GB4789.13-2012食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验.pdf 9页

'中华人民共和国国家标准GB4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB4789.13—2012前言本标准代替GB/T4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。本标准与GB/T4789.13—2003相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了样品制备过程；——修改了培养基与试剂；——修改了操作步骤；——修改了菌数计算部分；——增加了附录A。I GB4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验1范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；d）天平：感量0.1g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm×180mm；i）无菌培养皿：直径90mm；j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；k）厌氧培养装置。3培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。4检验程序1 GB4789.13—2012产气荚膜梭菌检验程序见图1。检样25g(mL)检样+225mL0.1%蛋白胨水均质、稀释-1-610～10稀释液各1mL+TSC琼脂混合厌氧培养，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落计数任选黑色菌落5个，分别接种FTG培养基确证试验镜检形态牛奶发酵动力-硝酸盐乳糖-明胶报告图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2以无菌操作称取25g（mL）样品放入含有225mL0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，作为1:10稀释液。-2-65.1.3以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10～10的系列稀释液。2 GB4789.13—20125.2培养5.2.1吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。5.2.2上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。5.2.3待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养20h～24h。5.2.4典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。5.3确证试验5.3.1从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h。5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36℃±1℃厌氧培养20h～24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h，用于后续的确证试验。5.3.3取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。5.3.4用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。6结果与报告6.1典型菌落计数选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。6.2结果计算6.1计数结果按公式（1）计算：3 GB4789.13—2012B(A)TC………………………………………………(1)(n0.1n)d12式中：T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；A——单个平板上典型菌落数；B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；C——单个平板上用于确证试验的菌落数；n1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；0.1——稀释系数；d——稀释因子（第一稀释度）。6.3报告根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中公式计算，报告每g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。4 GB4789.13—2012附录A培养基和试剂A.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂A.1.1基础成分胰胨15.0g大豆胨5.0g酵母粉5.0g焦亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁铵1.0g琼脂15.0g蒸馏水900.0mLpH7.6±0.2A.1.2D-环丝氨酸溶液溶解1gD-环丝氨酸于200mL蒸馏水，膜过滤除菌后，于4℃冷藏保存备用。A.1.3制法将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装到500mL烧瓶中，每瓶250mL，121℃高压灭菌15min，于50℃±1℃保温备用。临用前每250mL基础溶液中加入20mLD-环丝氨酸溶液，混匀，倾注平皿。A.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）A.2.1成分胰蛋白胨15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g蒸馏水1000.0mLpH7.1±0.2A.2.2制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节pH，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.3缓冲动力-硝酸盐培养基A.3.1成分蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g硝酸钾5.0g磷酸氢二钠2.5g5 GB4789.13—2012半乳糖5.0g甘油5.0mL琼脂3.0g蒸馏水1000.0mLpH7.3±0.2A.3.2制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。如果当天不用，置4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.4乳糖-明胶培养基A.4.1成分蛋白胨15.0g酵母粉10.0g乳糖10.0g酚红0.05g明胶120.0g蒸馏水1000.0mLpH7.5±0.2A.4.2制法加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于1000mL蒸馏水中，调节pH，加入乳糖和酚红。分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌10min。如果当天不用，置4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.5含铁牛乳培养基A.5.1成分新鲜全脂牛奶1000.0mL硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g蒸馏水50.0mLA.5.2制法将硫酸亚铁溶于蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000mL牛奶中，混匀。分装大试管，每管10mL，118℃高压灭菌12min。本培养基必须新鲜配制。A.60.1%蛋白胨水A.6.1成分蛋白胨1.0g蒸馏水1000.0mLpH7.0±0.2A.6.2制法加热溶解，调节pH，121℃高压灭菌15min。A.7革兰氏染色液A.7.1结晶紫染色液A.7.1.1成分结晶紫1.0g6 GB4789.13—201295%乙醇20.0mL1%草酸铵水溶液80.0mLA.7.1.2制法将结晶紫完全溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.7.2革兰氏碘液A.7.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.7.2.2制法将碘与碘化钾先混合，加入蒸馏水少许振摇，待完全溶解后，再加入蒸馏水至300mL。A.7.3沙黄复染液A.7.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.7.3.2制法将沙黄溶解于95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.7.4染色方法涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.8硝酸盐还原试剂A.8.1甲液（对氨基苯磺酸溶液）在1000mL5mol/L乙酸中溶解8g对氨基苯磺酸。A.8.2乙液（α-萘酚乙酸溶液）在1000mL5mol/L乙酸中溶解5gα-萘酚。A.9缓冲甘油-氯化钠溶液A.9.1成分甘油100.0mL氯化钠4.2g磷酸氢二钾（无水）12.4g磷酸二氢钾（无水）4.0g蒸馏水900.0mLpH7.2±0.1A.9.2制法将以上成分加热至完全溶解，调节pH，121℃高压灭菌15min。配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油200mL和蒸馏水800mL。7'