水处理微生物学 第三章 细菌的生长和遗传变异 21页

第三章细菌的生长和遗传变异第一节细菌的生长及其特性细菌吸收营养物质以后，在酶的催化下进行各种新陈代射反应，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，表现在细胞自身就是体积或重量的不断增加。这种现象叫生长。生长到一定阶段，细菌以二分裂的方式形成两个子细胞，这就是繁殖，其持征是细菌个体数增加。细菌的生长繁殖很快，适宜的环境下每隔20～30min分裂一次。细菌有没有年轻、年老之分呢？回答是肯定的，但是细菌的所谓菌龄和人的老年、中年、幼年的概念不同。人是按出生之时算起，年纪越小越年轻，越大就越老。细菌则不然，细菌是以分裂法进行繁殖的，一般繁殖一代的时间，只要20～30min，而且在一大群细菌中也无法区分每个细菌的年老年轻。因此细菌的所谓年龄是指一群细菌在一定的环境条件下生长而表现出来的待征。换句话说，描述细菌的生长往往用群体繁殖和生长所表现出来的特征来代表。在介绍细菌的生长特性之前，先介绍细菌的生长测定方法。一、细菌生长测定方法(一)直接测定直接测定是常用的细菌生长测定方法，其特点是测定过程快速，但不能区分细菌的死活。根据不同的测定方法原理，可以分成以下几类：1、显微镜直接计数法显微镜直接计数法又称全数法。它又分成下述几种：(1)涂片染色法将已知体积的待测样品，均匀地涂布在载破片的已知面积内，经固定染色后计数菌数。一般藉助目测微尺的直径标准来计算细菌的数量。(2)计数器测定法采用特殊的细菌或血球计数器进行测定。操作过程是取一定体积的待测细菌样品放于计数器的测定小室与载玻片之间，由于测定小室的体积是已知的，因此根据得到的计数值就可以计算出细菌含量。(3)比例计数法将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性400～500万个／mL，女性350～450万个／mL)，由此可以测得细菌数量。2、比浊计数法这是测定悬浮细胞的快速方法。其原理是细菌细胞是不透光的，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范围内透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比，籍此可以测定细菌浓度。采用这种方法时，为了得到实际的细胞绝对含量，通常须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。(二)间接计数法间接计数法又称活菌计数法。它是通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。因此，这种方法不含死的细菌细胞，而且测定所需的时间也较长。它分下述几种方法：1、平板计数法将待测细菌样品先作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品涂布到平板中，或与未经融化的固体培养基混合、摇匀，培养一定时间后观察并计数生长的细菌数，最终根据细菌数和取样量计算出细菌浓度。一般计数平板的细菌生长菌落数以30～300个为宜。菌落数太多，计数时费时费力；菌落数太少，则计数结果误差太大。平板计数法是采用最广的一种活菌计数法。2、液体计数法液体计数法是根据统计学原理设计的一种方法。具体做法是；先将待测细菌样品作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品分别接钟到3管或5管—\n组的数组液体培养基中，培养一定时间后．观察各管及各组中细菌是否生长，记录结果，再查已专门处理好的最可能数(mostprobablenumber，MPN)表，得出细菌的最终含量。因此，这种方法又叫最可能数法或MPN法。3、薄膜计数法对于某些细菌含量较低的测定样品(如空气或饮用水)，可采用薄膜计数法。将待测样品通过带有许多小孔但又不让细菌流出的微孔滤膜，藉助膜的作用将细菌截留和浓缩，再将膜放于固体培养基表面培养，然后类似于板计数那样计算结果。这种方法的要求是样品中不得含有过多的悬浮性固体或小颗粒。上述各种活菌计数法中，除了已所述的特点以外，还有一个共同的要求，即测定的样品中细菌必须呈均匀分散的悬浮状态。对于本身为絮体或颗粒状的细菌样品，如好氧生物处理中的活性污泥，在测定计数之前要采取预处理方法(如匀浆器捣碎等)进行强化分散。(三)重量法细菌细胞尽管很微小，但是仍然具有一定的体积和重量，因此藉助群体生长后的细胞重量，可以采用测定重量的方法直接来表示细菌生长的多少或快慢。1、测定细胞干重可采用离心法或过滤法测定。取经过培养一段时间的待测细菌样品，用离心机收集生长后的细菌细胞，或用滤纸、滤膜过滤截取生长后的细菌细胞，然后在105～110℃下进行干燥，称取干燥后的重量，以此代表细菌生长量的多少。一船．从细菌细胞的化学组分可知，干重约为湿重的10％～20％。原核细菌的细胞重量是10－15～10－11g／细胞，真核单细胞微生物重量为10－11～10－7g／细胞。水处理中构筑物内细菌生长量通常采用这种细胞干重测定法。在活性污泥法中采用的指标是混合液悬浮固体(MISS)。具体做法是：取一定体积的待测污泥样品，放于蒸发皿中干燥，然后称重。但是这种方法有个缺陷，即混合液中含有的无机悬浮物或颗粒也包含在测定的重量之中，可是这些重量并不能真正反映细菌的实际生长情况。因此，为了更确切地得到细菌生长量的结果，必须采用另外一个指标——挥发性悬浮固体(MLVSS)。其测定过程是：将已测得干重(W0)的污泥样品，放于马福炉内550℃下灼烧2h，在这样的高温下细菌中含有的各种有机物就被分解变成CO2，相H2O并蒸发掉。冷却后放入干燥器中保温至恒重并称量(W)。污泥干重W0减去最终重量W的差值就是挥发性悬浮固体重量。当然，限于测定方法的精度这仅能约略表示微生物的数量。2、细胞含氮量细菌细胞蛋白质中氮的含量比较稳定，一般在15％～17％，平均为16％。根据氮含量的测定结果，反过来可以求出细菌生长量的多少。3、DNA含量不同的细菌细胞其含有的DNA含量是不同的，但同一种细菌所含有的DNA含量却是基本一致。利用这一特性，可以通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量。这后二种方法在细菌的生理生化研究中应用较多。(四)其它生理生化指标法细菌的生长生命活动过程中，不可避免地要吸收和消耗一些物质，同时产生和分泌另一些物质。测定这些物质的变化就可以间接地来表示细菌生长的情况。水处理中通常采用的生理生化指标有：营养物质(COD)的消耗，溶解氧的消耗(如好氧细菌的瓦呼仪测走法)，有机酸的产生，H2和CH4的产生(如厌氧细菌的生长及活性测定)。二、细菌生长特性1、间歇培养和生长曲线将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌数目或重量的变化，这就是间歇培养。如以活细菌个数或细菌重量为纵坐标，培养时间为横坐标，即可画得一曲线，此曲线称为细菌的生长曲线。一般说，细菌重量的变化比个数的变化更能在本质上反映出生长的过程，因为细菌个数的变化只反映了细菌分裂的数目，而重量则包括细菌个数的增加和每个菌体的增长。图3—1就是按细菌重量绘制的生长曲线。整个曲线可分为3个阶段(或3个时期)：生长率上升阶段(对数生长阶段)，\n生长率下降阶段及内源呼吸阶段。在生长率上升阶段初期，细菌是在适应新的环境，一般不进行分裂，故菌数不增加，但菌体则在逐渐增大，以后很快进入迅速繁殖的阶段。在上升阶段，食料(营养物)的供应超过细菌的需要，细菌的生长不受食料数量的影响，只受自身生理机能的限制。到这一阶段的后期，生长率达到最高，这时它们分解培养基中有机物的速率也最高。科学试验说明，在这一阶段中细菌数目的对数同培养的时间呈直线关系，所以又称对数生长阶段。经过一定时间后，由于食料的减少(食料逐渐被细菌吸收掉)和对细菌有毒的代谢产物的积累，环境逐渐不利于细菌的生长，因而进入生长率下降阶段。此时的细菌生长率主要已不是受自身生理机能的限制，而是食料不足起着抑制细菌生长的主导作用了。在内源代谢阶段，培养基中的食料已经很少．菌体内的贮藏物质，甚至体内的酶都被当作营养物质来利用，也就是说，细菌这时所合成的新细胞质已不足以补充因内源呼吸(即菌体内贮藏物质、酶等一部分细胞物质的氧化)而耗去的细胞质，因此细菌重量逐渐减少。所以在这一阶段细菌重量的减少一方面是由于细菌的死亡，另—方面是由于内源呼吸。在以上3个阶段中，处于第一阶段的细菌可说是细菌的年轻阶段，列第三个阶段是细菌的衰老阶段。在年轻阶段时整个群体都是年轻的，到了衰老阶段尽管也有新分裂的细菌，但仍然属于衰老的。图3—2是按细菌数目的对数绘制的生长曲线图。曲线可分为缓慢期、对数期、稳定期和衰老期四个阶段。在开始一段细菌并不繁殖，数目不增加，但细胞生理活性很活跃，菌体体积增长很快，而在其后期只有个别菌体繁殖，故称这阶段为缓慢期。经过一段缓慢期后，细菌分裂速度迅速增加，进入对数期。在稳定期中，菌体生长繁殖速度逐渐下降，同时菌体死亡数目逐渐上升，最后达到新增殖的细菌数与死亡数基本相等。稳定期的活菌数保持相对平衡并处于最大值。稳定期的出现是由于食料的减少和有毒代谢产物的积累。在衰老期，细菌死亡速度大大增加，超过其繁殖速度，只有少数菌体进行繁殖，进行内源呼吸，所以活细菌曲线显著下降。在对数期，微生物的增长过程一般可用下式表示：式中X――某一时间t时微生物的重量或浓度\nK1――微生物增长率积分，得：式中X0一－微生物的起始重量或浓度。对于废水生物处理中的活性污泥来说，微生物的重量或浓度可以租略地用挥发性污泥的重量或浓度来表示，而K1则表示挥发性污泥的增长率(在实际工作中也可用污泥总量代表挥发性污泥)。在对数期，对于纯培养的细菌来说有一个很重要的概念——世代时间，或称倍增时间。它指的是细菌繁殖一代即个体数目增加一倍的时间。对数期的细菌细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，细菌数目呈几何级数增加，代时稳定。因此世代时间的测定必须以对数期的生长细胞作为最佳和最快生长的对象。其测定计算如下：设时间t0时细菌浓度为X0，到时间t时细菌浓度为X，其间细菌共繁殖分裂了n代，则：式中G——世代时间。细菌的浓度xo、x可通过生长测定方法得到，时间fo、f是确定的，这样就可以测定计算得出细菌的世代时间一般来说，细菌生长繁殖极快。多数种20～30min繁殖一代，最快的世代时间仅9．8min，有的则长达几十小时。好氧细菌比厌氧细菌的世代时间短，单细胞比多细胞微生物的世代时间短，原核比真核微生物的世代时间短。同一种细菌，世代时间受培养基组成和培养条件的影响，如培养温度、pH、营养物浓度和性质等等。但是，在一定条件下，各种细菌的世代时间是一定的。在生长率下降阶段，食料或有机物浓度较低，其量已大大影响微生物的生活。科学实验表明，有机物的去除率与存在的有机物浓度成正比：式中S一—某一时间t时的有机物(基质)浓度K2一一常数积分，得：\n式中S0――有机物的起始浓度在内源代谢阶段，微生物的增长过程则可用下式表示：式中X—一某一时间t时微生物的重量或浓度K3——微生物自身氧化速度常数积分，得：式中Xo——微生物的起始重量或浓度缓慢期的出现是为了调整代谢。当细胞接种到新的环境后，需要重新合成必需的酶、辅酶或某些中间代谢产物以适应新的环境。在水处理中为了避免缓慢期的出现，可考虑采用处于对数生长期或代谢速率旺盛的污泥进行接种。另外增加接种量及采用同类型反应器的污泥接种也可达到缩短缓慢期的效果。在废水生物处理过程中，如果维持微生物在生长率上升阶段(对数期)生长，则此时微生物繁殖很快，活力很强，处理废水的能力必然较高；但必须看到，此时的处理效果并不一定最好，因为微生物活力强大就不易凝聚和沉淀，并且要使微生物生长在对数期．则需有充分的食料，就是说，废水中的有机物必须有较高的浓度。在这种情形下。相对地说，处理过的废水所含有机构浓度就要比较高些，所以利用此阶段进行废水的生物处理实际上难于得到较好的出水。稳定期的细菌生长速率下降，细胞内开始积累贮藏物和异染颗粒、肝糖等，芽孢细菌也在此阶段形成芽孢，若产生抗生素的放线菌也在此时期大量形成。处于稳定期的污泥代谢活性和絮凝沉降性能均较好，传统活性污泥法普遍运行在这一范围。衰老期阶段只出现在某些持殊的水处理场合，如延时曝气及污泥消化。图3—3示微生物的代谢速率与食料和微生物重量或浓度之比(食料／微生物)的关系。在活性污泥法的推流式曝气池进口附近，食料与微生物之比一般总是比较高的，但随着水流向出口处流动，此值将逐渐减小。上面所讨论的都是指纯种培养而言的，而且接种的细菌是不习惯于新环境的。废水中微生物的种类繁多，生长情况也复杂得多，但总的说来，生长曲线的形态基本上是相似的，因为存在着优势细菌种群。应予特别指出的是，上述这些讨论都是针对细菌的间歇培养。在实际水处理中，反应器的运行多为连续进料方式，两者存在着很大的不同，细菌生长特性的表现也有很大差异。但是，间歇培养的许多概念仍有借鉴意义，例如各生长时期细菌的生长特征及其在水处理中的应用，详见上述。2、连续培养连续培养与间歇培养不同，它的持点是一方面连续进料，另一方面又连续出料的培养方式。它又分为两种：恒浊连续培养和恒化连续培养。\n(1)恒浊连续培养培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定，保持理论上的对数生长期，可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。(2)恒化连续培养这种方式与水处理装置的运行方式比较相似。固定恒定的进料流速，又以同样的速率排出，进水组分及反应器中营养物浓度基本不变。这种方式往往有一种限制性营养生长因子控制生长。实际情况也确实如此。恒化连续培养装置中描述与控制细菌生长的最重要参数是稀释速率D，其含义如下：稀释速率D＝式中:F——进料流速V——培养装置体积。稀释速率D与停留时间(retentiontime，RT)互为倒数，后者指一定流量的进料在反应器中的滞留时间。运行控制中D的大小须与细菌的生长相联系，即与细菌的倍增时间(doubletime，DT)有关。为了保证细菌在反应器内能很好生长，稀释速率D必须小于倍增时间DT，也就是说停留时间RT必须大于倍增时间DT，这样细菌才能滞留在反应器内，细菌越来越多。反之，稀释速率D大于DT，细菌就会被冲出(wash-out)反应器，细菌越来越少。因此，D等于DT时的数值特称为临界稀释速率(DC)。D，DC，DT及基质浓度s等之间的关系曲线详见图3—4。第二节细菌的遗传与变异细菌向其它生物一样，有其固有的遗传性。所谓细菌的遗传性是指每种细菌所具备的亲代性状在子代重现，其子代的性状与亲代基本上一致的现象。例如，大肠杆菌是短杆菌，生活条件要求pH为7.2，温度37℃，在糖类物质存在的条件下产酸、产气。大肠杆菌的亲代将这些特性传给子代，这就是大肠杆菌的遗传性。一旦大肠杆菌的营养和其它外界条件剧烈变化，它就会因不适应而受抑制或死亡。在工业废水的生物处理巾中特别注意这种情况，例如：进水的pH值必须控制在适当范围内，否则将影响处理效果。细菌遗传是在系统发育过程中形成的。系统发育愈久的细菌，其遗传的保守程度就愈大，愈不容易受外界环境条件的影响。不同种的细菌遗传保守程度不同，菌龄不同的同种细菌遗传保守程度也不同。一般情况下，老龄菌遗传保守程度比幼龄菌大，高等生物遗传保守程度比低等生物大。一种生物的亲代和子代以及个体之间，在形态结构和生理机能方面都有所差异，这一现象叫做变异。由子细菌繁殖迅速，体积小，与外界环境联系密切，所以环境条件在短时期内能对菌体产生多次影响，细菌受到物理、化学因素影响后，就会较容易地在机体内产生适应新环境的酶(叫诱导酶)，从而改变原有的持性，即产生了变异。\n遗传与变异是生物最基本的属性，两者相辅相成，相互依存，遗传中有变异，变异中有遗传．遗传是相对的，变异是绝对的，有些变异了的形态或性状，又会以相对稳定的形式遗传下去，但是并非一切变异都具有遗传性。细菌的遗传变异性是比较普遍的，常见的变异现象有个体形态的变异、菌落形态(光滑型、粗糙型)的变异、毒力的变异、生理生化特性的变异及代谢产物的变异等等。定向培育即通过有计划、有目的地控制微生物生长条件，使微生物遗传性向人类需要的方向发展。在水的生物处理中，这种定向培育过程称为驯化。在工业废水生物处理中，常利用微生物对营养要求，温度，pH值以及耐毒能力的变异，改善处理方法。例如，在含酚废水的生物处理过程中，可以通过逐渐提高进水的含酚量，增强细菌氧化酚的能力，则可在一定程度上提高进水浓度，而不影响或维持满意的处理效果。另外利用生活污水活性污泥接种，加速培养工业废水活性污泥的方法，也利用了细菌的变异持性。一、细菌的遗传(一)细菌遗传的物质基础遗传学的研究表明，一切生物遗传变异的物质基础是核酸。含有DNA的微生物中遗传物质是DNA。不含有DNA，只含有RNA(核糖核酸)的微生物中，遗传物质是RNA。(二)核酸的结构核酸是一种多聚核苷酸(polynucleotide)，水解过程如下：核苷的戊糖和碱基的差异又分为DNA及RNA．如表3—1。1、DNA的双螺旋结构1953年华生(Watson)和克里克(Crick)通过X射线衍射法观察DNA结构，提出了DNA双螺旋结构模型：(1)两条走向相反的多核苷酸链，以右手方向沿同一轴心平行盘绕成双螺旋，螺旋直径为2nm。如图3—5。(2)两条链间借碱基对的氢键相连。A与T之间有2个氢键，G与C之间有3个氢键(RNA链中4与U之间为2个氢键，G与C之间为3个氢键)。这种碱基相配的关系称为碱基互补或碱基配对。(3)一个DNA分子可含几十万或几百万个碱基对，两个相邻的碱基对之间的距离为0.34nm，每个螺旋的距离为3.4nm。\n2、RNA在细胞里的三种类型(1)信使RNA(mRNA)它是以DNA的一条单链为模扳．在RNA聚合酶的催比下，按碱基互补原则合成的(见图3—6)。由于传达了DNA的遗传信息，故称信使RNA。(2)转移RNA(tRNA)它存在于细胞质里，在蛋白质合成过程中起转移氨基酸的作用(图3—7和图3—8)。(3)核糖体RNA它的主要成分是核糖体核酸(rRNA)和蛋白质。一个核糖体包含有大小两个亚基，它是蛋白质合成的主要场所。\n\n(三)DNA的复制DNA的复制过程包括解旋和复制。首先DNA双螺旋分子在解旋酶的作用下，两条多核苷酸链的碱基对之间的氢键断裂，分离成两条单链，然后各自以原有的多核苷酸链，按照碱基排列顺序，合成一条互补的新链，复制后的DNA双链，由一条新链和一条旧链构成。新链的碱基与旧链的碱基以氢键相连接成新的双螺旋结构，称为半保留复制，整个复制过程是边解旋边复制的，如图3—9。(四)微生物中的DNA1、原核微生物中的DNA原核微生物中的DNA不与蛋白质结合，也没有核膜，而是以单独裸露状态存在，通常也称染色体，绝大多数微生物的DNA是双链的(有的呈环状、有的呈线状)，只有少数微生物的DNA是单链的。细菌的DNA拉直时比细胞长许多倍，如大肠杆菌的长度为2µm，其DNA长度为1100µm至1400µm，它在细胞中央，高度折叠形成具有空间结构的一个核区。由于含有磷酸根，而带有很高的负电荷。此外，还有少量的DNA(约占细胞中总DNAl％)存在于细胞质中，称为质粒(plasmid)。2、真核微生物中的DNA真核微生物的DNA与蛋白质结合，主要存在于细胞核的染色体上，在普通显微镜下可看到真核微生物染色体，外面包有核膜，构成真正的细胞核，真核微生物细胞核中DNA的量大于原核微生物核区中DNA的量，DNA也存在于真核微生物的叶绿体、线粒体等细胞器中，但是量很少。一般不超过细胞核DNA的1％，并且不与蛋白质相结合。DNA几乎全部集中在染色体上，每种生物的染色体数目是一定的，如细菌只有一个环状染色体。染色体上含有大量不同的基因，基因数目为几个到几百甚至几千个不等，染色体是遗传信息主要贮藏场所。除染色体外另有一类较小环状DNA\n分子独立存在于染色体外，也携带少数基因，这就是质粒，在细胞分裂中也能进行复制，传给后代，并表现一定的遗传特性。质粒一般只存在于细菌。质粒存在与否不影响微生物细胞的生存，只有当宿主细胞表现某种特性时才能被检出。丧失质粒仅丧失由其决定的某些持性。常见的质粒有F因子，R因子，产细菌素因子及降解质粒等等。有的质粒能通过细胞和细胞的接触而转移，使受体细胞获得该质粒决定的遗传性状。最近发现某些酵母菌也有质粒。(五)遗传信息的传递和表达生物体的遗传信息大多都贮存在DNA上，只有少数病毒的遗传信息贮存在RNA上。遗传信息的传递和表达可概括为3个步骤，以DNA为例说明如下：1、将携带遗传信息的DNA复制；2、将DNA携带的遗传信息转录到RNA上；3、将RNA获得的信息翻译成蛋白质。这3个步骤在分子遗传学中称为中心法则。一些致癌的RNA病毒，侵入宿主后，在一种逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA。DNA、RNA和蛋白质的关系非常复杂，比较完善的中心法则如图3—10所示。DNA贮存的信息通过碱基排列的序列传给后代，以DNA一条链为模板以碱基互补原则合成mRNA的过程称为转录，转录必须忠实无误。mRNA包括四种碱基A、G、C、U，而蛋白质中含有20种氨基酸，根据实验证明3个碱基序列决定一个氨基酸的遗传密码，共有64个密码。编码字典见表3—2。其中61个密码分别代表20种氨基酸。每一种氨基酸有1个到6个密码不等，另外3个密码UAA、UAG、UGA为肽链终止信号，不代表任何氨基酸。密码AUG代表蛋氨酸，也是肽链合成的起动信号。\nmRNA携带着由DNA转录来的遗传信息。这些信息蕴藏在mRNA的3字密码上，密码的序列决定了蛋白质中氨基酸的序列。在蛋白质合成中，核糖体的小亚基主要识别mRNA的起动密码子AUG，并搭到mRNA的链上移动，直到遇到mRNA的终止信号UAA、UAG、UGA时，合成工作终止。tRNA按mRNA密码的指示，依赖一种强特异性的氨基酰tRNA合成酶，将不同的氨基酸活化，活化后的氨基酸被特异的tRNA携带，按排列顺序结合到核糖体的大亚基上，缩合成肽链，如图3—11。蛋白质或者多肽链是各种遗传性状的物质基础。(六)基因表达的调控基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段，平均含有1000个碱基对。一个DNA分子中含有许多基因，不同基因分子含碱基对的数量和排列序列不同，并具有自我复制能力。各种基因在染色体上均有其特定的位置称为位点，如果染色体上基因缺失、重复、或在新的位置上和别的基因相邻，改变了原有的排列序列，都会引起某些性状的变异。由于基因的功能差异，又可分为结构基因、调节基因和操纵基因。结构基因决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA，可将携带的特定遗传信息转录给mRNA，再以mRNA为模板合成特定氨基酸序列的蛋白质。\n调节基因调节基因带有阻遏蛋白，控制结构基因的活性。平时阻遏蛋白与操纵基因结合，结构基因无活性，不能合成酶或蛋白质，当有诱导物与阻遏蛋白结合时，操纵基因负责打开控制结构基因的开关，于是结构基因就能合成相应的酶或蛋白质。操纵基因操纵基因O位于结构基因的一端，与—系列结构基因合起来形成一个操纵子。例如大肠杆菌中降解乳糖的酶由3个蛋白质Z、Y和A所组成。受结构基因z、y及a控制，当培养基中不存在乳糖时，调节基因I的阻遏蛋白与操纵基因结合，结构基因就不能表达出来，当培养基中除乳糖外无其它碳源时，乳糖是诱导物，与调节基因I的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白丧失与操纵基因结合的能力，此时操纵基因“开动”，结构基因z、y及a合成蛋白质Z、Y和A，从而形成分解乳糖的酶(如图3—12所示)，培养基中乳搪就被大肠杆菌分解利用，当乳糖全部被利用后，阻遏蛋白就与操纵基因结合，操纵基因“关闭”，酶的合成停止。遗传性状的表现是在基因控制下个体发育的结果，即从基因到表现型必需通过酶催化的代谢活力来实现，而酶的合成直接受基因控制，一个基因控制一种酶，或者说一种蛋白质的合成控制一个生化步骤，从而控制新陈代谢决定遗传性状的表现。乳糖操纵子的上述调控方式称负控制，也就是说，调节基因的阻遏蛋白的操纵基因结合，它存在时操纵基因关闭，酶合成停止。若与诱导物结合而从操纵基因消失后，则操纵子开启，酶活性得到翻译和表达。据实验测定，大肠杆菌不接触乳糖时，每一细胞中大约有5个分子的β－半乳糖苷酶(结构基因z)，接触诱导物2～3min后就能测得酶的大量合成，直到达到每一细胞5000个分子。另外。乳糖操纵子还存在着正控制作用，即某种物质的存在使某种细胞功能能够实现，而这一组分的消失或失活使这一功能不能实现。这一现象最初是从葡萄糖和山梨糖共基质培养时发现的。大肠杆菌首先利用葡萄糖作为碳源生长，葡萄糖消耗完后才开始利用山梨糖作为碳源，在这之前出现一个短短的生长停顿时期。这种现象称为二度生长。后来发现，不仅山梨糖这样，凡是必须通过诱导才能利用的糖(包括乳糖)和葡萄糖同时存在时都呈现这种二度生长现象。这种现象又称葡萄糖效应。以后发现实际上是葡萄糖的降解物在起作用，故又称降解阻遏效应。经过研究知道细胞中存在着一种cAMP受体蛋白(CAP)，cAMP与CAP结合后作用于启动基因P(位于操纵基因前面)，转录才能进行。大肠杆菌细胞中一般含有一定量的cAMP，在含有葡萄糖的培养液中cAMP则大大降低，其机理是葡萄糖的降解物抑制腺苷酸环化酶，或者促进磷酸二脂酶的作用(图3—13)。乳糖操纵子中CAP\n的正控制和阻遏蛋白的负控制双重调控机制有利于大肠杆菌的生存。这是因为一方面乳糖不存在时没有必要合成分解乳糖的酶；另一方面葡萄糖代谢中的酶都是组成酶，所以葡萄糖和乳糖共存时分解乳搪的酶的诱导合成也就成为多余，这时葡萄糖的降解物对于分解乳糖的相关酶的合成阻遏使成为有利于生存了。二、细菌的变异细菌的遗传性状发生变化称为细菌的变异，主要是由基因突变和基因重组造成的(图3－14)。\n(一)基因突变微生物群体中偶而会出现个别在形态或生理方面有所不同的个体，个体的变异性能够遗传，产生变株。这是由于某些原因，引起生物体内的DNA链上碱基的缺乏、置换或插入，改变了基因内部原有的碱基排列顺序(基因型的改变)，引起表现型突然发生了可遗传的变化。当后代突然表现和亲代显然不同的遗传的表现型时，这样的变异称为突变。突变的主要特点有：(1)突变的发生是无定向的。微生物的生活条件对于突变的发生并无明显的制约关系。突变体发生后，能否生长、繁殖则决定于生活条件是否能够满足突变体的要求。(2)突变发生的频率很低，即稀有性。突变率是指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的机率，通常为10－5～10－10。(3)自发性。各种性状的突变可以在没有人为诱变因素的处理下自发发生。(4)独立性。各基因性状的突变可以独立随机地发生。(5)稳定性。发生突变的新性状是稳定的、可遗传的。(6)可逆性。突变可以由原始的野生型向突变型方向进行，一般称此为正向突变。反过来，突变也可以发生在突变型向野生型的转变，此称回复突变。(7)诱变性。自发突变的发生频率很低，但是通过人为施加诱变剂处理后突变率可大大提高，一般可提高10～105倍。根据突变发生机理，突变可分为点突变和染色体畸变两大类。前者指DNA中一个或数个碱基对发生改变引起的突变，后者指一小段碱基对片段引起的突变。点突变又分碱基置换和移码突变，前者指碱基对发生的改变，包括一种嘌呤或嘧啶被另外一种嘌呤或嘧啶所取代(转换)和一种嘌呤或嘧啶被另外一种嘧啶或嘌呤所取代(颠换)。突变发生的具体途径与所采用的诱变剂及反应条件密切相关。根据突变发生过程是否受人为诱变剂影响可分为自发突变和诱发突变两大类。1、自发突变凡是在没有特设的诱变条件下由外界环境的自然作用如辐射或微生物体内的生理和生化变化(如代谢产物H202等)而发生的基因突变称为自发突变。微生物在生长繁殖过程中，个别基因自发突变机率极低，如细菌的突变率是10－4～10－10。，即1万到100亿次繁殖中，才出现一个个别基因的突变体。作为遗传物质DNA\n．一般说来是十分稳定的，但是在一定的情况下也会发生改变，从野生型产生一些不同种的突变体。例如色素突变、细胞形态突变(丧失芽孢、荚膜或鞭毛的特性)，营养型突变(丧失合成某种营养物质的能力)，发酵突变和抗性突变(包括抗药性、抗噬菌体、抗染料、抗辐射等)及致病力突变等。当突变体回复野生表型时称回复突变。例如大肠杆菌组氨酸营养缺陷型(his—)的菌株在无组氨酸的培养上应当无菌落生长。假如发现长出少数菌落，表现出有合成组氨酸能力的野生型菌株表型(his+)，这少数菌落称为回复突变，即突变体((his—)回复野生表型(his+)。饮用水致突活性的检测就是根据这一回复突变频率的大小来确定是否含有致突物质。自发突变是在自然条件下无定向的，有时会对人类有益，有时对人类无益，甚至有害。如果任其自然发展，往往导致菌种退化。2、诱发突变或称诱变人为地利用物理化学因素，引起细胞DNA分子中碱基对发生变化叫诱变。所利用的物理化学因素称为诱变剂。常用的诱变剂有紫外线、5－溴尿嘧啶、亚硝酸、吖啶类染料等。废水处理驯化活性污泥及生物膜的方法，一船是把培养、选择、淘汰结合在一起，在特定废水中有些菌种不能适应被淘汰，有的菌株能产生诱导酶来降解此类废水，并能在这种培养条件下生存而被保留下来，同时大量繁殖，使废水达到顶期的排放标准。国外目前正在研究针对某种废水用人工诱变方法筛选大量具有很强分解能力及絮凝能力的菌株，并把它们做成干粉状变异菌成品。这时，细菌处于休眠状态。当工厂处理此类废水时．可把干粉状菌种置于30℃水中溶解30min，使细菌恢复活性。不必再驯化，对所需处理的废水有较好效果。(二)基因重组两个不同性状的个体细胞，其中一个细胞(供体细胞)的DNA与另一个细胞(受体细胞)的DNA融合，使基因重新排列，遗传给后代，产生新品种或表达新的遗传性状，称为基因重组。在基因重组时，不发生任何碱基对结构上的变比。重组后的生物体表现出重组后的新的遗传性状。微生物中基因重组的形式很多。在真核微生物中，基因重组是通过二个配子相互融合的有性繁殖的过程中发生的，故称为杂交。在原该微生物中通常只是部分遗传物质的转移和重组，如转化、转导和接合等都是基因重组在细胞水平上的反映。1．转化转化(Transformation)是供体细胞研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细胞的基因重组方式。受体细胞获得了供体细胞的部分遗传性状。1928年英国细菌学家格里菲斯(Griffth)发现肺炎双球菌中SⅢ型菌株，菌落光滑，产生荚膜，当它感染人、小白鼠或家兔等时均可致病。其中RⅡ型菌株菌落租糙，不产生荚膜物质，感染人、小白鼠或家兔均不致病。当将RⅡ型活菌注射小白鼠，小白鼠健康不致病，并可分离到RⅡ型肺炎双球菌菌落；将SⅢ型的肺炎双球菌加热杀死后注射小白鼠，小白鼠健康不致病，从健康的鼠体分离不出肺炎球菌；但将加热杀死的SⅢ型细菌与RⅡ型活细菌混合后注射小白鼠，小白鼠死亡，并可从死鼠体内分离到SⅢ型活细菌，见图3-15。\n其后在体外进行转化试验。将死的SⅢ型细菌研碎，提取出其中的DNA与RⅡ型活菌混合培养。后代产生两种类型的菌落，大部分是RⅡ型细胞，但少数(百万分之一)是有毒的SⅢ型细胞，如图3-l6所示，加DNA酶破坏SⅢ型DNA，可阻止转化作用。1914年Avery等证明所谓转化物质就是DNA，SⅢ型的DNA进入RⅡ型受体细胞内，发生了基因重组，使RⅡ型转化成SⅢ型。试验发现受体细胞必须在感受态(Competence)阶段。在感受态阶段的受体细胞叫感受态细胞。感受态细胞是由细胞的遗传性以及细胞的生理状态、菌龄和培养条件等决定的，如肺炎双球菌的感受态阶段处于对数生长期的中期。\n转化因子是游离的DNA片段，在自然条件下，转化因子可由细菌细胞的解体产生。在实验室，可通过提取获得有转化能力的DNA片段，一般是双链DNA。单链DNA片段转化力很弱或没有转化能力。只有感受态细胞可以接受转化因子，转化频率很低，通常0.1％～1％。目前发现许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中也有转化现象。2、接合细胞的接合(conjugation)是遗传物质通过细胞与细胞的直接接触而进行的转移和重组。1946年美国科学家莱德柏格(Lederberg)和塔图姆(Tatum)采用大肠杆菌的两类营养缺陷型（不具备合成生长素—如维生素或氨基酸能力的微生物称为营养缺陷型，培养时必须人工供给此类生长素才能生长，将原来有合成生长素能力的微生物称为原养型或野生型，能合成某生长素用“+”表示，不能合成某生长素用“—”表示。）作试验。其中一类大肠杆菌没有合成生物素(B)和甲硫氨酸(M)能力，但能合成苏氨酸(T)和亮氨酸(L)，基因型为B-M-T+L+。另一类大肠杆菌没有合成苏氨酸(T)和亮氨酸(L)能力，但能合成生物素(B)和甲硫氨酸(M)，基因型为B+M+T-L-。分别从两个菌株取104个幼龄细胞混合，涂在不含上述四种成分的培养基上，结果竟然长出一些菌落。经分析基因型为B+M+T+L+野生型菌株，这是两类营养缺陷型菌株通过交配进行了基因重组的结果。为了排除转化作用，设计了一种U形管见图3-17，管的中间装有超微烧结玻璃过滤板，把管两端隔开，每端各接种一种营养缺陷型的大肠杆菌，由于中间滤板隔开，细胞无法直接接触，游离的DNA片段可以通过，使两端溶液来回流动，经过一段时间培养，从U形管两瑞取出细菌，分别涂于不含上述四种成分的培养基上，培养后无菌生长，证明接合重组细菌必须直接接触，遗传物质才能转移，排除了转化现象。从电镜照片可看到大肠杆菌的接合实际上是通过性纤毛进行的，性纤毛是中空的，遗传物质可以通过性纤毛转移。带有F因子的大肠杆菌才有性纤毛。图3-18为一个具有F因子的大肠杆菌(用F+表示)。当与不具有F因子的大肠杆菌(用F-表示)接合时，F+菌株先自我复制一个F因子通过性纤毛进入F-受体细胞，这样使原来不具有F因子的F-菌株变成F+菌株了。除F因子外尚有R因子、产细菌素因子及降解质粒等，可通过细胞接触而进行转移和重组。R因子可具有抗药性(如对抗生素及磺胺类药物的抗性)或抗某些重金属离子(如汞、镉、铅、铋等离子)。1955年首先在日本的志贺氏菌的一个菌株中发现，此菌株具有抗氯霉素、链霉素、四环素和磺胺类药物等多种抗性，其后其他国家有抗药性的沙门氏伤寒杆菌，病人用常规药物治疗无效，死亡率高。科学工作者发现人类和家畜肠道内都可能存在有许多抗药性的大肠杆菌，并可能把抗药因子转移给病原细菌如志贺氏痢疾杆菌和沙门氏伤寒杆菌，从而引起重视。3、转导遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组称为转导(transduction)。1951\n年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(Lederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。把一个具有合成色氨酸(Try+)能力，而无合成组氨酸(his-)的营养缺陷型LA—2供体，接种在U形管的左端；而在管的另一端(右端)接种噬菌体溶源性的LT22—A的营养缺陷型受体(Try-，his+)。U形管中间用超微烧结玻璃过滤板把两端隔开，管中溶液能通过滤板来回流动，但阻止细菌通过或接触(如图3-19)即排除接合。经过一定时间培养后，在右端L-22受体细胞中获得色氨酸(Try+)野生型的细菌。研究发现LA-22在培养过程释放温和噬菌体P-22，P-22通过滤板侵染供体LA-2，当LA-2裂解后，产生“滤过因子”大部分是P-22，其中极少数在成熟过程包裹了LA-2的DNA片段(含合成Try+基因)，并通过滤板再度感染LA-22，使LA-22获得合成Try+能力．由噬菌体携带来的DNA片段与受体细胞的基因重组，这个现象称为转导作用(有关烈性噬菌体增殖在第四章病毒中介绍)。基因重组的3种形式，其中细菌的接合必需两个细胞直接接触，而转化和转导无需细胞直接接触，转化没有噬菌体作媒介，转导必须通过噬菌体转移遗传物质。基因重组率均很低。三、遗传工程遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。按照人们预先设计的生物蓝图，通过对遗传物质的直接操纵、改组、重建，实现对遗传性状的定向改造。目前采用的基本方法是：把遗传物质从一种生物细胞中提取出来，在体外施行“外科手术”，然后再把它导入另—种生物细胞中，改变其遗传结构，使之产生符合人类需要的新遗传持性，定向地创造新生物类型。由于它采用了对遗传物质体外施工，类似工程设计那样，具有很高的预见件、精确性与严密性，因此称为遗传工程。遗传工程包括两个水平的研究：—是细胞水平；另一是基因水平。所以，又可把它分为细胞工程和基因工程。实际上目前研究的主要内容是基因工程，因此，狭义的讲，遗传工程就是基因工程。基因工程是70年代初发展起来，在分子水平上剪接DNA片段，与同种、同属或异种、甚至异界的基因连接成为一个新的遗传整体，再感染受体细胞，复制出新的遗传特性的机体。具体过程简述于下：1、选择合适的供体细胞，将其DNA取出，一般选择性地获取目的基因的DNA片段。2、选择合适外切酶或限制性内切酶，它能专一地切断目的基因DNA\n分子的特定部位，并在切断处形成具有粘着活性的末端单链(又称粘接末端，如图3-20)。使DNA分子在体外进行剪接、重组的“外科手术”有了可能性。目前，这类酶已陆续发现几十种，它们的切点各不相同，可以分别选用，并已制成商品出售。3、基因的运载和复制大部分DNA片段在细胞内无自发复制能力，所以要选样有自体复制的质粒(如R因子、降解质粒等)或病毒(如λ噬菌体，SV40病毒等)，从载体细胞取出质粒等载体的DNA，也用内切酶将其切断并形成粘性末端如图3-21所示。4、在DNA连接酶的作用下，将目的基因DNA粘性末端与载体DNA粘性末端粘着起来，相应的互补碱基对以氢键相联，形成一个新的重组载体DNA分子。5、将重组载体DNA分子加入受体细胞培养液中，受体细胞吸入载体，载体在细胞内复制，使受体细胞以及后代获得原供体细胞的基因和相应的属性。四、遗传工程在环境工程中的应用由于新的化学物质的不断发现，难降解污染物的增多．废水处理情况日趋复杂。带有降解某些物质的质粒的微生物往往不—定能在某一废水环境中生存，而能在此种废水条件下生存的细菌又不一定具有降解其中某些物质的质粒。因而各国科学家正试图利用遗传工程，把具有降解某些特殊物质的质粒剪切后，连接到受体细胞中，使之带有一种或多种功能用以处理废水，这种用人工方法选出的多质粒、多功能的新菌种称“超级细菌”。这方面研究工作较多，目前已有较为成功的实例，如：1、降解石油的超级细菌70年代美国生物学家查克拉巴蒂(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。石油成分复杂，是由饱和、不饱和、直链、支链、芳香……烃类组成，不溶于水。而海水含盐量高，虽发现90多种微生物有不同程度降解烃类的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也较慢，查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细胞，分别将能降解芳烃(质粒B)、萜烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细胞，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中2/3的烃。浮油在—般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高，见图3-22。\n2、耐汞质粒日本水俣事件及瑞典鸟类汞中毒事件后，日本和瑞典对汞在自然界转化做了大量研究工作，提出了汞化合物转化的途径，主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞，使人及生物中毒。另一面自然界中存在一些耐汞的微生物，它们的耐汞基因在R因子上。例如、恶臭假单胞菌一般在超过2µg／mL汞浓度中即将中毒死，查克拉巴蒂(Chakrabarty)用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得MER质粒，可在50～70µg／mL氯化汞中生长。3、降解染料的质粒1983年瑞士科学家Ku1la发现有两种假单胞菌分别具有降解纺织废水中两种染料的能力：其—为假单胞菌K24具有降解l号橙偶氮染料的质粒，其二为假单脑菌K46具有降解2号橙偶氮染料的质粒，他把两个菌株的两种质粒接合到一个菌株内，可获得具有降解两种染料的新菌种。复习思考题1、细菌是怎样繁殖的?2、怎样利用细菌的生长曲线来控制生物处理构筑物的运行?3、试区别遗传性与变异性。4、怎样利用细菌的变异来定向进行工业废水的生物处理？5、试以大肠杆菌降解乳糖来说明操纵子学说。6、简述蛋白质合成过程三种RNA的功能。7、基因重组有几种形式？各有什么特点？8、试述质粒与“超级细菌”。9、什么叫基因突变，可分为几类？10、什么叫遗传工程?在废水生物处理中如何应用?