进化树。同源蛋白质具有共同的进化起源。在生物体内有些蛋白质常以前体形试合成，只有按一定方式裂解除去部分肽链之后才出现生物活性，这一现象称蛋白质的激活。血液凝固是涉及氨基酸序列断裂的一系列酶原被激活的结果，酶促激活的级联放大，使血凝块迅速形成成为可能。凝血酶原和血清蛋白原是两个最重要的血凝因子。血纤蛋白蛋白原在凝血酶的作用下转变为血清蛋白凝块（血块的主要成分）。我国在20世纪60年代首次在世界上人工合成了蛋白质——结晶牛胰岛素。近二、三十年发展起来的固相肽合成是控制合成技术上的一个巨大进步，它对分子生物学和基因工程也就具有重要影响和意义。至今利用Merrifield固相肽合成仪已成功地合成了许多肽和蛋白质。习题1.如果一个相对分子质量为12000的蛋白质，含10种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？[10100]解：1012000/120=101002、有一个A肽，经酸解分析得知为Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr忽然两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu以及Val）可给除DNP-His，在pH6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时全中性，另一种（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时带正电荷。问A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；  2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；  3、胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以Arg和Lys为C-末端残基的肽断。酸水解使Asn→Asp+NH4+，由已知条件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-(  )-(  )-(  )-Lys-(  )-(  )-Val；  4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知条件（His、Glu、Val）可得：Asn-(  )-(  )-(  )-Lys-His-Gln-Val；  5、糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由题，得到的一条肽（Asp、Ala、Tyr）结合（3）、（4）可得该肽的氨基酸序列为：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α-NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？[（1）4个肽；（2）-2.5单位；（3）如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得4个肽段；如果存在一个二硫键应得3个肽段并且个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置]4、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂城两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？[它是一个环肽，序列为：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]解：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸，说明此肽不含游离末端NH2，即此肽为一环肽；  （2）糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，由已知两肽段氨基酸组成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-(  )-(  )-Tyr-和-(  )-(  )-(  )-Phe-；   （3）由（2）得的两肽段分别与FDNB反应，分别产生DNP-Ser和DNP-Lys可知该两肽段的N-末端分别为-Ser-和-Lys-，结合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-(  )-(  )-Phe-；  （4）胰蛋白酶专一断裂Arg或Lys残基的羧基参与形成的肽键，由题生成的两肽段氨基酸组成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-(  )-(  )-(  )-(  )-Lys；  综合（2）、（3）、（4）可得此肽一级结构为：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-5、三肽Lys-Lys-Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值，这种说法是否正确？为什么？[正确，因为此三肽处于等电点时，七解离集团所处的状态是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3个侧链3（1/3ε-NH3+）（pKa=10.53）(pKa=10.53),因此pI>最大的pKa值（10.53）]6、一个多肽可还原为两个肽段，它们的序列如下：链1为Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys；链2为Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。（结构如下图）          S-SAla-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_Cys                  S                  S            Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys解：嗜热菌蛋白酶作用专一性较差，根据题中已知条件：  （1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链1在2位Cys后及11位Val前发生断裂，2位Cys与12位Cys之间有二硫键；  （2）由链1序列可得该肽段序列为：-Phe-Pro-Lys-Arg-；  （3）由（1）（2）可知该肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys来自链2，另一Cys为链1中8位Cys，即链1中8位Cys与链2中的一个Cys有二硫键；（4）嗜热菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸残基，故此肽（Cys2、Phe）来自链2，结合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫键为链18位Cys与链2中3位Cys与链2中3位Cys之间；（4）中（Cys2、Phe）说明链2中1位Cys与5位Cys中有二硫键。综合（1）、（2）、（3）、（4）可得结果。7、一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物：NH4+  Asp  Glu    Tyr    ArgMet    Pro    Lys    Ser    Phe并观察下列事实：（1）用羧肽酶A和B处理该十肽无效；（2）胰蛋白酶处理产生两各四肽和游离的Lys；（3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母符号表示其序列位NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷；（6）一轮Edman降解给出下面的PTH衍生物：（图略）写出该十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]解：（1）用羧肽酶A和B处理十肽无效说明该十肽C-末端残基为-Pro；   （2）胰蛋白酶专一断裂Lys或Arg残基的羧基参与形成的肽键，该十肽在胰蛋白酶处理后产生了两个四肽和有利的Lys，说明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四种可能的肽段，且水解位置在4与5、5与6或4与5、8与9、9与10之间；  （3）梭菌蛋白酶专一裂解Arg残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生一个四肽和一个六肽，则可知该十肽第四位为-Arg-；  （4）溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键，处理该十肽后产生一个八肽和一个二肽，说明该十肽第八位或第二位为-Met-；用单字母表示二肽为NP，即-Asn-Pro-，故该十肽第八位为-Met-；  （5）胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两个三肽和一个四肽，说明该十肽第三位、第六位或第七位为Trp或Phe；  （6）一轮Edman降解分析N-末端，根据其反应规律，可得N-末端氨基酸残疾结构式为：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，还原为-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此为Ser；   结合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知该十肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro8、一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]解：胰蛋白酶酶专一水解Lys和Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有强光吸收且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性，说明该肽段含Tyr和Arg；溴化氰专一断裂Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽段为-Met-Pro-；所以该四肽的氨基酸组成为Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为CNVRAPETALCARRCOOH，已知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应，（1）问此肽中存在多少个二硫键？（2）请设计确定这些（个）二硫键位置的策略。[（1）两个；（2）二硫键的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一种情况，用胰蛋白酶断裂将产生两个肽加Arg；第二种情况和第三种，将产生一个肽加Arg，通过二硫键部分氧化可以把后两种情况区别开来。]10、叙述用Mernfield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？第五章  蛋白质的三维结构提要每一种蛋白质至少都有一种构像在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构像称为蛋白质的天然构像。研究蛋白质构像的主要方法是X射线晶体结构分析。此外紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、核磁共振和重氢交换等被用于研究溶液中的蛋白质构像。稳定蛋白质构像的作用有氢键、范德华力、疏水相互作用和离子键。此外二硫键在稳定某些蛋白质的构像种也起重要作用。多肽链折叠成特定的构像受到空间上的许多限制。就其主链而言，由于肽链是由多个相邻的肽平面构成的，主链上只有α-碳的二平面角Φ和Ψ能自由旋转，但也受到很大限制。某些Φ和Ψ值是立体化学所允许的，其他值则不被允许。并因此提出了拉氏构像，它表明蛋白质主链构象在图上所占的位置是很有限的（7.7%-20.3%）。蛋白质主链的折叠形成由氢键维系的重复性结构称为二级结构。最常见的二级结构元件有α螺旋、β转角等。α螺旋是蛋白质中最典型、含量最丰富的二级结构。α螺旋结构中每个肽平面上的羰氧和酰氨氢都参与氢键的形成，因此这种构象是相当稳定的。氢键大体上与螺旋轴平行，每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，每个残基绕轴旋转100°，螺距为0.54nm。α-角蛋白是毛、发、甲、蹄中的纤维状蛋白质，它几乎完全由α螺旋构成的多肽链构成。β折叠片中肽链主链处于较伸展的曲折（锯齿）形式，肽链之间或一条肽链的肽段之间借助氢键彼此连接成片状结构，故称为β折叠片，每条肽链或肽段称为β折叠股或β股。肽链的走向可以有平行和反平行两种形式。平行折叠片构象的伸展程度略小于反平行折叠片，它们的重复周期分别为0.65nm和0.70nm。大多数β折叠股和β折叠片都有右手扭曲的倾向，以缓解侧链之间的空间应力（steric strain）。蚕丝心蛋白几乎完全由扭曲的反平行β折叠片构成。胶原蛋白是动物结缔组织中最丰富的结构蛋白，有若干原胶原分子组成。原胶原是一种右手超螺旋结构，称三股螺旋。弹性蛋白是结缔组织中另一主要的结构蛋白质。蛋白质按其外形和溶解度可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。α-角蛋白、丝心蛋白（β-角蛋白）、教员蛋白和弹性蛋白是不溶性纤维状蛋白质；肌球蛋白和原肌球蛋白是可溶性纤维状蛋白质，是肌纤维中最丰富的蛋白质。球状蛋白质是一类可溶性的功能蛋白，如酶、抗体、转运蛋白、蛋白质激素等，膜蛋白是一类与膜结构和功能紧密相关的蛋白质，它们又可分为膜内在蛋白质、脂锚定蛋白质以及膜周边蛋白质。蛋白质结构一般被分为4个组织层次（折叠层次），一级、二级、三级和四级结构。细分时可在二、三级和四级结构。细分时可在二、三级之间增加超二级结构和结构域两个层次。超二级结构是指在一级序列上相邻的二级结构在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成的组合体。超二级结构有3中基本形式：αα（螺旋束）、βαβ（如Rossman折叠）、ββ（β曲折和希腊钥匙拓扑结构）。结构域是在二级结构和超二级结构的基础上形成并相对独立的三级结构局部折叠区。结构域常常也就是功能域。结构域的基本类型有：全平行α螺旋结构域、平行或混合型β折叠片结构域、反平行β折叠片结构域和富含金属或二硫键结构域等4类。球状蛋白质可根据它们的结构分为全α-结构蛋白质、α、β-结构蛋白质、全β-结构蛋白质和富含金属或二硫键蛋白质等。球状蛋白质有些是单亚基的，称单体蛋白质，有些是多亚基的，称寡聚或多聚蛋白质。亚基一般是一条多胎链。亚基（包括单体蛋白质）的总三维结构称三级结构。球状蛋白质种类很多，结构也很复杂，各有自己独特的三维结构。但球状蛋白质分子仍有某些共同的结构特征：①一种分子可含多种二级结构元件，②具有明显的折叠层次，③紧密折叠成球状或椭球状结构，④疏水测链埋藏在分子内部，亲水基团暴露在分子表面，⑤分子表面往往有一个空穴（活性部位）。蛋白质受到某些物理或化学因素作用时，引起生物活性丢失，溶解度降低以及其他的物理化学常数的改变，这种现象称为蛋白质变性。变性实质是非共价键破裂，天然构象解体，但共价键未遭破裂。有些变性是可逆的。蛋白质变性和复性实验表明，一级结构规定它的三维结构。蛋白质的生物学功能是蛋白质天然构象所具有的性质。天然构象是在生理条件下热力学上最稳定的即自由能最低的三维结构。蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低构象的。折叠动力学研究表明，多肽链折叠过程中存在熔球态的中间体，并有异构酶和伴侣蛋白质等参加。寡聚蛋白是由两个或多个亚基通过非共价相互作用缔合而成的聚集体。缔合形成聚集体的方式构成蛋白质的四级结构，它涉及亚级在聚集体中的空间排列（对称性）以及亚基之间的接触位点（结构互补）和作用力（非共价相互作用的类型）。习题1.（1）计算一个含有78个氨基酸的α螺旋的轴长。（2）此多肽的α螺旋完全伸展时多长？[11.7nm；28.08nm]解：（1）α螺旋中每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm，故该α螺旋的轴长为：78×0.15nm=11.7nm(2)α螺旋每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，故该α螺旋圈数为：78÷3.6圈；α螺旋的直径约为0.5nm，故每圈轴长为0.5πnm。完全伸展的α螺旋长度约为：0.5π×（78÷3.6）≌ 34.01nm。2.某一蛋白质的多肽链除一些区段为α螺旋构想外，其他区段均为β折叠片构象。该蛋白质相对分子质量为240000，多肽链外姓的长度为5.06×10-5cm。试计算：α螺旋占该多肽链的百分数。（假设β折叠构象中每氨基酸残疾的长度为0.35nm）[59%]解：一般来讲氨基酸的平均分子量为120Da，此蛋白质的分子量为240000Da，所以氨基酸残基数为240000÷120=2000个。设有X个氨基酸残基呈α螺旋结构，则：X•0.15+（2000-X）×0.35=5.06×10-5×107=506nm解之得X=970，α螺旋的长度为970×0.15=145.5，故α-螺旋占该蛋白质分子的百分比为：145.5/536×100%=29%3.虽然在真空中氢键键能约为20kj/mol，但在折叠的蛋白质中它对蛋白质的桅顶焓贡献却要小得多（<5kj/mol）。试解释这种差别的原因。[在伸展的蛋白质中大多数氢键的共体和接纳体都与水形成氢键。折旧时氢键能量对稳定焓贡献小的原因。]4.多聚甘氨酸是一个简单的多肽，能形成一个具有φ=-80°ψ=+120°的螺旋，根据拉氏构象图（图5-13），描述该螺旋的（a）手性；（b）每圈的碱基数。[（a）左手；（b）3.0]解：据P206图5-13拉氏构象图，=φ-80°ψ=+120°时可知该螺旋为左手性，每圈残基数为3.0。5.α螺旋的稳定性不仅取决于肽链间的氢键形成，而且还取决于肽链的氨基酸侧链的性质。试预测在室温下的溶液中下列多聚氨基酸那些种将形成α螺旋，那些种形成其他的有规则的结构，那些种不能形成有规则的结构？并说明理由。（1）多聚亮氨酸，pH=7.0；（2）多聚异亮氨酸，pH=7.0；（3）多聚精氨酸，pH=7.0；（4）多聚精氨酸，pH=13；（5）多聚谷氨酸，pH=1.5；（6）多聚苏氨酸，pH=7.0；（7）多聚脯氨酸，pH=7.0；[（1）（4）和（5）能形成α螺旋；（2）（3）和（6）不能形成有规则的结构；（7）有规则，但不是α螺旋]6.多聚甘氨酸的右手或左手α螺旋中哪一个比较稳定？为什么？[因为甘氨酸是在α-碳原子上呈对称的特殊氨基酸，因此可以预料多聚甘氨酸的左右手α螺旋（他们是对映体）在能量上是相当的，因而也是同等稳定的。]7.考虑一个小的含101残基的蛋白质。该蛋白质将有200个可旋转的键。并假设对每个键φ和ψ有亮个定向。问：（a）这个蛋白质可能有多种随机构象（W）？（b）根据（a）的答案计算在当使1mol该蛋白质折叠成只有一种构想的结构时构想熵的变化（ΔS折叠）；（c）如果蛋白质完全折叠成由H键作为稳定焓的唯一来源的α螺旋，并且每molH键对焓的贡献为-5kj/mol，试计算ΔH折叠；（d）根据逆的（b）和（c）的答案，计算25℃时蛋白质的ΔG折叠。该蛋白质的折叠形式在25℃时是否稳定？[（a）W=2200=1.61×1060；（b）ΔS折叠=1.15kj/（K•mol）（c）ΔH折叠100×（-5kj/mol）=-500kj/mol；注意，这里我们没有考虑在螺旋末端处某些氢键不能形成这一事实，但考虑与否差别很小。（d）ΔG折叠=-157.3kj/mol.由于在25℃ 时ΔG折叠<0，因此折叠的蛋白质是稳定的。]8.两个多肽链A和B，有着相似的三级结构。但是在正常情况下A是以单体相识存在的，而B是以四聚体（B4）形式存在的，问A和B的氨基酸组成可能有什么差别。[在亚基-亚基相互作用中疏水相互作用经常起主要作用，参与四聚体B4的亚基-亚基相互作用的表面可能比单体A的对应表面具有较多的疏水残基。]9.下面的序列是一个球状蛋白质的一部分。利用表5-6中的数据和Chou-Faman的经验规则，预测此区域的二级结构。RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH[残基4-11是一个α螺旋，残基14-19和24-30是β折叠片。残基20-23很可能形成β转角]10.从热力学考虑，完全暴露在水环境中和完全埋藏在蛋白质分子非极性内部的两种多肽片段，哪一种更容易形成α螺旋？为什么？[埋藏在蛋白质的非极性内部时更容易形成α螺旋。因为在水环境中多肽对稳定焓（ΔH折叠）的贡献要小些。]11.一种酶相对分子质量为300000，在酸性环境中可解理成两个不同组分，其中一个组分的相对分子质量为100000，另一个为50000。大的组分占总蛋白质的三分之二，具有催化活性。用β-巯基乙醇（能还原二硫桥）处理时，大的失去催化能力，并且它的沉降速度减小，但沉降图案上只呈现一个峰（参见第7章）。关于该酶的结构作出什么结论？[此酶含4个亚基，两个无活性亚基的相对分子质量为50000，两个催化亚基的相对分子质量为100000，每个催化亚基是由两条无活性的多肽链（相对分子质量为50000）组成。彼此间由二硫键交联在一起。]12.今有一种植物的毒素蛋白，直接用SDS凝胶电泳分析（见第7章）时，它的区带位于肌红蛋白（相对分子质量为16900）和β-乳球蛋白（相对分子质量37100）良种蛋白之间，当这个毒素蛋白用β-巯基乙醇和碘乙酸处理后，在SDS凝胶电泳中仍得到一条区带，但其位置靠近标记蛋白细胞素（相对分子质量为13370），进一步实验表明，该毒素蛋白与FDNB反应并酸水解后，释放出游离的DNP-Gly和DNP-Tyr。关于此蛋白的结构，你能做出什么结论？[该毒素蛋白由两条不同的多肽链通过链间二硫键交联而成，每条多肽链的相对分子质量各在13000左右。]13.一种蛋白质是由相同亚基组成的四聚体。（a）对该分子说出来年各种可能的对称性。稳定缔合的是哪种类型的相互作用（同种或异种）？（b）假设四聚体，如血红蛋白，是由两个相同的单位（每个单位含α和β两种链）组成的。问它的最高对称性是什么？[（a）C4和D2，C4是通过异种相互作用缔合在一起，D2是通过同种相互作用缔合在一起，（b）C2因为每个αβ二聚体是一个不对称的原聚体]14.证明一个多阶段装配过程比一个单阶段装配过程更容易控制蛋白质的质量。考虑一个多聚体酶复合物的合成，此复合物含6个相同的二聚体，每个二聚体由一个多肽A和一个B组成，多肽A和B的长度分别为300个和700个氨基酸残基。假设从氨基酸合成多肽链，多肽链组成二聚体，再从二聚体聚集成多聚体酶，在这一建造过程中每次操作的错误频率为10-8，假设氨基酸序列没有错误的话，多肽的折叠总是正确的，并假设在每一装配阶段剔除有缺陷的亚结构效率为100%，试比较在下列情况下有缺陷复合物的频率：（1）该复合物以一条6000个氨基酸连续的多肽链一步合成，链内含有6个多肽A和6个多肽B。（2）该复合物分3个阶段形成：第一阶段，多肽A和B的合成；第二阶段，AB二聚体的形成；第三阶段，6个AB二聚体装配成复合物。[（1）有缺陷复合物的平均频率是6000×10-8=6×10-5][（2）由于有缺陷的二聚体可被剔除，因此有缺陷复合物的平均率只是最后阶段的操作次数（5此操作装配6个亚基）乘以错误频率，即：5×10-8。因此它比一步合成所产生的缺陷频率约低1000倍。]第六章  蛋白质结构与功能的关系提要肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是脊椎动物中的载氧蛋白质。肌红蛋白便于氧在肌肉中转运，并作为氧的可逆性贮库。而血红蛋白是血液中的氧载体。这些蛋白质含有一个结合得很紧的血红素辅基。它是一个取代的卟啉，在其中央有一个铁原子。亚铁（Fe2+）态的血红素能结合氧，但高铁（+3）态的不能结合氧。红血素中的铁原子还能结合其他小分子如CO、NO等。肌红蛋白是一个单一的多肽链，含153个残基，外形紧凑。Mb内部几乎都是非极性残基。多肽链中约75%是α螺旋，共分八个螺旋段。一个亚铁血红素即位于疏水的空穴内，它可以保护铁不被氧化成高铁。血红素铁离子直接与一个His侧链的氮原子结合。此近侧His（H8）占据5个配位位置。第6个配位位置是O2的结合部位。在此附近的远侧His（E7）降低在氧结合部位上CO的结合，并抑制血红素氧化或高铁态。氧与Mb结合是可逆的。对单体蛋白质如Mb来说，被配体（如）O2占据的结合部位的分数是配体浓度的双曲线函数，如Mb的氧集合曲线。血红蛋白由4个亚基（多肽链）组成，每个亚基都有一个血红素基。HbA是成人中主要的血红蛋白，具有α2β2的亚基结构。四聚体血红蛋白中出现了单体血红蛋白所不具有的新性质，Hb除运载氧外还能转运H+和CO2。血红蛋白以两种可以相互转化的构象态存在，称T（紧张）和R（松弛）态。T态是通过几个盐桥稳定的。无氧结合时达到最稳定。氧的结合促进T态转变为R态。氧与血红蛋白的结合是别构结合行为的一个典型例证。T态和R态之间的构象变化是由亚基-亚基相互作用所介导的，它导致血红蛋白出现别构现象。Hb呈现3种别构效应。第一，血红蛋白的氧结合曲线是S形的，这以为着氧的结合是协同性的。氧与一个血红素结合有助于氧与同一分子中的其他血红素结合。第二，H+和CO2促进O2从血红蛋白中释放，这是生理上的一个重要效应，它提高O2在代谢活跃的组织如肌肉的释放。相反的，O2促进H+和CO2在肺泡毛细血管中的释放。H+、CO2和O2的结合之间的别构联系称为Bohr效应。第三，血红蛋白对O2的亲和力还受2、3-二磷酸甘油酸（BPG）调节，BPG是一个负电荷密度很高的小分子。BPG能与去氧血红蛋白结合，但不能与氧合血红蛋白结合。因此，BPG是降低血红蛋白对氧的亲和力的。胎儿血红蛋白（α2β2）比成年人的血红蛋白    （α2β2）有较高的氧亲和力，就是因为它结合BPG较少。导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病，这是一种遗传病。了解最清楚的分子病是镰刀状细胞贫血病。这种病人的步正常血红蛋白称为HbS，它只是在两条β链第六位置上的Glu倍置换乘Val。这一改变在血红蛋白表面上产生一个疏水小区，因而导致血红蛋白聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低。纯合子的病人出现慢性贫血而死亡。地中海贫血是由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的。棉衣反映是由特化的白细胞——淋巴细胞和巨噬细胞及其相关的蛋白质之间的相互作用介导的。T淋巴细胞产生T细胞受体，B淋巴细胞产生免疫球蛋白，即抗体。所有的细胞都能产生MHC蛋白，它们在细胞表面展示宿主（自我）肽或抗原（非自我）肽。助T细胞诱导那些产生免疫球蛋白的B细胞和产生T细胞受体的胞毒T细胞增殖。免疫球蛋白或T细胞受体能与特异的抗原结合。一个特定的祖先细胞通过刺激繁殖，产生一个具有同样免疫能力的细胞群的过程称为克隆选择。人类具有5个类别的免疫球蛋白，每一类别的生物学功能都是不同的。最丰富的是IgG类，它由4条多肽链组成，两条重链，两条轻链，通过二硫键连接成Y形结构的分子。靠近Y的两“臂”顶端的结构域是多变区，形成来年各个抗原结合部位。一个给顶的免疫球蛋白一般只结合一个大抗原分子的一部分，称为表位。结合经常涉及IgG的构象变化，以便域抗原诱导契合。由于抗体容易制取并具有高度特异性，它成为许多分析和制备生化方法的核心，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印迹和单克隆抗体技术等都得到广泛应用。在发动机蛋白质中蛋白质-配体相互作用上空间和时间的组织达到相当完善的程度。肌肉收缩是由于肌球蛋白和肌动蛋白“精心安排”的相互作用的结果。肌球蛋白是由纤维状的尾和球状的头组成的棒状分子，在肌肉中倍组织成粗丝。G-肌动蛋白是一种单体，由它聚集成纤维状的F-肌动蛋白，后者是细丝的主体。由粗丝和细丝构成肌肉收缩单位——肌节。肌球蛋白上的ATP水解与肌球蛋白头片的系列构象变化相偶联，引起肌球蛋白头从 F-肌动蛋白亚基上解离并与细丝前方的另一F-肌动蛋白亚基再结合。因此肌球蛋白沿肌动蛋白细丝滑动。肌肉收缩受从肌质网释放的Ga2+刺激。Ga2+与肌钙蛋白结合导致肌钙蛋白-原肌球蛋白复合体的构象变化，引发肌动蛋白-肌球蛋白0相互作用的循环发生。习题1.蛋白质A和B各有一个配体X的结合部位，前者的解离常数Kd为10-6mol/L。（a）哪个蛋白质对配体X的亲和力更高？（b）将这两个蛋白质的Kd转换为结合常数Ka。[（a）蛋白质B；（b）蛋白质A的Ka=106(mol/L)-1，蛋白质B的Ka=10-9(mol/L)-12.下列变化对肌红蛋白和血红蛋白的O2亲和力有什么影响？（a）血浆的pH从7.4降到7.2；（b）肺中CO2分压从45torr（屏息）降到15torr（正常）；（c）BPG水平从4.5mmol/L（海平面）增至7.5mmol（高空）。[对肌红蛋白：（a）无；（b）无；（c）无。对血红蛋白：（a）降低；（b）增加；（c）降低]3.在37℃，pH7.4，CO2分压40torr和BPG正常胜利水平（4.5mmol/L血）条件下，人全血的氧结合测定给出下列数据：p（O2）      %饱和度（=100×Y）10.6      1019.5      3027.4      5037.5      7050.4      8577.3      9692.3      98（a）      根据这些数据，绘制氧结合曲线；估算在（1）100torrp（O2）(肺中)和（2）30torrp（O2）（静脉血中）下血的氧百分饱和度。（b）      肺中[100torrp（O2）]结合的氧有百分之多少输送给组织[30torrp（O2）]？（c）      如果在毛细血管中pH降到7.0，利用图6-17数据重新估算（b）部分。[（a）（1）98%，（2）58%；（b）约40%；（c）约50%]解：（a）图略，从图中克知分别为98%和58%；  （b）98%-58%=40%，故约40%；  （c）当pH降到7.0时，据图6-17可知：96%-46%=50%。4.如果已知P50和n，可利用方程（6-15）Y/（1-Y）=[p（O2）/P50]n计算Y（血红蛋白氧分数饱和度）。设P50=26torr，n=2.8，计算肺（这里p（O2）=100torr）中的Y和毛细血管（这里p（O2）=40torr）中的Y。在这些条件下输氧效率（Y肺-Y毛细血管=ΔY）是多少？除n=1.0外，重复上面计算。比较n=2.8和n=1.0时的ΔY值。并说出协同氧结合对血红蛋白输氧效率的影响。[n=2.8时，Y肺=0.98，Y毛细血管=0.77，所以，ΔY=0.21，n=1.0时，Y肺=0.79，Y毛细血管=0.61，所以，ΔY=0.18，两ΔY之差0.21-0.18=0.03，差值似乎不大，但在代谢活跃的组织中p（O2）<40torr，因此潜在输氧效率不小，参见图6-15]解：Y肺/（1-Y肺）=[100/26]2.8      Y肺=0.98Y毛/（1-Y毛）=[40/26]2.8        Y毛=0.77ΔY=0.98-0.77=0.21当n=1.0时，同理，Y肺=0.79  Y毛=0.61   ΔY=0.185.如果不采取措施，贮存相当时间的血，2.3-BPG的含量会下降。如果这样的血用于输血可能会产生什么后果？[贮存过时的红血球经酵解途径代谢BPG。BPG浓度下降，Hb对O2的亲和力增加，致使不能给组织供氧。接受这种BPG浓度低的输血，病人可能被窒息。]6.HbA能抑制HbS形成细长纤维和红细胞在脱氧后的镰刀状化。为什么HbA具有这一效应？[去氧HbA含有一个互补部位，因而它能加到去氧HbS纤维上。这样的纤维不能继续延长，因为末端的去氧HbA分子缺少“粘性”区。]7.一个单克隆抗体与G-肌动蛋白结合但不与F-肌动蛋白结合，这对于抗体识别抗原表位能告诉你什么？[该表位可能是当G-肌动蛋白聚合成F-肌动蛋白时被埋藏的那部分结构。]8．假设一个Fab-半抗原复合体的解离常数在25℃和pH7时为5×10-7mol/L。（a）结合的标准自由能（25℃和pH7时）是多少？（b）此Fab的亲和力结合常数是多少？（c）从该复合体中释放半抗原的速度常数为120S-1。结合的速度常数是多少？此说明在结合半抗原时抗体中的结构变化是大还是小？[（a）ΔG0ˊ=35.9kj/mol；（b）Ka=2×106mol-1L；（c）结合速度常数k=2×108mol-1S-1L，此值接近于小分子与蛋白质相遇（结合）的扩散控制限制（108至109mol-1S-1L）]9.抗原与抗体的结合方式与血红蛋白的氧结合相似。假设抗原是一价，抗体是n价，即6抗体分子有n个结合部位，且各结合部位的结合常数Ka值是相同的，则可证明当游离抗原浓度为[L]时，结合到抗体上的抗原浓度[Lp]与抗体的总浓度[Pr]之比值，N=[Lp]/[Pr]=(nKa[L])/(1+Ka[L])N实际上表示被一个抗体分子结合的抗原分子平均数。（a）证明上面的方程可重排为N/[L]=Kan-KaN此方程式称Scatchard方程，方程表明，N/[L]对N作图将是一条直线。（b）根据Scatchard方程，利用下列数据作图求出抗体-抗原反应的n和Ka值。[L]mol/L      N1.43×10-5      0.52.57×10-5      0.776.00×10-5      1.201.68×10-4      1.683.70×10-4      1.85[（a）第一个方程两边各乘（1+Ka[L]），然后两边各除以[L]，并重排第2个方程；（b）根据第二方程，N/[L]对N作图的斜率是-Ka，N/[L]=0时的截距给出n。利用数据作图得Ka=2.2×10-4mol/L，n=2.1。因为结合部位数目只可能是整数，所以n=2]10.一个典型的松弛肌节中细丝长约2μm，粗丝长约为1.5μm。（a）      估算在松弛和收缩时粗丝和细丝的重叠情况。（b）      一次循环中肌球蛋白沿细丝滑行“一步”移动约7.5nm，问一次收缩中每个肌动蛋白纤维需要进行多少个步？[（a）约0.75nm，（b）约67步]解：（a）根据P281图6-35A所示，当松弛是重叠总长度为：（1+1）-（3-1.5）=0.5μm    0.5/2=0.25μm当收缩时重叠总长度为：（1+1）-（2-1.5）=1.5μm    1.5/2=0.75μm（b）（3-2）÷2×103÷7.5≌ 67步第七章  蛋白质的分离、纯化和表征提要蛋白质也是一种两性电解质。它的酸碱性质主要决定于肽链上可解离的R基团。对某些蛋白质说，在某一pH下它所带的正电荷与负电荷相等，即净电荷为零，此pH称为蛋白质的等电点。各种蛋白质都有自己特定的等电点。在等电点以上的pH时蛋白质分子带净负电荷，在等电点以下的pH时带净正电荷。蛋白质处于等电点时溶解度最小。在无盐类干扰情况下，一种蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等离子点，它是该蛋白质的特征常数。测定蛋白质相对分子质量（Mr）的最重要的方法是利用超速离心机的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系数（s）的定义是单位离心场强度的沉降速度。s也常用来近似地描述生物大分子的大小。凝胶过滤是一种简便的测定蛋白质Mr的方法。SDS-聚丙乙酰胺凝胶电泳（PAEG）用于测定单体蛋白质或亚基的Mr。蛋白质溶液是亲水胶体系统。蛋白质分子颗粒（直径1～100nm）是系统的分散相，水是分散介质。蛋白质分子颗粒周围的双电层和水化层是稳定蛋白质胶体系统的主要因素。分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的下列性质：（1）分子大小；（2）溶解度；（3）电荷；（4）吸附性质；（5）对配体分子特异的生物学亲和力。透析和超过滤是利用蛋白质不能通过半透膜的性质使蛋白质分子和小分子分开，常用于浓缩和脱盐。密度梯度离心和凝胶过滤层析都已成功地用于分离蛋白质混合物。等电点沉淀、盐析和有机溶剂分级分离等方法常用于蛋白质分离的头几步。移动界面电泳、各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细血管电泳以及等电聚焦具有很高的分辨率。纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂的离子交换柱层析已广泛地用于蛋白质的分离纯化。HPLC和亲和层析法是十分有效的分离纯化方法。蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，例如PAGE、等电聚焦、毛细血管电泳、沉降分析和HPLC等。如果制品是纯的，在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一条带。必须指出，任何单独鉴定只能认为是蛋白质分子均医性的必要条件而不是充分条件。习题1.测得一种血红素蛋白质含0.426%铁，计算最低相对分子质量。一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸的分子质量都是2.48%，问其最低相对分子质量是多少？[13110；15870]解：（1）蛋白质MV=55.8÷0.426%=13100  （2）亮氨酸和异亮氨酸的分子质量都是131Da，根据两种氨基酸的含量来看，异亮氨酸：亮氨酸=2.48%：1.65%=3：2，所以在此蛋白质中的亮氨酸至少有两个，异亮氨酸至少有三个，那么：1.65%=2×（131-18）÷蛋白质MV  蛋白质MV=14581Da。2.超速离心机的转速为58000r/min时，（1）计算角速度ω，以rad/s表示；（2）计算距旋转中心6.2cm处的离心加速度a；（3）此离心加速度相当于重力加速度“g”的多少倍？[（1）ω=6070.7rad/s  （2）a=2.284×108cm/s2；（3）a=233061g]解：（1）ω=58000×2π/60=6070.7rad/s  （2）a=（6070.7）2×6.2=2.285×108cm/s2  （3）2.285×108/9.8=233163263.一种蛋白质的偏微比容为0.707cm2/g,当温度校正为20℃，溶剂校正为水时扩散系数（D20.W）为13.1×10-7cm2/s.沉降系数（S20.W）为2.05S。20℃时水的密度为0.998g/ cm3,根据斯维德贝格公式计算该蛋白质的相对分子质量。[13000]解：Mr=(RTs)/[D(1-υρ)]=8.314×（273+20）×2.05/[13.1×10-7（1-0.707×0.998）]=130004.一个层析柱中负顶相体积（Vs）为流动相体积（Vm）的1/5。假设某化合物的分配系数，（a）Kd=1；（b）Kd=50。计算该化合物的有效分配系数（Keff），也称容量因子（capacity）。[（a）Keff=0.2；(b)Keff=10]5.指出从分子排阻层析柱上洗脱下列蛋白质时的顺序。分离蛋白质的范围是5000到400000；肌红蛋白、过氧化氢酶、细胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它们的Mr见表7-4）。[肌球蛋白、过氧化氢酶、血清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌红蛋白、细胞色素C]6.由第5题所述的，从分子排阻层析柱上洗脱细胞色素C、β-乳球蛋白和血清红蛋白时，其洗脱体积分别为118、58、37和24ml，问未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白质都是球形的，并且都处于柱的分级分离范围。[52000]7.在下面指出的pH下，下述蛋白质在电场中相哪个方向移动，即向正极、负极还是不动？（根据表7-2的数据判断。）（1）血清蛋白，pH5.0；（2）β-乳球蛋白，pH5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，pH5.0、9.1和11。[（1）正极；（2）负极、正极；（3）负极、不动、正极]解：（1）卵清蛋白pI=4.6，pH=5.0>4.6  带负电，向正极移动；  （2）β-乳球蛋白pI=5.2，pH=5.0<5.2  带正电，向负极移动；                  pH=7.0>5.2  带负电，向正极移动；  （3）胰凝乳蛋白酶原pI=9.1，pH=5.0<9.1带正电，向负极移动；pH=9.1=pI  净电荷为零，不移动；pH=11>9.1  带负电，向正极移动；8.（1）当Ala、Ser、Phe、Leu、Arg、Asp和His的混合物在pH3.9进行纸电泳时，哪些氨基酸移向正极？哪些氨基酸移向负极？（2）纸电泳时，带有相同电荷的氨基酸常有少许分开，例如Gly可与Leu分开，试说明为什么？（3）设Ala、Val、Glu、Lys和Thr的混合物pH为6.0，试指出纸电泳后氨基酸的分离情况。PI值：Ala：6.02  Ser：5.68Phe：5.48Leu：5.98Arg：10.76Asp：2.97His：7.59[（1）Ala、Ser、Phe和Leu以及Arg和His向负极，Asp移向正极；（2）电泳时，具有相同电荷的较大分子比较小分子移动得慢，因为电荷/质量之比较小，因而引起每单位质量迁移的驱动力也较小。（3）Glu移向正极，Lys移向负极,Val、Ala和Thr则留在原点。]9.凝胶过滤层析和凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？10.配制一系列牛血清清蛋白（BSA）稀释液，每一种溶液取0.1ml进行Bradford法测定。对适当的空白测定595nm波长处的光吸收（A595）。结果如下表所示：BSA浓度（mg•L-1）      A5951.5      1.41.0      0.970.8      0.790.6      0.590.4      0.370.2       0.17BSA浓度对A595作图得标准曲线。E.coli的蛋白质提取液样品（0.1ml）测得的A595为0.84。根据标准曲线算出E.coli提取液中的蛋白质浓度。[0.85mg/ml]解：标准曲线略。由标准曲线可知，当A595为0.84时，BSA浓度为0.85mg/ml。第八章  酶通论提要生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。酶的分离纯化是酶学研究的基础。已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。在酶的制备过程中，没一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。测定酶活力及测酶反应的初速率。酶活力大小来表示酶含量的多少。20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。有催化分子内和分分子间反应的核酶。具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。根据酶催化的过度态理论，设计各种过度态类似物作为半抗原免疫动物，筛选具有催化活性的单抗。抗体酶具有酶的一切性质。现已研制出催化多种反应的抗体酶。抗体酶的发现，不仅为酶的过度态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。 酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术，是生物工程的支柱。根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。随着化学工程技术及基因工程技术的发展，酶工程发展更为迅速，必将成为一个很大的生物技术产业。习题1.酶作为生物催化剂有哪些特点？答：酶是细胞所产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般非生物催化剂相比较有以下几个特点：1、酶易失活；2、具有很高的催化效率；3、具有高度专一性；4、酶活性受到调节和控制。2.何谓酶的专一性？酶的专一性有哪些？如何解释酶作用的专一性？研究酶的专一性有何意义？答：酶的专一性是指酶对催化的反应和反映物有严格的选择性。酶的专一性分为两种类型：1、结构专一性，包括绝对专一性、相对专一性（族专一性或基团专一性、键专一性）；2、立体异构专一性，包括旋光异构专一性、几何异构专一性。通过对酶结构与功能的研究，确信酶与底物作用的专一性是由于酶与底物分子的结构互补，诱导契合，通过分子的相互识别而产生的。对酶的专一性研究具有重要的生物学意义。它有利于阐明生物体内有序的代谢过程，酶的作用机制等。3.酶的活性受那些因素调节，试说明之。答：酶的调节和控制有多种方式，主要有：（1）      调节酶的浓度：主要有2种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解；（2）      通过激素调节酶活性、激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性；（3）      反馈抑制调节酶活性：许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质合成的第一步的酶，往往被他们终端产物抑制；（4）      抑制剂和激活剂对酶活性的调节：酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响酶活性；（5）      其他调节方式：通过别构酶、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。４.辅基和辅酶有何不同？在酶催化反应种起什么作用？答：辅酶通常指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质。通过透析方法可以除去，如辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等。辅基是以共价键和脱辅酶结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉，丙酮氧化酶中的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）都属于辅基。它们的区别只在于它们与脱辅酶结合的牢固程度不同。辅酶、辅基在酶催化反应中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。５.酶分哪几大类？举例说明酶的国际系统命名法及酶的编号。答：国际酶学委员会根据酶所催化反应的类型，把酶分为６大类：即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别利用1、2、3、4、5、6来表示。例如：1.1.3表示氧化还原酶，作用于CHOH基团，受体是分子氧。根据底物中别所用的基团或键的特点将每一大类分为若干亚类，每一个亚类又按顺序变成1、2、3……等数字；每一个亚基可再分亚亚类，仍用1、2、3……编号，每一个每的分类编号由4个数字组成，数字间由由“•”隔开。第一个数字指明该酶属于哪一个亚类；第三个数字指出该酶属于一个亚亚类；第四个数字则表明该酶在亚亚类中的排号。编号之间冠以EC（Enzyme Commision）。6.什么叫酶的活力和比活力？测定酶活力应注意什么？为什么测定酶活力时以测定初速率为宜，并且底物浓度远远大于酶浓度？答：酶活力指酶催化某一化学反应的能力，其大小可用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示；酶的比活力代表酶的纯度，根据国际酶学委员会的规定比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。酶的催化作用受测定环境的影响，因此测定酶活力要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲离子强度等。只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力的大小。随时间的延长，酶促反应中底物浓度降低，产物浓度增加，加速逆反应的进行，产物对酶抑制或激活作用以及随时间的延长引起酶本身部分分子失活等，酶促反应速率降低，因此测定活力，应测定酶促反应的初速率，从而避免上述种种复杂因素对反应速率的影响。底物浓度太低时，5%以下的底物浓度变化实验上不易测准，所以在测定酶的活力时，往往使第五浓度足够大，这样整个酶反应对底物来说是零级反应，而对酶来说却是以及反应，这样测得的速率就比较可靠地反映酶的含量。7.什么叫核酶和抗体酶？它们的发现有什么重要意义？答：具有催化功能的RNA叫核酶。它的发现，表明RNA是一种既能携带遗传信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白质和DNA，是生命起源中首先出现的生物大分子，而一些有酶活性的内含子可能是生物进化过程中残存的分子“化石”。酶RNA的发现，提出了生物大分子和生命起源的新概念，无疑促进对生物进化和生命起源的研究。抗体酶是20实际80年代后期才出现的一种具有催化能力的蛋白质，其本质上是免疫球蛋白，但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又称“催化性抗体”，抗体酶的发现，不仅为酶的过渡态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。8.解释下列名词：（1）      生物酶工程：酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。（2）      固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的、但仍具有酶活性的状态。（3）      活化能：在一定温度下1mol底物全部进入活化状态所需要的自由能（kj/mol）（4）      酶的转化数：在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。（5）      寡聚酶：由两个以上亚基组成的酶。（6）      Kat单位：在最适条件下，酶秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，为Kat单位。（7）      酶偶联分析法：由于分光光度法有其独特的优点，因此把一些远类没有光吸收变化的酶反应，可以通过与一些能引起光吸收变化的酶反映偶联使第一个酶反映的产物转变成第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。（8）      诱导契合说：1958年Koshland提出，当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构想发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。（9）      反馈抑制：许多小分子物质的合成是由一联串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往往被它们终端产物抑制。这种抑制叫反馈抑制。（10）      多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。9.用AgNO3对在10ml含有1.0mg/ml蛋白质的纯酶溶液进行全抑制，需用0.342μmolAgNO3，求该酶的最低相对分子质量。10.1μg纯酶（Mr:92×103）在最适条件下，催化反应速率为0.5μmol/min，试计算：（1）酶的比活力。[500U/mg]（2）转换数。[766.7s-1]解：（1）比活力=0.5μmol/min/1μg=500U/mg  （2）转换数=0.5/60×1÷（1×10-6/92×103×106）=766.7s-111.1g鲜重的肌肉含有40单位的某种酶，其转换数为6×104min-1，试计算该酶在细胞内浓度（假设新鲜组织含水80%，并且全部在细胞内）。[8.33×10-7mol/L]解：1/6×104×40÷（1×80%×103）=[8.33×10-7 mol/L12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相对分子质量为120×103，由6个相同亚基组成。纯酶的Vmax为2800U/mg酶。它的一个活力单位规定为：在标准测定条件下，37℃、15min内水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。问：（1）酶mg酶在每秒钟内水解多少mol底物？[3.11×10-5mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假设每个亚基上有一个活性部位）？[5×10-8mol活性中心]。（3）酶的转换数是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s•mol）酶活性中心]解：（1）2800×10/15×1/（60×106）×1=3.11×10-5mol  （2）1×10-3/120×103×6=5×10-8mol  （3）3.11×10-5÷1×10-3/120×103×1/6=62213.称取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白质为0.2mg，若以每分钟产生1μg酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白质量及活力单位。[0.625mg蛋白质，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白质]（3）1g酶制剂的总蛋白含量及总活力。[0.625g，2.5×105U]解：（1）0.2×6.25÷（2×25/25）=0.625mg      1500/60÷（0.1×25/25）=250U  （2）250÷0.625=400U/mg  （3）0.625÷（1×25/25）×1×103=0.625×103mg=0.625g      1500/60÷（0.1×25/25）÷（1×25/25）×103=2.5×105U14.有1g淀粉酶酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取出1ml测定淀粉酶活力，测知每5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂所含淀粉酶活力单位数？[3000U]（淀粉酶活力单位定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量称为1个活力单位）解：0.25/5×60÷（1/1000×1）=3000U15.某酶的初提取液经过一次纯化后，竟测定得到下列数据：试计算比活力、百分产量及纯化倍数。[比活力：180U/mg蛋白质，百分产量：17%，纯化倍数：9倍]          体积/ml      活力单位/（U/ml）      蛋白质/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4盐析            1205      200810      104解：（1）810/4.5=180U/mg  （2）810×5÷（200×120）×100%=17%   （3）180÷（200/10）=9第九章  酶促反应动力学提要酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率各种因素的科学。它是以化学动力学为基础讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。化学动力学中在研究化学反应速率与反应无浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应及零级反应。研究证明，酶催化过正的第一步是生成酶-底物中间产物，Michaelis-Menten该呢举中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一个特征常数，以浓度为单位，Km有多种用途，通过直线作图法可以得到Km及Vmax。Kcat称为催化常数，又叫做转换数（TN值），它的单位为s-1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数。酶促反应除了单底物反应外，最常见的为双底物反应，按其动力学机制分为序列反应和乒乓反应，用动力学直线作图法可以区分。酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制3类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数Kˊm变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，Vˊmax变小；反竞争性抑制Kˊm及Vˊ max均变小。通过动力学作图可以区分这3种类型的可逆抑制作用。可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制，过度态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。研究酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。温度、pH及激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度及最适pH，要选择合适的激活剂。在研究酶促反应速率及测定酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。习题1.当一酶促反应进行的速率为Vmax的80%时，在Km和[S]之间有何关系？[Km=0.25[S]]解：根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：0.8Vmax=Vmax[S]/(Km+[S])Km=0.25[S]2.过氧化氢酶的Km值为2.5×10-2mol/L，当底物过氧化氢浓度为100mol/L时，求在此浓度下，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数。[80%]解：fES=[S]/（Km+[S]）=100×10-3/(2.5×10-2+100×10-3)=80%3.由酶反应S→P测得如下数据：[S]/molL-1      V/nmolL-1min-16.25×10-6      15.07.50×10-5      56.251.00×10-4      60.01.00×10-3      74.91.00×10-2      75.0（1）      计算Km及Vmax。[Km：2.5×10-5，Vmax：75nmolL-1min-1]（2）      当[S]=5×10-5mol/L时，酶催化反应的速率是多少？[50.0nmolL-1min-1]（3）      若[S]=5×10-5mol/L时，酶的浓度增加一倍，此时V是多少？[100nmolL-1min-1]（4）      表中的V是根据保温10min产物生成量计算出来的，证明V是真正的初速率。解：（1）由米氏方程得：15=Vmax•6.25×10-6/(Km+6.25×10-6)……①    60=Vmax•10-4/（Km+10-4）……②由①、②得：Km=2.5×10-5，Vmax=75nmolL-1min-1（2）V=75×5×10-5/（2.5×10-5+5×10-5）=50.0nmolL-1min-1（3）50×2=100nmolL-1min-1（4）带如米氏方程可验证。5.某酶的Km为4.7×10-5molL-1，Vmax为22μmolL-1min-1，底物浓度为2×10-4molL-1。试计算：（1）竞争性抑制剂，（2）非竞争性抑制剂，（3）反竞争性抑制剂的浓度均为5×10-4molL-1时的酶催化反映速率？这3中情况的Ki值都是3×10-4molL-1，（4）上述3种情况下，抑制百分数是多少？[（1）13.54μmolL-1min-1，24%；（2）6.68μmolL-1min-1，62.5%；（3）7.57μmolL-1min-1，57.5%]解：（1）竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])代入数据得：V=13.54μmolL-1min-1i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=24%（2）非竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))代入数据得：V=6.68μmolL-1min-1i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=62.5%（3）反竞争性抑制剂的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki))代入数据得：V=7.57μmolL-1min-1i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=57.5%6．今制得酶浓度相同、底物浓度不同的几个反应混合液，并测得反应初速率，数据见下表。请利用“Eadie-Hofstee”方程式，用图解法求出Km值及Vmax值。这种作图法与Lineweaver-Burk作图法比较有何优点？[Vmax=160μmolL-1min-1,Km=8.0×10-5molL-1][S]/molL-1      V/μmolL-1min-14.0×10-4      1302.0×10-4       1101.0×10-4      895.0×10-5      624.0×10-5      532.5×10-5      382.0×10-5      32解：将米氏方程改写成：V=Vmax-Km•V/[S],以V-V/[S]作图，得一直线，其纵截距为Vmax，斜率为-Km，由图得Vmax=160μmolL-1min-1,Km=8.0×10-5molL-1优点：实验点相对集中于直线上，Km和Vmax测定值较准确。7.对一个遵从米氏方程的酶来说，当底物浓度[S]=Km，竞争抑制剂浓度[I]=Ki时，反应的初速率是多少？[V=1/3Vmax]解：根据米氏方程可得：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=KiV=VmaxKm/(Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3Vmax8.用下列表中数据确定此酶促反应：（1）无抑制剂和有抑制剂的Vmax和Km值。[无抑制剂时Km=1.1×10-5molL-1，Vmax=50μmolL-1min-1，有抑制剂时：Km=3.1×10-5molL-1，Vmax=50μmolL-1min-1]（2）EI复合物的解理常数Ki。[Ki=1.10×10-3molL-1][S]/molL-1      V/μmolL-1min-1      无抑制剂      有抑制剂（2.0×10-3molL-1）0.3×10-5      10.414.522.533.840.5      4.16.411.522.633.80.5×10-5          1.0×10-5          3.0×10-5          9.0×10-5          解：（1）无抑制剂时：V=Vmax[S]/(Km+[S])，将表中数据代入此式可得Km=1.1×10-5molL-1，Vmax=45.1μmolL-1min-1  对表中数据用V对[S]作图，求Km值，可判断有抑制剂时，Km值明显增大，故该抑制剂应为竞争性抑制剂。据V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不变的性质可得，此时Vmax=45.1μmolL-1min-1，Km=3.1×10-5molL-1，Ki=1.10×10-3molL-19．同上。10.从速率对底物浓度作图9-31中，求出下列参数（反应混合物中酶量为10-3μmol）。（1）Km；（2）Vmax；（3）kcat/Km；(4)转换数。[Km:5×10-4molL-1；Vmax:6μmolL-1min-1；kcat/Km: 2×105mol-1Ls-1；转换数:100s-1]解：Vmax=kcat•[Et]=k3•[E]=k3•[ES]11.下面的叙述哪一个是正确的？胰凝乳蛋白酶的转换数100s-1，DNA聚合酶是15s-1。（1）      胰凝乳蛋白酶结合第五比DNA聚合酶有更高的亲和性。（2）      胰凝乳蛋白酶反映速率比DNA聚合酶反映速率更大。（3）      在特别的酶浓度和饱和底物水平下胰凝乳蛋白酶反应速率比DNA聚合酶在相同条件下更低。（4）      在饱和底物水平下，两种酶的反应速率，假若DNA聚合酶反应速率的6.7倍则与胰凝乳蛋白酶相等。12.今有一酶反应，它符合Michaelis-Menten动力学，其Km为1×10-6molL-1。底物浓度为0.1molL-1时，反应初速度为0.1μmolL-1min-1。试问：底物浓度分别为10-2molL-1、10-3molL-1和10-6molL-1时的反应初速率是多少？[1×10-7molL-1min-1，5×10-8molL-1min-1]解：∵Km=1×10-6molL-1《[S]=0.1molL-1∴V=Vmax=0.1μmolL-1min-1将题中数据代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：设[S]=xKmV=Vmax•xKm/((x+1)Km)=x/(x+1)•Vmax=1/(1+1/x)•VmaxV1=0.1  V2=0.09998  V3=1/2•Vmax=0.0513．假设2×10-4molL-1的[I]抑制了一个酶催化反应的75%，计算这个非竞争性抑制剂的Ki？[6.66×10-5molL-1]解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75%  Vi/Vo=1/4→Vo=4Vi……①再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入非竞争性抑制剂时：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))……③，此时Vmax变小，Km不变。由①②③得：Ki=2×10-4/（4•Vˊmax/Vmax-1）  Vˊmax=VmaxKi=6.66×10-5molL-114.如果Km为2.9×10-4molL-1。Ki为2×10-5mol/L。在底物浓度为1.5×10-3mol/L时，要得到75%的抑制，需竞争性抑制剂的浓度是多少？[3.7×10-4mol/L]解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75%  Vi/Vo=1/4→Vo=4Vi……①再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入竞争性抑制剂时：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki)+[S])……③，此时Vmax变小，Km不变。由①②③得：[I]=4KmKi/Kˊm-Ki+3[S][Ki]/Kˊm加入抑制剂时，Km=Kˊm  ∴[I]= 3.7×10-4mol/L15.举例说明什么是Ks型和kcat型不可逆抑制剂。什么是过度态底物类似物？它属于何种类型抑制剂？答：Ks型抑制剂根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还代有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶。因其专一性取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks比值，故这类抑制剂称不可逆Ks抑制剂。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一个带正电荷的侧链，如Lys、Arg侧链。对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶活性部位必需集团His57共价结合，引起不可逆失活。Kcat型不可逆抑制剂具有天然底物的类似结构，其本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化。但抑制剂还有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反映基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，其专一性极高。例如β-卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶（AR）的不可逆抑制剂，属于磷酸吡哆醛类的自杀性底物。过渡态底物类似物是化学结构类似过渡态底物（底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式）的抑制剂，属于竞争性抑制剂，如嘌呤腺苷水合形成是小牛脱氨酶反应过渡类似物。第十章  酶的作用机制和酶的调节提要酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部位，对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。酶活性部位有6个共同特点。研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法，动力学参数测定法，X射线晶体结构分析法和定点诱变法，这些方法可互相配合以判断某个酶的活性部位。酶是催化效率很高的生物催化剂，这是由酶分子的特殊结构所决定的。经研究与酶催化效率的有关因素有7个，即底物和酶的邻近效应与定向效应，底物的形变与诱导契合，酸碱催化，共价催化，金属离子催化，多元催化和协同效应，活性部位微环境的影响。但这些因素不是同时在一个酶中其作用，也不是一种因素在所有的酶中起作用，对于某一种酶来说，可能分别主要受一种或几种因素的影响。研究酶催化的反应机制，始终是酶学研究的一个重点，通过大量的研究工作，已经对一些酶的作用机制有深入了解，该章对溶解酶、胰核糖核酸酶A、羧肽酶A、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等的催化作用机制进行了详尽的讨论。酶活性是受各种因素调节控制的，除了在第8章中已介绍的几种因素外，主要还有①别构调节，例如ATCase。②酶原的激活，如消化系统蛋白酶原的激活及凝血系统酶原的激活。③可逆共价修饰调控，如蛋白质的磷酸化，一系列蛋白激酶的作用。通过以上作用，使酶能在准确的时间和正确的地点表现出它们的活性。别构酶一般都是寡聚酶，有催化部位和调节部位，别构酶往往催化多酶体系的第一步反应，受反应序列的终产物抑制，终产物与别构酶的调节部位相结合，由此调节多酶体系的反应速率。别构酶有协同效应，[S]对υ的动力学曲线呈S形曲线（正协同）或表现双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。ATCase作为别构酶的典型代表，已经测定了其三维结构，详细研究了别构机制和催化作用机制。为了解释别构酶协同效应的机制，有两种分子模型受到人们重视，即协同模型和序变模型。酶原经过蛋白水解酶专一作用释放出肽段，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成有活性的酶，这个活化过程，是生物体的一种调控机制。可逆地共价修饰调控作用是通过共价调节酶进行的，通过其他酶对其多肽链某些基团进行可逆地共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。共价修饰的基团主要是磷酸化、腺苷酰化、尿苷酰化及ADP-核糖基化等。同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面不同的一组酶。同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学及医学研究中占有重要地位。LDH同工酶研究的比较清楚，是由良种不同亚基组成的四聚体，有5种同工酶，在不同组织中含量不同，反映了同工酶的组织特异性。习题1.阐明酶活性部位的概念。可使用那些主要方法研究酶的活性部位？答：酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部分；对于需要辅酶的灭来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法、动力学参数测定法、X射线晶体结构分析法和定点诱变法。2.简要阐明胰RnaseA的活性部位如何确定？答：用化学修饰法研究RnaseA活性的必须氨基酸残基。在pH5.5下，用等摩尔碘乙酸处理RnaseA，羧甲基化的His119是主要产物，而羧甲基化的His12产物较少。RnaseA中其他组氨酸对这个试剂的反应弱得多。所得RnaseA的两个羧甲基化的衍生物均无活性，因此可推测His119和His12为酶活性的必需集团。2，4二硝基氨苯可选择地同酶Lysε-NH2反应，酶引起失活。该结果表明Lys41也是酶活性部位的必需氨基酸。以上研究结果可认为His119、His12、Lys41构成了RnaseA的活性部位。3.与酶催化效应有关的因素有哪些？它们是怎样提高反应速率的？答：与酶催化速率有关的因素有7个：1.       底物和酶的邻近效应与定向效应：酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变成分子内反应的过程。在这一过程中包括两种效应、邻近效应和定向效应。邻近效应是指酶与第五结合形成中间复合物以后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。2.      底物的形变和诱导契合：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。3.      酸碱催化：通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。4.      共价催化（亲核催化或亲电子催化）：在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或吸取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。5.      金属离子催化：金属离子以3种主要途径参加催化过程：（1）通过结合底物位反应定向；（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷，作用比质子强，不少金属离子有络合作用，并且在中性pH溶液中，H+浓度很低，但金属离子却容易维持一定浓度。金属离子通过电荷的屏蔽促进反应。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。6.      多元催化和协同效应：酶催化反应中常常几个基元催化反应配合在一起共同起作用，加速酶反应。7.       活性部位微环境的影响：在酶分子的表面有一个裂缝，而活性部位就位于疏水环境的裂缝中，大大有利于酶的催化作用。4.推测下列寡聚糖被溶菌酶水解的相对速率：（G：N-乙酰氨基葡萄；M：N-乙酰氨基葡萄乳酸）（1）M-M-M-M-M-M；（2）G-M-G-M-G-M；（3）M-G-M-G-M-G5.假设在合成（NAG）时D和E糖残基之间的糖苷氧已为18O所标记，当溶菌酶水解时，18O将出现在哪个产物中？答：18O将出现在由A、B、C、D残基组成的四聚体中。6.请比较溶菌酶、羧肽酶A、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶：（1）哪一种酶的催化活性需要金属离子？（2）哪种酶只含一条多肽链？（3）哪种酶被DFP迅速地失活？（4）哪种酶是由酶原激活成的？答：（1）羧肽酶A；（2）溶菌酶；（3）胰凝乳蛋白酶；（4）羧肽酶A、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。7.上题4种酶的催化机制中是否有从酶到底物的质子转移过程？若有请指出它们的质子供体是什么？答：溶菌酶中的Glu35的-COOH提供一个H+；羧肽酶A中的Glu270的-COOH提供一个H+；胃蛋白酶中的Asp32的-COOH提供一个H+；胰凝乳蛋白酶中Ser195提供一个H+。8.TPCK是胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂，它对His57烷基化后使胰凝乳蛋白酶失活。（1）为胰蛋白酶设计一个像TPCK那样的亲和标记试剂。（2）你认为怎样可以检验它的专一性？（3）能被胰蛋白酶的这个亲和标记试剂失去活性的还有哪个丝氨酸蛋白酶？9.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？答：相似之处：①执行相同的反应——裂解肽键；②其结构和作用机制很相似；③相对分子质量范围在2.5×103，并且具有相似的顺序和三级结构；④3个极性残基——His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三联体。不同之处：①专一性不同：胰蛋白酶裂解碱性氨基酸Arg和Lys羧基侧链肽；胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香氨基酸如Phe和Tyr羰基侧链；弹性蛋白主要裂解小的中性氨基酸残基羰基侧链肽；②酶活性部位不同：胰蛋白酶口袋中，有一个负电荷Asp189在底部，有利于结合正电荷Arg和Lys残基；胰凝乳蛋白酶口袋被疏水氨基酸环绕，大的足以容纳一个芳香残基；弹性蛋白口袋浅，开口处具有大的Thr和Val残基，仅小的，部大的残基能够容纳在它的口袋中。10.ATCase是一种别构酶，其活性部位与别构效应物结合部位分别处于不同亚基之上，有可能设想别构酶上这两种部位存在于同一亚基上吗？为什么？11.对于ATCase来说，琥珀酸起着Asp（两个底物中的一个）的竞争抑制作用。υ对[Asp]的依赖关系见图10-71A（假设这些实验中第二种底物是过量的并可忽略）。在图10-71B种[Asp]维持在低水平（图10-71A种箭头所指处）不变，并加入一系列含量递增的琥珀酸。琥珀酸不能作为底物参与反应。请解释这些结果。答：（图略）琥珀酸的结合导致协同由T型向R型转变。12.试解释为什么胰凝乳蛋白不能像胰蛋白酶那样自我激活？13.羧肽酶A促使底物的水解，下面哪个是其重要的机制：（1）结构重排将必需氨基酸残基靠近敏感键。（2）形成一个C端环肽的共价中间物。（3）活性部位Try残基脱质子形成亲核作用。（4）通过结合Zn2+的活化水。14.左边裂处的每一种酶，按照提出的催化机制，从右边选择出它们适当的过渡态或化学本质。（1）溶菌酶——（4）（1）Zn2+的活化水（2）RNA酶——（3）（3）羧肽酶A——（1）（4）胰凝乳蛋白酶（2）（5）（2）氧阴离子（3）五价磷（4）碳正离子（5）胃蛋白酶——（6）（5）四面体肽键（6）天冬氨酸——活化水15.对蛋白酶A的叙述中哪一个是正确的？（1）       通过ATP活化。——（×）（2）      在没有激活剂时有2个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成。——（×）（3）      激活剂结合后解离成一个C2和2个R亚基。——（×）（4）      在C亚基中含有一个假底物顺序。——（√）16.苯甲脒（Ki=1.8×10-5mol/L）和亮抑蛋白酶肽（LeupeptinKi=3.8×10-7mol/L）是胰蛋白酶的两种特异竞争性抑制剂，试解释它们的抑制机制。设计亮抑蛋白酶肽的类似物抑制胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。第十一章  维生素与辅酶提要维生素是维持生物体正常生长发育和代谢所必需的异类微量有机物质，不能由机体合成，或合成量不足，必须靠食物供给。由于维生素缺乏而引起的疾病称为维生素缺乏症。维生素都是小分子有机化合物，在结构上无共同性。通常根据其溶解性质分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。脂溶性维生素由维生素A、D、E、K等，水溶性维生素有维生素B1、B2、B6、B12、烟酸、烟酰胺、泛酸、生物素、叶酸、硫辛酸和维生素C等。现已知绝大多数维生素作为酶的辅酶或辅基的组成成分，在物质代谢中起重要作用。维生素A的活性形式是11-顺视磺醛，参与视紫红质的合成，与暗视觉有关。此外维生素A还参与糖蛋白的合成，在刺激组织生长分化中也起重要作用。维生素D为类淄醇衍生物，1，25-二羟维生素D3是其活性形式，用以调节钙磷代谢，促进新骨的生成与钙化。维生素E是体内最重要的抗氧化剂，可保护生物膜的结构和功能，维生素E还可促进血红素的合成。维生素K与肝脏合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ有关，作为谷氨酰羧化酶的辅助因子参与凝血因子前体转变活性凝血因子所必须的。除维生素C外，水溶性维生素主要为B族维生素，以辅酶和辅基的形式存在，参与物质代谢。硫胺素的辅酶形式为硫胺素焦磷酸（TPP），是α-酮酸脱羧酶、转酮酶及磷酸酮酶的辅酶，在α-裂解反应、α-缩合反应及α-酮转移反应中起重要作用。核黄素和烟酰胺是氧化还原酶类的重要辅酶，核黄素以FMN和FAD是形式作为黄素蛋白酶的辅基；而烟酰胺以NAD+和NADP+形式作为许多脱氢酶的辅酶，至少催化6种不同类型的反应。泛酸是构成CoA和ACP的成分，CoA起传递酰基的作用，是各种酰化反应的辅酶，而ACP与脂肪酸的合成关系密切。磷酸吡哆醛是氨基酸代谢种多种酶的辅酶，参加催化涉及氨基酸的转氨作用，α-和β-脱羧作用，β-和γ-消除作用，消旋作用和醛醇裂解反应。生物素是几种羧化酶的辅酶，包括乙酰CoA羧化酶和丙酮酸羧化酶，参与CO2的固定作用。维生素B12存在5ˊ -脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素两种活性形式。它们参与分子内重排、核苷酸还原成脱氧核苷酸及甲基转移反应。叶酸的辅酶是四氢叶酸（THF），进行一碳单位的传递，参与甲硫氨酸核核苷酸的合成。硫辛酸是一种酰基载体，作为丙酮酸脱氢酶核α-酮戊二酸脱氢酶的辅酶参与糖代谢。抗坏血栓是一种水溶性抗氧化剂，参与体内羟化反应、氧化还原反应，有解毒和提高免疫力的作用。某些金属离子作为微量元素构成一些酶的必需成分参与酶的催化反应，有的金属离子作为酶的辅基构成金属酶类，有的作为酶的激活剂成为金属激活酶类。发现最多的是铁金属酶类、铜金属酶类和锌金属酶类。习题1.例举水溶性维生素与辅酶的关系及其主要生物学功能。答：水溶性维生素包括维生素B族、硫辛酸和维生素C。维生素B族的主要维生素有维生素B1、B2、PP、B6、泛酸、生物素、叶酸及B12等。维生素B族在生物体内通过构成辅酶而发挥对物质代谢的影响。这类辅酶在肝脏内含量最丰富，体内不能多储存，多余的自尿中排出。维生素B1在生物体内常以硫胺素焦磷酸（TPP）的辅酶形式存在，与糖代谢密切，可抑制胆碱脂酶活性。维生素PP包括烟酸和烟酰胺，在体内烟酰胺与核糖、磷酸、腺嘌呤组成脱氢酶的辅酶，烟酰胺的辅酶是电子载体，在各种酶促氧化-还原过程中起着重要作用。维生素B2有氧化型和还原型两种形式，在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用，以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形式存在，是生物体内一些氧化还原酶（黄素蛋白）的辅基。泛酸是辅酶A和磷酸泛酰巯基乙胺的组成成分，辅酶A主要起传递酰基的作用。维生素B6包括3中物质：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺；在体内以磷酸脂形式存在。维生素B12在体内转变成2种辅酶形式，参与3种类型的反应：①分子内重排；②核苷酸还原成脱氧核苷酸；③甲基转移。生物素在种种酶促羧化反应中作为活动羧基载体。叶酸除了CO2外，是所有氧化水平碳原子一碳单位的重要受体和供体。四氢叶酸是叶酸的活性辅酶形式。硫辛酸常不游离存在，而同酶分子中赖氨酸残基的ε-NH2以酰胺键共价结合，是一种酰基载体。维生素C具有机酸性质，有防治坏血病功能。2.对下列每一个酶促反应，写出参与反应的辅酶。解：略3.为谷氨酸变位酶反应选择一种适宜的辅酶并写出一个正确的机制：[化学方程式略]解：该反应适宜的辅酶可为5ˊ-脱氧腺苷钴胺素，重排机制：Co-碳键裂解，钴还原成Co2+状态，产生一个-CH2基，从底物吸取氢原子形成5ˊ-脱氧腺苷，并脱离底物上的基团（未成电子对），该中间物重排，-CH2-从一个碳原子移动到另一个碳原子，随后氢原子从5ˊ-脱氧腺苷是甲基转移，5ˊ-脱氧腺苷钴胺素重生。T4、T5、T6与T3同类，略。7.蛋清可防止蛋黄的腐败，将鸡蛋贮存在冰箱4-6周不腐败。而分离的蛋黄（没有蛋清）甚至在冷冻下也迅速腐败。（1）      腐败是什么引起的？（2）      你如何解释观察到的蛋清存在下防止蛋黄腐败？答：与生物素有关。8.肾营养不良（renal osleodystrophy）也叫肾软骨病，是和骨的广泛脱矿物质作用相联系的一种疾病，常发生在肾损伤的病人中。什么维生素涉及到肾的矿质化？为什么肾损伤引起脱矿物质作用？答：1，25-二羟维生素D3能诱导钙结合蛋白（CaBP）的合成和促进Ca-ATP酶的活性，这都有利于Ca2+的吸收。它也能促进磷的吸收；促进钙盐的更新及新骨的生成；促进肾小管细胞对钙磷的重吸收，减少从尿中排出。1，25-二羟维生素D3的主要耙细胞是小肠粘膜、骨骼和肾小管，肾损伤将影响1，25-二羟维生素D3的作用，故会引起脱矿物质作用。9.一个临床病人由于代谢紊乱引起酸中毒，即低血和低尿pH。病人体液中化学分析显示分泌大量的甲基丙二酸。将这种化合物饲喂动物时，可以转变成琥珀酸。对于这一观察你能提供营养上的解释吗？10.四氢叶酸（THF）都以何种形式传递一碳单位？答：四氢叶酸（THF）传递一碳单位的形式有：N5-甲基-THF、N5，N10-亚甲基-THF、N5-甲酰基-THF、N10-甲酰基-THF、N5-亚胺甲基-THF、N5，N5-次甲基-THF。第十二章  核酸通论提要1868年Miescher发现DNA。Altmann继续Miescher的研究，于1889年建立从动物组织和酵母细胞制备不含蛋白质的核酸的方法。RNA的研究开始于19世纪末，Hammars于1894年证明酵母核酸中的糖是戊糖。核酸中的碱基大部分是由Kossel等所鉴定。Levene对核酸的化学结构以及核酸中糖的鉴定作出了重要贡献，但是他的“四核苷酸假说”是错误的，在相当长的时间内阻碍了核酸的研究。理论研究的重大发展往往首先从技术上的突破开始。20世纪40年代新的核酸研究技术证明DNA和RNA都是细胞重要组成成分，并且是特异的大分子。其时，Chargaff等揭示了DNA的碱基配对规律。最初是Astbury，随后Franklin和Wilkins用X射线衍射法研究DNA分子结构，得到清晰衍射图。Watson和Crick在此基础上于1953年提出DNA双螺旋结构模型，说明了基因结构、信息和功能三者之间的关系，奠定了分子生物学基础。DNA双螺旋结构模型得到广泛的实验支持。Crick于1958年提出了“中心法则”。DNA研究的成功带动了RNA研究出现一个新的GC。20世纪60年代Holley测定了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列；Nirenberg等被破译了遗传密码；阐明了3类DNA参与蛋白质生物合成的过程。在DNA重组技术带动下生物技术获得迅猛发展。将DNA充足技术用于改造生物机体的性状特征、改造基因、改造物种，统称之为基因工程或遗传工程。与此同时出现了各种生物工程。技术革命改变了分子生物学的面貌，并推动了生物技术产业的兴起。在此背景下，RNA研究出现了第二个GC，发现了一系列新的功能RNA，冲击了传统的观点。人类基因组计划是生物学有史以来最伟大的科学工程。这一计划准备用15年时间（1990-2005年），投资30亿美元，完成人类单倍体基因组DNA3×109bp全部序列的测定。它首先在美国启动，并得到国际科学界的高度重视，英国、日本、法国、德国和中国科学家先后加入了这项国际合作计划。由于测序技术的改进，人类基因组计划被大大提前完成，生命科学进入了后基因时代，研究重点已从测序转向对基因组功能的研究。功能基因组学需要从基因产物的结构研究入手，因此产生了结构基因组学。为研究蛋白质组和DNA组，产生了蛋白质组学和RNA组学。生物化学与分子生物学已成为自然科学中最活跃，发展最快的学科之一。DNA是主要的遗传物质，分布在原核细胞的核区，真核细胞的核核细胞器以及许多病毒中也含DNA。DNA通常是双链分子。原核细胞的染色体DNA、质粒DNA、真核细胞的细胞器DNA以及某些病毒DNA都是环状双链分子。真核细胞染色体DNA以及某些病毒DNA是线型双链分子。病毒DNA还有环状单链和线型单链的分子。细胞RNA通常都是线型单链分子，单病毒RNA有双链、单链、环状、线型多种形式。生物机体通过DNA复制而将遗传信息由亲代传递给子代；通过RNA转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。DNA具有基因的所有属性，基因也就是DNA的一个片段。基因的功能最终需由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。参与蛋白质合成的DNA有三类：rRNA器装配和催化作用；tRNA携带氨基酸并识别密码子；mRNA携带DNA的遗传信息并作为蛋白质合成的模板。除参与蛋白质合成外，RNA还有多种功能，几乎涉及细胞功能的所有方面，归根结底与遗传信息的表达和表达调控有关。习题1.核酸是如何被发现的？为什么早期核酸研究的进展比蛋白质研究缓慢？答：1868年瑞士青年科学家F.Mescher由脓细胞分离得到细胞核，并从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物，称为核素。核酸中的碱基大部分由Kossel等所鉴定。1910年因其在核酸化学研究中的成就授予他诺贝尔医学奖，但他却认为决定染色体功能的是蛋白质，以后转而研究染色体蛋白质。Levene对核酸的化学结构以及核酸中糖的鉴定作出了重要贡献，但是他的“四核苷酸假说”认为核苷酸中含等量4种核苷酸，这4种核苷酸组成结构单位，核酸是由四核苷酸单位聚合而成。照这一假说，核酸只是一种简单的高聚物，从而使生物学家失去对它的关注，严重阻碍核酸的研究。当时还流行一种错误的看法，认为胸腺核苷酸代表动物核苷酸，酵母核苷酸代表植物核苷酸，这种观点也不利于对核酸生物功能的认识。2.Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的背景和依据是什么？答：背景：20世纪上半叶，数理学科进一步渗入生物学，生物化学本身是一门交叉学科，也就成为数理学科与生物学之间的桥梁。数理学科的渗入不仅带来了新的理论和思想方法，而且引入了许多新的技术和实验方法。依据：已知核酸的化学结构知识；E.Chargaff发现的DNA碱基组成规律；M.Wilkins和R.Franklin得到的DNA X射线衍射结果。此外，W.T.Astbury对DNA衍射图的研究以及L.Pauling提出蛋白质的α-螺旋结构也都有启发作用。2．为什么科学界将Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型评为20世纪自然科学最伟大的成就之一？答：因为DNA双螺旋结构模型的建立说明了基因的结构、信息和功能三者之间的关系，使当时分子生物学先驱者形成的三个学派（结构学派、信息学派和生化遗传学派）得到统一，并推动了分子生物学的迅猛发展。4.什么是DNA重组技术？为什么说它的兴起导致了分子生物学的第二次革命？答：DNA重组技术——在细胞体外将两个DN**段连接成一个DNA分子的技术。在适宜的条件下，一个重组DNA分子能够被引入宿主细胞并在其中大量繁殖。DNA重组技术极大推动了DNA和RNA的研究，改变了分子生物学的面貌，并导致了一个新的生物技术产业群的兴起，所以被认为是分子生物学的第二次革命/5．人类基因组计划是怎样提出来的？它有何重大意义？答：1986年，著名生物学家、诺贝尔奖获得者H.Dubecco在Sience杂志上率先提出“人类基因组计划”，经过了3年激烈争论，1990年10月美国政府决定出资30亿美元，用15年时间（1990-2005年）完成“基因组计划”。重大意义：人类对自己遗传信息的认识将有益于人类健康、医疗、制药、人口、环境等诸多方面，并且对生命科学也将有极大贡献。6．为什么说生命科学已进入后基因时代？它的意思是什么？答：由于技术上的突破，“人类基因组计划”进度一再提前，全序列的测定现已进入后基因组时代。意思：科学家的研究重心已从揭示基因组DNA的序列转移到在整体水平上对基因组功能的研究。7.核酸可分为哪几种类？它们是如何分布的？答：核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。原核细胞中DNA集中在核区，其核细胞DNA分布在核内，病毒只含DNA或只含RNA，RNA存在于原核生物、真核生物或部分RNA病毒中。8.如何证明DNA是遗传物质？答：用35S和32P标记的噬菌体T2感染大肠杆菌，结果发现只有32P标记的DNA进入大肠杆菌细胞内，而35S标记的蛋白质仍留在细胞外，由此证明：噬菌体DNA携带了噬菌体的全部遗传信息，DNA是遗传物质。9.参与蛋白质合成的三类RNA分别起什么作用？答：rRNA起装配和催化作用；tRNA携带氨基酸并识别密码子；mRNA携带DNA的遗传信息并作为蛋白质合成的模板。10.如何看待RNA功能的多样性？它的核心作用是什么？答：RNA有5类功能：①控制蛋白质合成；②作用于RNA转录后加工与修饰；③基因表达与细胞功能的调节；④生物催化与其他细胞持家功能；⑤ 遗传信息的加工与进化。核心功能是：遗传信息由DNA到蛋白质的中间传递体。第十三章  核酸的结构提要核酸分两大类：DNA和RNA。所有生物细胞都含有这两类核酸。但病毒则不同，DNA病毒只含DNA；RNA病毒只含RNA。核酸的研究是生物化学与分子生物学研究的重要领域。核酸是一种多聚核苷酸，其基本结构单位是核苷酸。DNA主要由四种脱氧核糖核苷酸组成。RNA主要由四种核糖核苷酸组成。核苷酸又由含氮碱基、戊糖（核糖或脱氧核糖）及磷酸组成。核酸中还有少量稀有碱基。核酸的共价结构也就是核酸的一级结构，通常是指具核苷酸序列。利用磷酸二酯酶从RNA分子的两端逐个水解下核苷酸，得到3ˊ核苷酸和5ˊ核苷酸，证明RNA分子中核苷酸之间的连键为3ˊ，5ˊ-磷酸二酯键。DNA无2ˊOH基，它的核苷酸连键只能是3ˊ→5ˊ走向。原核生物基因序列是连续的，常组成操纵子，很少重复序列。真核生物基因序列是断裂的，不组成操纵子，含有较高比例的重复序列。RNA有各种类型，常含有修饰核苷，tRNA含有较多修饰碱基，rRNA含有较多甲基化的核糖，两者均含有假尿嘧啶核苷。真核生物mRNA5ˊ端有甲基化鸟嘌呤核苷酸形成的帽子；3ˊ端有poly（A）尾巴。DNA的空间结构模型是在1953年由Watson核Crick两人提出的。建立DNA空间结构模型的根据有三方面。一是一直核酸的化学结构。二是DNA碱基组成的分析资料，Chargaff首先发现A-T，G-C之间相等的规律。三是DNA纤维的X射线衍射分析资料，提示了双螺旋结构的可能性。按照Watson-Crick的模型，DNA是由两条反平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，碱基位于结构之内侧，磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二酯键相连，形成双螺旋分子的骨架。碱基平面与轴垂直，糖环平面则与轴平行。两条链皆为右手螺旋。双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核苷酸之间的夹角是36°，每一螺旋由10对碱基组成。碱基按A-T，G-C配对互补，彼此以 氢键相连系。维持DNA结构稳定的力量主要是氢键和碱基堆积力。双螺旋结构表面有两条螺形凹沟，一大一小。Watson-Crick所阐明的是B型DNA。此外还有A型DNA及左旋DNA（Z-DNA）。它们在结构上有明显不同。应用核酸晶体的X射线衍射分析技术研究发现，Watson-Crick模型需要作某些补充才能反映DNA结构的真实情况。DNA的二级结构主要是形成双螺旋。但在某些情况下也能形成三股螺旋。Hoogsteen最早发现寡聚嘌呤核苷酸-寡聚嘧啶核苷酸双螺旋的大沟可以结合第三条寡聚嘌呤或嘧啶核苷酸，形成Hoogsteen配对。H-DNA是通过分子内折叠形成的三股螺旋，它存在于基因调控区，因而有重要生物学意义。细胞内很多DNA是双链环状分子（cccDNA），一条链断裂可以形成开环分子（ocDNA），两条链断裂就成为线型分子（linearDNA）。DNA分子的两端如是固定的，或是环状分子，增加或减少螺旋圈数，可引起超螺旋。拓扑学的公式L=T+W可用以说明连环数（L）、扭转数（T）和缠绕数（W）之间的关系。比连环差（λ）=（L1-L0）/L0表示超螺旋的强度。DNA超螺旋是DNA三级结构的一种形式。DNA与蛋白质复合物的结构是其四级结构。病毒、细菌拟核核真核生物的染色体都存在DNA的组装核一定程度的压缩。核小体是真核生物染色质基本结构单位，它由8个组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）2核心核外绕1.8圈的DNA所组成。由核小体链形成纤丝，进而折叠、螺旋化，组装成不同层次结构的染色质核染色体。不同类型RNA分子可自身回折形成局部双螺旋，并折叠产生三级结构，RNA与蛋白质复合物则是四级结构。TRNA的二级结构呈三叶草形，三级结构为倒L形。RRNA组装成核糖体，其结构已获得解析。已知有8种类型的核酶，它们的催化功能与空间结构有密切关系。信号识别颗粒中的4.5SRNA具有催化SRP的Ffh蛋白与SRP受体FtsY可逆结合的功能。习题1.比较DNA和RNA在化学结构上、大分子结构上和生物学功能上的特点。答：DNA的一级结构中组成成分为脱氧核糖核苷酸，核苷酸残基的数目由几千至几千万个；而RNA的组成成分是核糖核苷酸，核苷酸数目仅有几十到几千个。另外在DNA分子中A=T，G=C,而在RNA分子中A≠U，G≠C。二者的相同点在于：它们都是以单核苷酸作为基本组成单位，核苷酸残基之间都是由3，5-磷酸二酯键连接的。二级结构：DNA是双链分子，2条链之间通过氢键和碱基完全配对（A-T，G-C）形成双螺旋的二级结构，一般是右手螺旋，也有左手螺旋。RNA是单链分子，分子内部的不同部位（有的近距离，也有远距离）能够通过碱基发生配对（A-U，G-C和G-U），形成既有单链，又有双链的RNA二级结构，RNA二级结构元件有：烃环（发夹）结构、内部环结构、分支环结构和中心环结构等。2.从已经揭示的人类基因组结构有何特点？3.原核生物与真核生物mRNA有何特点？答：原核生物以操纵子为转录单位，产生顺反子mRNA，即一条mRNA链上有多个编码区，5ˊ端和3ˊ端各有一段非翻译区（UTR）。原核生物mRNA，包括噬菌体RNA，都无修饰碱基。真核生物的mRNA都是单顺反子，5ˊ端有帽子（cap）结构，然后依次是5ˊ非编码区、编码区、3ˊ非编码区、3ˊ 端为聚腺苷酸（poly(A)）尾巴，其分子内有时还有极少甲基化的碱基。4.DNA双螺旋结构类型有那些基本要点？这些特点能解释哪些基本的生命现象？答：DNA双螺旋结构模型的基本要点有：（1）两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，两条链均为右手螺旋。（2）嘌呤与嘧啶位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过3’,5’-磷酸二酯键相连接，形成DNA分子的骨架，碱基平面与纵轴垂直，糖环平面则与纵轴平行。多核苷酸链的方向取决于核苷酸间磷酸二酯键的走向，习惯上以C3’-C5’为正向。两条链配对偏向一侧，形成一条大购和一条小沟。（3）双螺旋的平均直径为2nm，两个相邻的碱基对之间的高度，即碱基堆积距离为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为36°，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，每一转的高度（即螺距）为3.4nm。（4）两条核苷酸依靠彼此碱基之间形成的氢键相联系而结合在一起。（5）碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。但根据碱基配对原则，当一条多核苷酸链的序列彼此确定后，即可决定另一互补的序列。解释生命活动：双螺旋DNA是储存遗传信息的分子，通过半保留复制，储存遗传信息，通过转录和翻译表达出生命活动所需信息（蛋白质和酶）。5．应用DNA晶体X射线衍射技术分析DNA对Watson-Crik模型有何修正？比较A-DNA、B-DNA、Z-DNA的主要特点。答：（1）Watson-Crick模型认为每一螺周含有10个碱基对，所以两个核苷酸之间夹角是36°。但在Dickerson的十二聚体中，两个碱基间的夹角可由28°至42°不等，实际平均每一螺周含10.4个碱基对。分子大小的各参数也随序列不同而有变动。（2）Dikerson所研究的十二聚体结构中，组成碱基对的两个碱基分布并非在同一平面上，而是碱基对沿长轴旋转一定角度，从而使碱基对的形状像螺旋桨叶片的样子，故称螺旋桨状扭曲，这种结构可提高碱基堆积力，使DNA结构更稳定。A-DNA、B-DNA、Z-DNA的主要特点：      A型      B型      Z型外形      粗短      适中      细长螺旋方向      右手      右手      左手螺旋直径      2.55nm      2.37      1.84nm碱基轴升      0.23nm      0.34      0.38nm碱基夹角      32.7°      34.6°      60°(1)每圈碱基数      11      10.4      12螺距      2.53nm      3.54nm      4.56轴心与碱基对      不穿过碱基对      穿过碱基对      不穿过碱基对碱基倾角      19°      1°      9°糖环折叠      C3’内式      C2’内式      嘧啶C2’内式，嘌呤C3’内式糖苷键构象      反式      反式      嘧啶反式，嘌呤顺式大沟      很狭、很深      很宽、较深      平坦小沟      很宽、浅      狭、深      较狭、很深(1)注：Z-DNA的嘌呤河嘧啶核苷酸交替出现顺反式，故以二个核苷酸为单位，转角为60°6.如果人体有1014个细胞，每以细胞DNA含量为6.4×109bp，试计算一下人体DNA的总长度为多少米？它相当于地球到太阳的距离（2.2×109km）之几倍？[2.2×1014km，100倍]解：6.4×109bp×0.34nm×1014个=2.2×1014m=2.2×1011km   2.2×1014÷2.2×109km=100倍。7.何谓H-DNA？它有何生物学意义？答：当DNA的一段多聚嘧啶核苷酸或多聚嘧啶核苷酸组成镜像重复时，可折回产生H-DNA。由于这种结构形成分子内三螺旋时上册[/hide][/hide]'