GBT27980-2011马病毒性动脉炎诊断技术.pdf 13页

'ICS11．220日41雷雪中华人民共和国国家标准GB／T27980--2011马病毒性动脉炎诊断技术2011-12-30发布Diagnostictechniquesforequineviralarteritis2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仅1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAc／Tc181)归口。本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室。本标准主要起草人：张念祖、杨仕标、宋建领、杜健、王金萍、朱建波、李华春。GB／T27980--201 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围马病毒性动脉炎诊断技术GB／T27980—2011本标准规定了马病毒性动脉炎诊断技术。本标准适用于马病毒性动脉炎的诊断和检疫。其中病毒分离、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、反转录聚合酶链式反应试验适用于马病毒性动脉炎的病原诊断，中和试验和酶联免疫吸附试验适用于马病毒性动脉炎的抗体检测。2临床诊断2．1流行病学马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒所引起的一种马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染病，该病只感染马属动物，主要是通过生殖系统和呼吸系统而感染传播。公马带毒后无明显临床症状，却是危险的传染源。长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。流产马的胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病。患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的马。通过用具、饲料和饲养人员的接触也能将病毒传给易感马。该病呈世界性分布，血清学试验证实，我国也存在该病。2．2临床症状患马可表现为临诊症状和亚临诊症状，大多数自然感染的马表现为亚临诊症状。试验感染潜伏期为ld～6d，野外感染普遍为3d～4d。本病的典型症状是发热，一般感染后3d～14d体温升高达4l℃，并可持续5d～9d。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿，步伐僵直，眼、鼻分泌物增加，后期为脓性粘液，发生鼻炎和结膜炎。面部、颈部、臀部形成皮肤疹块。公马的阴囊和包皮水肿，马驹和虚弱的马可引起死亡。怀孕母马流产，其流产率可达90％以上。流产发生在感染后的10d～30d，通常出现在临诊发病期或恢复早期。胎儿常在流产前就死亡，流产胎儿水肿，呼吸道粘膜和脾被膜上有出血点。母马痊愈后很少带毒，而大多数公马恢复后则成为病毒的长期携带者。这些症状并不是在同一马群中同时出现。马驹、老龄雌马和营养状况差的马，临床症状较重，孕马比空怀母马明显。除极少数患马发生死亡外，一般为轻度I临床症状。2．3病理变化死亡病例最主要的剖检变化是全身较小动脉管内肌层细胞的坏死，内膜上皮的病变导致特征性的出血和水肿以及血栓形成和梗死。常见大叶性肺炎和胸膜渗出物，发生全身性动脉炎的结果，所有浆膜和粘膜以及肺和中膈等都有点状出血。肾上腺上也有出血，在心、脾、肺、肾、怀孕母马的子宫、眼结膜、眼睑、膝关节或跗关节以下的皮下组织以及阴囊和睾丸内，均能发现出血及水肿变化。恢复期病马的慢性损害包括广泛性全身性动脉炎和严重的肾小球性肾炎。实验感染后观察到的损伤可分成3个型，即发展(渐进)型、终末(端)型及慢性活动型。从感染后4d～6d观察发展(渐进)型损伤，发现胸腹水过多，淋巴结充血肿大，结肠到盲肠脉管水肿，大肠粘膜下淋巴结肿大，还可见粘膜上皮温和坏死。终末(端)型损伤被认为是发展(渐进)型损伤的延伸，表现为皮下水肿，胸腔大量积液，全身所有淋巴结肿胀到不同程度的出血，盲肠和结肠有梗死。粘膜下严重水肿和出血，有时可见肾上腺皮质出血。病毒接种1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--201后第12天，可见慢性损伤，包括温和性淋巴结肿胀及胸腔内积液过多。实验感染后观察到的损伤的严重性很少与自然感染的损伤一样。2．4诊断依据上述流行病学特点、临床症状和病理剖检变化特征等可作出初步诊断，确诊后应该通过实验室病原学和血清学诊断。3病毒分离3．1器材和设备单道微量加样器(0．5pL～10pL、5pL～10pL、40pL～200卜L、200pL～1000PL)及滴头。一80℃冰箱，二氧化碳培养箱。组织研磨器、超声波振荡器、低速离心机、倒置显微镜。3．2试剂与材料血(采自血管)；细胞：兔肾细胞(RK一13)；细胞培养液(见附录A)。3．3病毒分离3．3．1样品的采集急性病例采取脱纤全血或沉淀白细胞层，鼻分泌物、结膜拭子或流产胎儿的体液及脾脏，被检种马的精液；尸体剖检时采取肺、脾和淋巴结，将病料置于含1000IU／mL青霉素和1000tug／mL链霉素的0．01mol／LpH7．2磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)里。这些病料应立即用冰冷却，若不立即接种，应将病料迅速冻存于一80℃冰箱。精液的采集：使用一次射精时精子数量最多的部分精液。3．3．2样品的处理组织样品用含1000Iu／mL青霉素和1000pg／mL链霉素的细胞培养液按1：10的比例，置于研磨器中剪碎并研磨。将已研磨好的待检病料，4℃1000r／min离心5min，取上清液；分泌物和排泄物样品的处理，将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，4℃1000r／min离心5rain，取上清液；精液冻融3次或超声波裂解处理(100pA、1rain2min)，用细胞培养液作1：10的稀释，4℃1000r／rain离心5rain，取上清液。将处理好的样品上清液用0．22pm滤器过滤除菌，待用。3．3．3接种细胞将样品悬液接种于RK-13细胞，每份样品接种5瓶，每瓶(生长面积25cm2)接1mL，37℃吸附1h，再加5mL维持液。将接种细胞置于37℃、5％二氧化碳条件下培养12d，每2d～3d换维持液一次。3．3．4观察与传代接种后用倒置显微镜逐日观察细胞是否出现细胞病变(CPE)，出现者收获，无CPE者再盲传3代，仍无细胞病变者弃之。3．3．5病毒增殖、分装与保存RK-13细胞上出现CPE的病毒悬液用1mL无菌小管分装，作为原始毒置于一80℃冰箱或液氮罐2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--2011中保存。将原始毒接种RK-13细胞，37℃、5％二氧化碳条件下培养并逐日观察细胞病变，70％以上细胞出现病变时收集细胞病毒液，按1mL每小管进行无菌分装，置--80℃冰箱保存备用。病毒鉴定按本标准琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法进行。4琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID)4．1材料和器械4．1．1器械：直径6Clll平皿、外径4InlTl打孔器、加样器。4．1．2阳性血清、标准马病毒性动脉炎高免血清。4．1．3阴性血清：无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清。4．1．4标准抗原：纯化浓缩的马病毒性动脉炎病毒。4．1．5待检抗原：抗原应无污染，取少量样品加最少量的无菌生理盐水磨碎后作为待检抗原；病毒分离物浓缩(用聚乙二醇8000做100倍浓缩)后亦可作为待检抗原。4．2试验方法4．2．1琼脂平皿的制作(所用试剂均为常规分析纯试剂)：见附录B。4．2．2打孔：用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平皿上打孔，孔距为3mm，打孔后用针挑出切下的孔内琼脂块。4．2．3加样：用微量加样器或毛细吸管，吸取抗原或血清加于孔内，中央孔滴加标准阳性血清，周围的第1孔、第3孔、第5孔滴加对照阳性抗原，第4孔滴加阴性抗原，第2孔、第6孔滴加样品(待检抗原)，加样量以加满不溢出为度。加样后静置10rain，放人湿盒内37℃进行反应。24h后观察并记录结果。4．3结果判定结果判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察，若对照阳性抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、明显的白色沉淀线，而对照阴性抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线则认为试验可以成立，如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立，应该重做。结果判定标准如下：a)阳性：待检抗原孔与阳性血清孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性孔的沉淀线相融合。b)阴性：待检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线，标准阳性孔抗原的沉淀线直伸被检样品的孔边，判为阴性。4．4限制性说明本方法仅用于马病毒性动脉炎(EVA)病原的普查，可能会出现非特异性反应。建议对AGID阳性样品进行进一步的病原或者核酸诊断。5反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)5．1仪器和设备PCR(聚合酶链式反应)扩增仪、台式低温离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外灯、紫外凝胶成像仪、3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--2011单道微量加样器(0．5pL～10pL、5pL～10tzL、40pL～200弘L、200pL～1000pL)及滴头，PCR仪和离心管。5．2试剂与材料5．2．1材料：细胞病毒液或病料组织、外周血液或鼻分泌物。5．2．2试剂：柱离心式小量病毒RNA＆DNA抽提试剂盒，核糖核酸聚合酶链式反应试剂盒(逆转录RNAPCRKit)，上样缓冲液(1％SDS，50％甘油和0．05％溴酚蓝)、溴化乙锭(EB)储存液(10pg／mL)、琼脂糖，DNA分子质量标准，异丙醇等均为常规分析纯试剂，电泳缓冲液(配制方法见附录c)。5．2．3引物：在马病毒性动脉炎病毒ORFlb的9282bp～9466bp片段设计引物CI：5-CCTGAGACACTGAGTCGCG"I"-3DI：5-CCTGATGCCACATGGAATCA-3扩增目的片段为184bp。5．3操作程序5．3．1样品的采集和处理样品的采集和处理参见3．3．1和3．3．2。5．3．2病毒RNA的提取按照相关病毒RNA提取试剂盒操作即可。5．3．3RT-PCR扩增将下列各成分按要求量加入PCR反应管中：RNaseFreedHz0(24pL)；lo×OneStepRNAPCRBuffer(5tLL)；25mmol／L的MgCl2(10pL)；10mmol／L的dNTPMixture(5pL)；RNaseInhibitor1肛L；AMVRtaseXLl／zL；AMV-OptimizedTaq1pL；上游引物CI(20／*mol／L)1pL；下游引物DI(20pmol／L)1tzL；模板RNAl止；同时设定阳性和阴性对照。将加有样品和对照RNA的PCR反应管放人PCR仪中，按下列程序和条件进行扩增：50℃30rain，94℃2rain，然后按照(95℃15S，42℃15S，68℃45s)反应35个循环，最后再68℃7rain。反应产物可直接电泳检测，亦可于4℃或--20℃保存待检测。5．4电泳取PCR扩增产物8pL与2止6倍上样缓冲液混合，点样于2％琼脂糖凝胶孔中，5V／cm电压进行电泳，30rain后，于紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果。5．5结果判定在对照成立的前提下，即阳性对照出现相应大小扩增带(184bp)、阴性对照无此带出现的情况下判定结果。样品若出现和阳性对照分子质量相同的特异性扩增带，即判定为阳性，否则为阴性。6酶联免疫吸附试验(ELISA)6．1器械和设备96孔高吸附力酶标板(平底，简称96孔酶标板)，单道微量加样器(o．5PL～10pL、5pL～10pL、4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--201140pL～200vtL、200pL～1000pL)及滴头，多道微量加样器(5pL～50pL、50肛L～i00pL)及滴头，8道微量连续加样器(50pL、100pL、150pL、200pL)及滴头。稀释试剂用灭菌瓶。4℃、一20℃冰箱，普通恒温培养箱。酶标读板仪、微型振荡器及磁力搅拌器。6．2试剂与材料6．2．1包被液：0．1mol／L碳酸盐缓冲液(pH9．6)，4℃保存。6．2．2酶标记羊抗马二抗(抗马IgG辣根过氧化物酶结合物)：4℃保存。6．2．3OPD(邻苯二胺)储存液；0．05％吐温一20磷酸盐缓冲液(PBST)；优质脱脂奶粉；30％过氧化氢；2mol／L硫酸(所用试剂均为常规分析纯试剂，配制方法见附录D)。6．3操作程序6．3．1将包被抗原(～20℃冰箱保存)用碳酸盐缓冲液按合适浓度稀释，每孔100pL加入96孔酶标板，置密闭湿盒中，4℃过夜。6．3．2甩干包被液，用0．02mol／LpH7．2的PBST洗各孔，甩净。6．3．3重复洗3次。6．3．4封阻，5％脱脂奶粉的0．02mol／LpH7．2PBST(PBST-SM)，每孔50pL，37℃振荡温育60min。6．3．5被检血清：将每份被检血清用含1％脱脂奶粉的0．02mol／LpH7．2PBST(PBST-SM)按1：5稀释，每份样品加一排，每孔50pL，分别用阳性血清和健康马血清作阳性和阴性对照，最后一排作空白对照。6．3．637℃振荡温育60mh。6．3．7加酶标二抗：辣根过氧化物酶标二抗用PBST-SM按1{1000稀释，每孔加50pL。6．3．837℃振荡温育60min。6．3．9用1倍PBST洗板3次，甩千。6．3．10加底物OPD：使用时按每毫升使用液加8pL30％过氧化氢混匀而用，每孔加50pL。6．3．11避光反应15rain，用2mol／L的硫酸终止反应。6．3．12在酶标读板仪上读取490rim波长的吸光度值(OD。。)，当阳性(On，。nm≥0．60)和阴性(OD。。。≤o．10)对照成立的前提下，样品孔光吸收值为阴性对照孔两倍或两倍以上时判为阳性，否则判为阴性。6．4限制性说明本方法仅用于马病毒性动脉炎(EVA)抗体的普查，可能会出现非特异性反应。建议对阳性样品进行病毒中和试验验证，以排除非特异性的阳性样品。7病毒中和试验(国际贸易指定试验)7．1器材和设备96孔组织培养板(平底，简称96孔板)，单道微量加样器(o．5,uL～10止、5pL～10止、40pL～200儿、200pL～1000pL)及滴头，多道微量加样器(5卜L～50弘L、50pL～100卜L)及滴头。4℃、--80℃冰箱，二氧化碳培养箱。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--20117．2试剂与材料7．2．17．2．27．2．37．2．47．2．5保存)。7．2．6保存)。7．2．7病毒。阳性血清：标准马病毒性动脉炎高免血清。阴性血清：无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清。细胞：兔肾细胞(RK-13)，使用浓度3．0×105个／mL。细胞生长液：MEM+10％犊牛血清+青霉素、链霉素(终浓度为100IU或100FE／mL，4℃细胞维持液：MEM-t-2％犊牛血清+青霉素、链霉素(终浓度为100IU或100Fg／mL，4℃待检血清：应无污染，4℃保存不超过30d，试验前56℃灭活30rain。7．3试验准备7．3．1病毒繁殖：应用静止培养法，在大瓶RK一13细胞形成单层后，移弃细胞培养液，接种马动脉炎病毒于单层细胞，置37℃、5％CO：培养箱中孵育1h，加新鲜细胞维持液，重置37℃、5％CO。培养箱中培养；逐日观察，待CPE达到75％以上时收毒，在--80℃和4℃间反复冻融3次，无菌离心(2000r／rain)20rain，取上清分装于ImL小管，4℃保存备用。7．3．2毒价滴定：用含10％胎牛血清、10％新鲜豚鼠补体和抗生素(1000IU／mL青霉素和1000pg／mL链霉素)的稀释液将马动脉炎病毒作101至10_6稀释，然后接种96孔微量板，每个稀释度接种8孔，每孔25pL，每孔再补加25pL细胞生长液。每孔加入RK_13细胞悬液(使用浓度3．0×105个／mL)50pL。同时设置8孔细胞对照，即用50pL细胞生长液+50pLRkl3细胞悬液。于37℃、5％CO：条件下培养细胞观察7d，在细胞对照成立的前提下，记录结果，按细胞半数感染量方法计算病毒的每25pL中所含半数组织细胞感染量(TcID5。)。7．3．3待检血清、阳性血清和阴性血清经56℃30rain灭活后，自1；2倍比稀释至1：32。7．3．4病毒工作液的配制：将待检病毒用细胞生长液稀释为每25pL含100个～1000个TCID5。，作为病毒工作液。7．4中和试验程序7．4．1病毒和血清等体积混合后置37℃孵育1h或4℃过夜。7．4．2接种96孔微量板，每组接种8孔，每孔50pL病毒和血清混合液，立即补加50pLRK-13细胞悬液(使用浓度3．0×105个／mL)。7．4．3置于37℃、5％CO。条件下培养细胞观察7d。7．4．4对照步骤如下所示：a)病毒对照：取病毒工作液，用细胞生长液作10～、10～、10一、10。四个稀释度，每个稀释度8孔，每孔25pL，加50pL细胞悬液，补生长液25”L达到总量100pL。b)细胞对照：设8孔，每孔加50pL细胞悬液，补生长液50pL达到总量100pL。c)阴性对照：设8孔，每孔加入1：2或1：10稀释的阴性血清和病毒混合液50pL，立即补加50pLRK一13细胞悬液(使用浓度3．0×105个／mL)，置于37℃、5％CO。条件下同样培养细胞观察7d。7．5结果判定7．5．1判定条件7．5．1．1细胞对照组应不出现细胞病变(CPE)。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980--20117．5．1．2病毒对照，应保证在1000个TCID。。的病毒液10_1和10。稀释度的各个孔均出现CPE，10_3有1个～3个孔出现CPE，10。8孔全无CPE。7．5．1．3阴性血清对照应全部出现CPE。7．5．2判定标准在以上对照成立的情况下，哪组阳性血清抗体滴度大于等于1：4，即判为阳性。8说明在以上的检测方法中，当检测结果不一致时，病毒中和试验为最终的判定方法。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27980—2011A．1MEM营养液的配制附录A(规范性附录)细胞培养液的制备MEM干粉9．6g去离子水1000mL充分溶解后经0．22／zm孔径微孔滤膜滤过除菌。细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10％加入灭活犊牛血清和l000Iu／mL青霉素和链霉素，然后用7．5％NaHCO。溶液调整pH至7．2左右。细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上，按2％加入灭活犊牛血清和1000Iu／mL青霉素和链霉素，然后用7．5％NaHCO。溶液调整pH至7．2左右。A．2胰酶消化液配制NaCI8gKCl0．4gKH2POa0．4gNa2HP04·12H200．08gNaHC030．35gNa2EDTA0．2gTrypsin2．5g用去离子水定容至1000mL，静置4h，用0．22btm孔径微孔滤膜滤过除菌。分装--20℃保存。 附录B(规范性附录)琼脂平板制备GB／T27980--2011琼脂糖1．0g生理盐水100mL调整pH7．4～7．6，高压消毒20rain，融化的琼脂待冷至45℃～50℃时，以无菌状态倒人直径6CtTt平皿中，每平皿约7mL，厚度约为4mm，待凝固后置4℃保存备用。 GB／T27980--2011C．150×TAE电泳缓冲液TrisNa2EDTA·2H20乙酸去离子水C．21×TAE50×TAE去离子水C．3琼脂糖凝胶10附录C(规范性附录)PCR试验用试剂溶液242g37．2g57．1mL1000mL20mL1000mL琼脂糖粉末1．5g1×TAE电泳缓冲液100mL微波炉中溶解后，冷却至60℃左右，加入EB贮液使其最终浓度为0．5}tg／mL，并充分混匀。 D．110倍PBST附录D(规范性附录)酶联免疫吸附试验用试剂溶液氯化钠(Nacl)80g氯化钾(KCl)2g磷酸氢二钠(Na。HPO。)22．9g磷酸二氢钾(KHzPO。)2g吐温一205mL加蒸馏水至1000mL磁力搅拌器搅拌充分溶解，室温放置备用。D．2PBST使用液10倍PBST蒸馏水D．3PBST-SMPBST使用液(灭菌)脱脂奶粉100mL900mL100mLlgD．40．05mol／L碳酸盐缓冲液(pH9．6包被用)碳酸钠(Na：CO。)碳酸氢钠(NaHCO。)硫柳汞加蒸馏水至高压灭菌后4℃保存备用。D．5OPD储存液1．59g2．93g0．10g1000mLGB／T27980--2011OPD(邻苯二胺)一片(30mg／片)溶解于75mL去离子水中，完全溶解后，分装成5mL／瓶，--20℃避光保存。D．62mol／L硫酸双蒸水浓硫酸160mL20mL'