GBT16347-1996乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验.pdf 5页

'中华人民共和国国家标准GB/T16347-1996乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验Microbiologicalexaminationoflacticacidbacteriainyoghurtbeverage1主题内容与适用范围本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。www.17jzw.com2引用标准GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。www.17bzw.cn乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。4设备和材料4.1温箱：36±1℃。4.2冰箱：0~4℃。4.3恒温水浴：46±1℃。4.4电炉：可调式。4.5吸管：容量为www.17jzw.net1，10和25mL。4.6广口瓶或三角瓶：容量为500mL。4.7平皿：直径为9cm。4.8试管：18×180mm。4.9显微镜。5培养基和试剂5.1www.3x888.com改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。5.2改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）5.30.1%美兰牛乳培养基。5.46.5%氯化钠肉汤。5.5pH9.6葡萄糖肉汤。5.640%胆汁肉汤。5.7淀粉水解培养基。5.8精氨酸水解培养基。5.9乳酸杆菌糖发酵管。5.10七叶苷培养基。5.11革兰氏染色液：按GB4789.28规定执行。标准资料收藏家www.17bzw.cn易启标准网免费提供十万标准书籍资料下载会打字、5分钟快速自助建网站www.17jzw.com易启建站网免费提供建站平台，商业网站1年仅60元 www.17jzw.comwww.17bzw.cnwww.17jzw.netwww.3x888.com5.123%过氧化氢溶液：按GB4789.28规定执行。5.13蛋白胨水、靛基质试剂：按GB4789.28规定执行。5.14明胶培养基：按GB4789.28规定执行。5.15硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB4789.28规定执行。5.16生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。6乳酸菌菌落总数的测定6.1检验程序乳酸菌菌落总数检验程序如下：检样www.17jzw.com作成几个适当倍数的稀释液选择2~3个适当稀释度，各以1mL之量加入灭菌平皿内每皿内加入适量改良TJA或改良www.17bzw.cnMC培养基36±1℃72±3h菌落计数www.17jzw.net报告6.2操作步骤6.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL（或25g）放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。6.2.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。www.3x888.com6.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。6.2.4选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。6.2.5稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。6.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取52上菌落数进标准资料收藏家www.17bzw.cn易启标准网免费提供十万标准书籍资料下载会打字、5分钟快速自助建网站www.17jzw.com易启建站网免费提供建站平台，商业网站1年仅60元 行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。划兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌少计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释-4倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：44535××10=8.2×1056.3乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生产形态特征见表1。表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良TJA改良MC杆菌平皿底为黄色，菌落中等大小，微白平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，红色，边缘似星状，直径2±1mm，www.17jzw.com如棉絮团状菌落可有淡淡的晕球菌平皿底为黄色，菌落光滑，湿润，微平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，白色，边缘整齐红色，边缘整齐，可有淡淡的晕注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。7乳酸菌的鉴定对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。7.1菌种制备：自平板上未免取菌落，接种于改良www.17bzw.cnTJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。7.3常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。7.4产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨酸蔗糖干酪乳杆菌www.17jzw.net++d+++d干酪亚种保加利亚乳杆菌-------嗜酸乳杆菌+++-+-+乳酸乳杆菌#-+---+注：d——有些菌株阳性，有些菌株阴性；#——弱、慢或阴性。表3产乳酸的链球菌的鉴别表www.3x888.com生长试验加热60℃水解水解0.1%6.5%40%pH10℃45℃30min淀粉精氨酸美兰牛乳氯化钠胆汁9.6嗜热链球菌-+----++-乳链球菌+-+-+-d-+乳脂链球菌+-d-+-d--注：d——有些菌株阳性，有些菌株阴性。标准资料收藏家www.17bzw.cn易启标准网免费提供十万标准书籍资料下载会打字、5分钟快速自助建网站www.17jzw.com易启建站网免费提供建站平台，商业网站1年仅60元 www.17jzw.comwww.17bzw.cnwww.17jzw.netwww.3x888.com附录A数种专用培养基及试剂（补充件）A1改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）A1.1成分番茄汁50mL酵母抽提液5g肉膏10g乳糖20g葡萄糖2gkwww.17jzw.com2HPO42g吐温801g乙酸钠5g琼脂15g水加至1000mLpH6.8±0.2A1.2制法番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎（切勿捣碎），放入三角烧瓶，置4℃冰箱8~12h，取了后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入www.17bzw.cn0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。制法：将所有成分加入蒸馏水，加热溶解，校正pH6.8±0.2。分装烧瓶，高压灭菌121℃15~20min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃时使用。A2改良MC培养基A2.1成分大豆蛋白胨5g牛肉浸膏5g酵母浸膏www.17jzw.net5g葡萄糖20g乳糖20g碳酸钙10g琼脂15g蒸馏水1000mL1%中性红溶液5mLwww.3x888.com硫酸多粘菌素B（酌情而加）10万国际单位A2.2制法将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加入中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121℃15~20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B（检样有胖听或开罐后有异味等怀疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B，混匀后使用）。A30.1%美兰牛乳培养基新鲜脱脂牛乳90mL1%美兰水溶液10mLA46.5%氯化钠肉汤肉浸液（pH7.6）100mL标准资料收藏家www.17bzw.cn易启标准网免费提供十万标准书籍资料下载会打字、5分钟快速自助建网站www.17jzw.com易启建站网免费提供建站平台，商业网站1年仅60元 氯化钠6gA5pH9.6葡萄糖肉汤普通肉汤校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。A640%胆汁肉汤pH7.6肉浸液60mL葡萄糖0.12g牛胆汁40mLA7淀粉水解培养基pH7.6肉浸液琼脂90mL羊血清5mL3%淀粉溶液10mLA7.1www.17jzw.com将肉浸液琼脂深化。A7.2待冷至50℃左右以无菌操作加入淀粉溶液及无菌羊血清混合后，倾注平板。A8精氨酸水解培养基蛋白胨0.1g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.6gL-精氨酸1g1.6%www.17bzw.cn溴甲酚紫酒精溶液1.4mL琼脂0.3g蒸馏水100mLpH7.2A9乳酸杆菌糖发酵管A9.1基础成分牛肉膏5g蛋白胨5g酵母浸膏www.17jzw.net5g吐温800.5mL琼脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸馏水1000mLA9.2按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。A10七叶苷培养基www.3x888.com蛋白胨5g磷酸氢二钾1g七叶苷3g枸橼酸铁0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸馏水100mL标准资料收藏家www.17bzw.cn易启标准网免费提供十万标准书籍资料下载会打字、5分钟快速自助建网站www.17jzw.com易启建站网免费提供建站平台，商业网站1年仅60元'