GBT26348-2010蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酰胆碱酯酶法.pdf 6页

'ICs11。020CO5中华人民共和国国家标准GB/T26348-2010蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酰胆碱酯酶法TestrnethodsofInosquitoresistancetoinsecticidesˉˉTestrnethodsoFinsensitiveacetyIchoIinesteraseforthemosquito⒛11-O⒈14发布2011-05-01实施中华人民共和国卫生部发布中国国家标准化管理委员会 GB/T26348-2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院馓生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人:赵彤盲、汪中明、李春晓、茧盲德、高希武、曾晓亢、佟颖。标准分享网www.bzfxw.com免费下载 GB/T26348-2010蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酰胆碱酯酶法1范围本标准规定了蚊虫体内不胆碱酯酶(ACh测方法。本标准适用于淡色库蚊(sg〃饣″g昭nsc饣ε彦仍s)、叻饣召饣白纹伊蚊(A纟d召s@J3op讠c拟s)、中ssj″召勿sjs)挚竽甲酸酯类杀虫剂抗性的生物化学检测。2术语和定义下列术语和2.1乙酰胆碱能够抑制3试虫www.bzfxw.com现场多点,室内饲仵下储存不超过1d,-20℃条不超过4试剂4.1磷酸氢二钠(4.2磷酸二氢钾(Κ4.3曲拉通Ⅺ100(T4.4乙酰硫代胆碱(A4.55,5’-二硫双硝基苯甲4.6磷酸缓冲液(0.1mol/L,pPBs):称取30.18gNazd·12H20和2.16gKH2Po4,蒸馏水定容至1000mL。4.7DTN⒊乙醇显色剂:12.4mgDTNB,加120mL95%乙醇,80mL蒸馏水,50mL磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Triton莎100)。4.8ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,—20℃避光保存。4.9ATCiDTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。5分光光度法5.1仪器设备5.1.1分光光度计。1 GB/T26348-20105.1.2恒温水浴箱。5.1.31mL玻璃组织匀浆器。5.1.4离心机(离心力10000g以上)。5.1.5加液器。5.2操作步骤5.2.1酶源的制备取成蚊5只做为1组,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入0.5mL磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Tritonr100),充分匀浆。匀浆液在4℃,5000g离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。5.2.2取6支试管,分别加人6.1.1中制各酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人0.1mL的杀虫(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附剂溶液,充分混匀,使其终浓度达到区分浓度1%。另3支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;录A表A。D,且丙酮终浓度小于再取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。5.2.3上达7支试管30℃保温5min后,分别加人0.1mLO。01mol/L乙酰硫代胆碱(ATCh),在30℃继续保温15mh后,加人3.6mLDTN⒊乙醇显色剂。5.2.4将空白对照调至仪器显示为0点,在分光光度计中于狃2nm波长下测定无药剂对照管和药剂(oD412),计算平均值。处理管的光密度值5.2.5按上述方法每个种群检测100组蚊虫。5.3结果表述www.bzfxw.com(1):测定AChE残存活性的计算见公式E=旦坠×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)oDc式中:E——AChE残存活性;oDt——药剂处理管平均光密度值oD412;—oDc—无药剂对照管平均光密度值OD砼12。5.4判别标准AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂抗性组,抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。6酶标仪法6.1仪器设备6.1.1酶标仪。6.1.2恒温水浴箱。6.1.31mL玻璃组织匀浆器。6.1.4离心机(离心力10000g以上)。6.1.5加液器。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载 GB/T26348-20106.2操作步骤6.2.1酶源的制备取成蚊1只,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液充分匀浆。匀浆液在4℃,50oog离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。6.2.2分取0.1mL6.2。l中钏备酶液到酶标板的3个孔中,再在各孔中加人0.1mL杀虫剂溶液,杀虫剂用磷酸缓冲液稀释,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见表A。D,且丙酮的终浓度不超过1%。以0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照,加人另外3个孔中。在30℃保温5min后,分别加人0.2mLATCh~DTNB混合溶液,在狃2nm测定5min时间动力学曲线,曲线的斜率作为反应初速度(v)。计箅平均值。6.2.3按上述方法每个种群检测100只蚊虫。6.3结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(2):E=坠×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)uc式中:E——AChE残存活性;——可药剂处理组平均反应初速度;——可无药剂对照组平均反应初速度。6.4判别标准AChE残存www.bzfxw.com活性大于zO%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂抗性个体,抗性个体在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。 0一GB/T26348-20100Νl由寸∞附录AωΝ(资料性附录)〓`臼常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆砝舀酶的区分浓度0表A。1给出了残杀威和敌敌畏对淡色库蚊乙酰胆碱酯葩的区分浓度。表A。1常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆礅酯酶的区分浓度区分浓度杀虫剂g/L残杀威(pr。poxuoo。0115敌敌畏(DDVP)o。0813注:敏感品系来自军事医学科学院微生物流行病研究所蚊虫养殖室淡色库蚊北京抹。www.bzfxw.com版权专有侵权必究书号:15sO66·1△2179GB/T26348-2010定价:ii。00元标准分享网www.bzfxw.com免费下载'