GBT27981-2011牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法.pdf 8页

'ICS11．220B41瘩臼中华人民共和国国家标准GB／T27981～2011牛传染性鼻气管炎病毒实时2011-12-30发布荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionofinfectiousbovinerhinotracheitisvirus2012-06-01实施宰瞀徽紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T27981—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册}(2008版)关于牛传染性鼻气管炎／牛传染性化脓性外阴阴道炎(Chapter2．4．13)的内容。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜焱，吴晓薇。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB／T27981—2011本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒I型，BoHV一1)实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾，肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样品中BoHV-1病毒感染。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注B期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适甩于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)关于检测牛冷冻精液中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。BoHV-I：bovineherpesvirustypel，牛痘疹病毒I型。ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。DTT：DL-dithiothreitol，二硫苏糖醇。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。IBR：bovineinfectiousrhinotracheitis，牛传染性鼻气管炎。PBS：phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲生理盐水。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠。UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。4设备和器材4．1荧光PCR仪。4．2台式冷冻离心机。4。3可调微量移液器：规格10严L、100pL、200pL、1mL。4．4带滤芯微量吸头：规格lopL、100pL、200,uL、1mL。4，5PCR光学反应管。4．6微量离心管。4．7涡旋混匀器。4．8恒温培养箱。4．9冰箱：规格2℃～8℃，--20℃，--80℃。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27981—20114．10恒温水浴箱。5试剂除另有规定，本方法试验用水应按照GB／T6682中规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5．1引物与探针引物与探针配制采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100btmol／L储存液，置--20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10Fmol／L工作液，避免多次冻融。引物与探针序列：gB基因上游引物gB-F：5’TGTGGACCTAAACCTCACGGT3’gB基因下游引物gB-R：5’GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC3’gB基因探针：5’[FAM]一AGGACCGCGAGTTcTTGCCGCEBHQl]3’探针5’端标记的报告荧光基团及3’端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。5．2蛋白酶K溶液：配制方法见附录A。5．3柠檬酸钠缓冲液：配制方法见附录A。5．40．5mol／LEDTA：配制方法见附录A。5．50．01mol／LpH7．2PBS：配制方法见附录A。5．610％chelex100：配制方法见附录A。5．7lmol／LDTT：配制方法见附录A。5．82×定量PCR—UDG酶预混液：含60U／mL热启动Taq酶，40mmol／LTr碡HCl(pH8．4)，100mmol／LKCI，6mmol／LMgClz，400btmol／LdGTP，400omol／LdATP，400／zmol／LdCTP，800／zmol／LdUTP，40U／mLUDG。可采用经验证可靠的商品化预混液。5．9核酸抽提试剂盒。5．10无DNA酶、无RNA酶水。5．11无水乙醇。5．1270％乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制，一20℃预冷。5．13三氯甲烷。5．14异丙醇。6样品采集与处理6．1样品采集及前处理6．1．1采样工具采样工具需经(121±2)℃／0．1MPa高压15min并烘干，或经160℃干烤2h灭菌。6．1．2血清、全血用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清，直接用于核酸提取。用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0．5mol／LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。直接用于核酸提取。6．1．3拭子用无菌棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物，采集时，将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，蘸2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27981—2011取分泌物后，立即将棉拭子浸入1mL～2mL灭菌0．01mol／LpH7．2的PBS中，4℃储存，尽快送达实验室。取样进行检验时，充分振动、挤千拭子，浸泡液采用4000r／min离心1rain，取上清备用。6．1．4精液将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到1．5mL微量离心管中，充分解冻后，振荡混匀，采用12000r／rain离心30s，取上清按6．2．1或6．2．3进行核酸提取；或取原液按6．2．2或6．2．3提取核酸。每一批次冷冻精液取3支冻精管，分别进行核酸提取和后续检测。6．1．5组织样品剖检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结，对流产胎儿，采集刚死亡胎儿肝、肺、肾、脾和胎盘组织。检测时，用无菌剪、镊取适量样品，按1：5的比例加人灭菌0．01mol／LpH7．2的PBS(例：1g组织样品加5mL溶液)，在研钵中剪碎，充分研磨，取研磨物分装到离心管中，冻融2次～3次，4000r／min离心5min，取上清备用。6．1．6细胞培养物细胞培养物冻融2次～3次，分装到1．5mL微量离心管中，4000r／rain离心1min，取上清备用。6．2样品核酸抽提6．2．1有机溶剂抽提法适用于上述各种样品。取200pL经前处理的样品或对照，加200tIL0．01mol／LpH7．2PBS缓冲液，加SDS、蛋白酶K至终浓度分别为1％和0．5mg／mL，混匀器上振荡混匀，56℃温育30rain，置沸水浴孵育8rain)加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000r／rain，离心10rain，取上清；可重复三氯甲烷处理步骤一次；加等体积异丙醇(一20℃预冷)，振荡混匀；4℃，13000r／rain离心10rain，弃上清；加等体积70％乙醇，振荡混匀，4℃，13000r／min离心10rain；小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)，在洁净工作台室温干燥5rain；加入50pL无DNA酶、无RNA酶水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，室温放置10rain，直接用于检测，或贮一20℃备用。长期贮存，应置一80℃或更低温度。6．2．2Claelex100提取法采纳世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)操作程序，适用于精液样品。在微量离心管中，加人10％chelexl00溶液100sL，蛋白酶K(10mg／mL)11．5pL，1mol／LDTT7．5pL，90pL无DNA酶、无RNA酶水，10pL精液样品，充分混匀；置56℃温育30min，充分振荡混匀10s；置沸水浴孵育8min，充分振荡混匀108；用12000r／rain离心3min，取上清直接用于检测，或贮--20℃备用。长期贮存，应置--80℃或更低温度。6．2．3试剂盒抽提法可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。7实时荧光PCR检测7．1对照设立7．1．1样品设置要求：从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。7．1．2阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27981—2011质粒DNA添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。7．1．3阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。7．1．4空白对照：在扩增反应阶段设置。以无DNA酶、无RNA酶水作为模板设置空白对照。7．2实时荧光PCR检测7．2．1加样反应体系采用25pL反应体积，其中，含2×定量PCR-UDG预混液12．5pL，上、下游引物各200nmol／L，探针100nmol／L，模板5pL(100pg～1pg)，补加适量无DNA酶、无RNA酶水使反应总体积达25pL。加完样后，盖紧管盖，混匀，低速瞬时离心，使反应液集中管底。7．2．2扩增反应反应参数设置：——一50℃2min：——95℃2min：一95℃15s，60℃45s，45个循环，荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行。荧光素或检测通道设置：采用FAM通道或将报告荧光(reportdye)设定为FAM，采用其他报告荧光应按仪器说明对应设定通道；淬灭荧光(quenchdye)设定为None，校准荧光(referencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。7．2．3结果判定7．2．3．1结果分析条件设定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。7．2．3．2质控阴性对照和空白对照应无ct值，阳性对照的ct值应≤30且出现典型的扩增曲线。如对照不满足以上条件，此次实验视为无效。7．2．3．3荧光PCR反应结果判定在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定，检测结果呈现无ct值的反应判为阴性反应。阳性反应结果判定，检测结果呈现ct值≤35且扩增曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。对于35