DAT26-2000挥发性档案防霉剂防霉效果测定法.pdf 14页

'DA中华人民共和国档案行业标准DA/T26-2000挥发性档案防霉剂防霉效果测定方法2000-12-06批准2001-01-01实施中华人民共和国国家档案局发布 目录1范围...........................................................................................................................12测试用品与设备.......................................................................................................12·1用品..............................................................................................................12·2设备..............................................................................................................23测试条件...................................................................................................................24测试方法...................................................................................................................35结果测定...................................................................................................................5附录A..........................................................................................................................6Al培养基的配制..................................................................................................6A2霉菌培养基配方..............................................................................................7附录B..........................................................................................................................8Bl玻璃器皿的清洗...............................................................................................8B2玻璃器皿的灭菌...............................................................................................8附录C........................................................................................................................10C1步聚................................................................................................................10C2要求................................................................................................................10C3计数................................................................................................................11附录D........................................................................................................................12Dl接种................................................................................................................12D2保藏................................................................................................................12I 中华人民共和国行业标准DA/T26-2000挥发性档案防霉剂防霉效果测定方法1范围本标准规定了挥发性档案防霉剂防霉效果测试材料、仪器设备、测试条件、测试方法、结果评定等内容。本标准适用于挥发性档案防霉剂防霉效果的测定。2测试用品与设备2·1用品2·1·1培养基2·1·2供试菌种2·1·3受试底物2·1·4医用喷雾器2·1·5医用剪刀2·1·6医用纱布2·1·7小试管(15mm╳15Omm)2·1·8培养皿(90mm)2·1·9移液管(吸管)(1mL)中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施1 DA/T26-20002·1.10三角烧瓶(25OmL、5OOmL)2·1·11烧杯(25OmL、5OOmL、10OOmL)2·1·12量筒(1OOmL、5OOmL、10OOmL)2·1·13带盖的圆柱形玻璃器皿(容积约为12OOmL)2·2设备2·2·1手提医用消毒器2·2·2架盘天平2·2·3电热干燥箱2·2·4恒温恒湿培养箱2·2·5电冰箱2·2·6无菌操作台或无菌室3测试条件3·1温度28℃±2℃。3·2湿度RH≥93%。3·3培养基土豆汁培养基(配方见附录A)。3·4菌种杂色曲霉(AspergillusVersicolor)黑曲霉(Aspergillusniger)产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)桔青霉(Penicilliumcitrinum)中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施2 DA/T26-2000球毛壳霉(Chaetomiumglobasum)腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)绿色木霉(Trichodermaviride)宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)3·5菌量(见附录C)混合孢子悬浮液浓度:1╳lO5个/mL～1╳lO7个/mL。3·6底物宣纸、卡纸、书写纸、牛皮纸、漆纸、漆布(尺寸大小为2Omm╳3Omm)，胶片、录像带(尺寸大小为自然宽度╳3Omm)。3·7药量10OOmL体积中悬挂1.Og(即10OOmg)药物。3·8时间放置28天。4测试方法4·1消毒器皿先用清水中加入数滴洗涤剂的洗洁液浸洗圆柱玻璃器皿，再用清水冲洗，最后用75%乙醇涂擦消霉，待干，备用。4·2准备无菌水准备好带玻璃珠的无菌生理盐水和不带玻璃珠的无菌水若干瓶。即在25OmL三角瓶中注人1OOmL生理盐水，并放人几十粒玻璃珠，灭菌(参见附录B)。在25OmL三角瓶中注人2OOmL自来水，同样灭菌。4·3制备霉菌孢子悬浮液(见附录D)中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施3 DA/T26-2000在无菌室或无菌操作台，在火焰旁，用接种环分别挑取8株供试霉菌，接人带上述玻璃珠的无菌生理盐水中，用手振荡3min～5min，使孢子充分分散，复制成1╳lO5个/mL～1╳lO7个/mL的霉菌孢子悬浮液，备用。4·4放置样品(见图1)4·4·1在适当的玻璃器皿内，悬挂受试底物，并喷洒霉菌孢子悬浮液(以表面湿润为宜)，晾干，备用。4·4·2在圆柱形玻璃器皿底部倒人2OOmL左右的无菌水(其目的是保持湿度，同时占去多余容积，使玻璃器皿内的空间容积正好为10OOmL。4·4·3将1.0g挥发性防霉剂用二层纱布或无纺布包裹后悬挂于玻璃器皿中央部位。4·4·4在防霉剂周围悬挂受试底物(间隔至少1cm，不能相互接触)4·4·5将玻璃器皿瓶口用盖子盖紧(或用透明复合塑料膜包扎)，保持密封。4·4·6将玻璃器皿置于恒温恒湿培养箱内，在28℃±2℃，RH≥95%条件下，培养28天。4·5空白对照在圆柱形玻璃器皿中央部位不悬挂挥发性防霉剂，重复上述步聚，作空白对照。当空白对照容器内的受试底物发霉严重时(即长霉程度++～+++)，测试有效，否则必须重做。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施4 DA/T26-2000图15结果测定用肉眼观察长霉程度并进行等级评定(见表1)。表1长霉程度和等级菌丝生长情况长霉程度长霉等级试样表面看不到菌丝生长-0级试样表面看到菌丝生长，但菌丝生长+1级面积不超过全面积的三分之一试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面积超过全面积的三分之一，但不超过++2级全面积的三分之二试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面+++3级积超过全面积的三分之二提示:长霉等级0级表示挥发性防霉剂防霉效果很好，1级表示效果较好，2级表示效果较差，3级表示效果很差。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施5 DA/T26-2000附录A(标准的附录)培养基的配制与灭菌Al培养基的配制培养基从形式区分有固体培养基和液体培养基:从内容区分有合成培养基和天然培养基等。其配制步聚为:a)物料称量明确培养基的组成部分，根据需要配制的量计算好各成分的重量，逐一称取。b)溶解一般情况下，可将几种原料和药品一起放大烧杯内调匀，并定容到需要的体积。c)调节pH微生物生长需要合适的pH，通常用1mol/L(1N)NaOH，1mol/L(1N)HCl或0.5mol/L(lN)H2S04调节pH至5.0。调节时要慢慢滴入，不断用pH试纸检查，至所需要的pH为止。d)加热溶解配制固体培养基一般加入2%的琼脂(俗称洋菜)，与培养基一起加热溶解。加入琼脂后，须不断搅拌，以免琼脂粘底烧焦。e)过滤一般来说，培养基配制好后要过滤，滤去不溶物或块状物。过滤必须趁热进行，通常用4～6层纱布作滤层。无不溶物或块状物的培养基也可以不过滤。f)分装中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施6 DA/T26-2000按照需要，分装进试管、培养皿或三角烧瓶中。一般只装到试管的1/5，培养皿中装入15mL～2OmL，三角烧瓶装入一半量。g)加棉花塞或纱布、绒布扎口培养基灌装后，应在试管口或三角烧瓶口上加棉花塞或纱布、绒布扎口，其作用有二:一是阻止外界微生物进入，二是保证有良好的通气，以便微生物能不断获得无菌空气。h)包扎棉塞塞好后，试管扎成捆，同时在外面包扎上一层牛皮纸。三角烧瓶口也用牛皮纸包扎好，以防灭菌时冷凝水浸湿棉塞和灭菌后的灰尘侵入。i)灭菌2一般情况下，培养基配制好后应立即灭菌，于1kg/cm压力下消毒3Omin即可。如不及时灭菌，则应放人冰箱内保存。灭菌时，必须先将压力器内的空气排放干净，否则，即使压力到了所规定的数值，还是达不到所需要的温度。j)定形固体培养基温度降到一定程度时便凝固成形。A2霉菌培养基配方霉菌培养基配方有多种，本标准采用土豆汁培养基，配方如下:土豆(去皮)200g、水10OOmL、琼脂20g、pH5.0将土豆洗净去皮，称取200g，切成小块，加10OOmL水煮沸1h，用双层纱布滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施7 DA/T26-2000附录B(提示的附录)玻璃器皿的清洗与灭菌Bl玻璃器皿的清洗对买来的新试管、移液管、培养皿、三角烧杯、烧杯等玻璃器皿，先用水冲洗，然后放在5%的碱溶液内洗刷，再放在3%的盐酸溶液内中和，最后用水冲洗，晾干或烘干即可。培养或污染过微生物的玻璃器皿，在洗涤之前，必须先进行消毒。一般采用高压灭菌，也可用常压煮沸或其他化学药品消毒。消毒后，将脏的培养物或其他污染物去掉，然后用清水冲洗，再在肥皂水中洗刷，最后用清水冲洗干净，晾干或烘干即可。遇有不易洗刷干净的玻璃器皿，则可用硫酸重铬酸钾洗液浸渍后再清洗。其配方是:粗硫酸9OOmL，重铬酸钾(粗制)1OOg，自来水1OOmL。配制顺序是:先将自来水和重铬酸钾置于烧杯中，加热溶化，待冷却后，再以细流加入硫酸即可。若玻璃器皿上有橡皮胶、封蜡、凡士林等物时，应另外处理，然后再按上述清洗过程洗涤。B2玻璃器皿的灭菌微生物试验中所用的玻璃器皿都可以采用高压灭菌。清洗干净的玻璃器皿晾干或烘干后分别进行封口、包扎，然后灭菌。培养皿一般用牛皮纸包裹(10套一包)，用线扎牢，或装入特制的铝皮盒内。试管应先加棉花塞(采用脱脂棉)，棉塞的大小松紧要适宜，以便操作时易于拔取和塞回。最后装进试管筐内，上面包以牛皮纸。吸管(移液管)管口应先塞少许棉花，以免使用不慎将微生物吸入口中或橡皮吸球内。然后每支吸管都先用薄纸包中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施8 DA/T26-2000卷，每10支吸管用牛皮纸包扎好。三角烧瓶瓶口用绒布(或几层纱布)及牛皮纸包扎好。其他玻璃器皿也都用牛皮纸包裹后再进行灭菌。准备工作做好后，将玻璃器皿置高压灭菌器内，在1kg/cm2压力下消毒45min即可。灭菌后，取出，烘干，备用。试管、培养皿、三角烧瓶等玻璃器皿以及金属用具也可施行干热灭菌。先用水洗涤干净，待干燥后塞上棉花或绒布，用牛皮纸包扎好，置电热干燥箱内，加热至15O℃～170℃，约保持1h～2h。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施9 DA/T26-2000附录C(提示的附录)活菌计数C1步聚a)用灭菌吸管吸取1mL霉菌孢子悬浮液注入9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液体)，充分混匀，制成1:10稀释菌液。b)用灭菌吸管吸取1mL1:10的霉菌孢子稀释液注入到另一支9mL灭菌生理盐水试管中，充分混匀，使成1:100稀释菌液。c)根据霉菌孢子悬浮液的浓度，用同样方法，制成1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000,1:10000000等稀释菌液(每次稀释应更换一支来菌吸管)。d)用灭菌吸管吸取上述稀释液各1mL分别注入灭菌培养皿中，每种稀释度应做3～5块培养皿。e)将溶化并冷却至450C左右的霉菌琼脂培养基放人各培养皿内(每皿约15mL～2OmL)，随即晃动培养皿，使菌液与培养基充分混合，平放，待凝固。f)将培养基凝固后的培养皿置于280C±20C的恒温培养箱内培养2～3天，取出，观察菌落并计数。C2要求操作必须在无菌室或无菌箱内进行。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施10 DA/T26-2000C3计数用肉眼观察，点数菌落数。由于霉菌不同于细菌和酵母，其菌落大，且扩展快，故计数时依每皿5～10个菌落为宜，少于或超过这一数字的培养皿可不作计数。每种稀释度的3～5块培养皿取其平均值。应使用下列公式:式中X=(S/N)·M(个/mL)X——每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数；S——稀释度培养皿上出现的菌落总数；N——培养皿的数目；M——稀释倍数。示例:1:10000000(即1╳10-7)稀释度5块培养皿上出现的菌落数分别为6、10、7、9、8，则每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数为:X=[(6+10+7+9+8)/5]╳lO000000=80000000个/mL，即8╳107个/mL中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施11 DA/T26-2000附录D(提示的附录)菌株接种与保藏Dl接种菌株接种常用接种环或接种针。接种过程必须执行严格的无菌操作，通常在无菌室或无菌操作台上进行，并靠近火焰(煤气灯或酒精灯)操作。斜面接种是从已生长好的菌种斜面上用接种环(或针)挑取少许菌落，把它们移接到另一支新鲜斜面培养基上。具体步聚是:手持试管斜面→旋松棉塞→取接种环→拔棉花塞→环灼烧冷却→挑取菌种→接种→塞棉花塞→接种环灭菌。将接种过的斜面培养基置于28oC±2oC恒温中培养，3～5天后取出。D2保藏菌种保藏方法有多种，常用的是斜面菌种保藏法。霉菌一般保藏在土豆琼脂斜面或察氏琼脂斜面。通常存放于20C～40C的冰箱或冰库中，用此法可保存3个月，即3个月以后必须重新移植一次。中华人民共和国国家档案局2000-12-06发布2001-01-01实施12'