DB11T828.1-2011实验用小型猪微生物学等级及监测.pdf 11页

'ICS65.020.30B44备案号：DB11北京市地方标准DB11/T828.1—2011实验用小型猪第1部分：微生物学等级及监测ExperimentalminipigPart1：Microbiologicalstandardsandsurveillance2011-11-10发布2012-03-01实施北京市质量技术监督局发布 DB11/T828.1—2011目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................24微生物学等级分类...................................................................25检测要求...........................................................................26检测程序...........................................................................37检测方法...........................................................................48检测规则...........................................................................59结果判定...........................................................................610判定结论..........................................................................6附录A（资料性附录）猪圆环病毒2型ELISA抗体检测....................................7I DB11/T828.1—2011前言DB11/T828的本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。DB11/T828《实验用小型猪》分为六个部分：——第1部分：微生物学等级及监测；——第2部分：寄生虫学等级及监测；——第3部分：遗传质量控制；——第4部分：病理学诊断规范；——第5部分：配合饲料；——第6部分：环境及设施。本部分为DB11/T828的第1部分。本部分由北京市科学技术委员会提出并归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：中国食品药品检定研究院、中国动物疫病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心、北京实验动物研究中心。本部分主要起草人：贺争鸣、田克恭、范薇、巩薇、遇秀玲、付瑞、卢胜明。II DB11/T828.1—2011实验用小型猪第1部分：微生物学等级及监测1范围DB11/T828的本部分规定了实验用小型猪微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定、判定结论等。本部分适用于实验用小型猪微生物学等级监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.8实验动物支原体检测方法GB/T14926.46实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T16551猪瘟诊断技术GB/T18090猪繁殖与呼吸综合症诊断方法GB/T18638流行性乙型脑炎诊断技术GB/T18641伪狂犬病诊断技术GB/T18646动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18935口蹄疫诊断技术GB/T19200猪水泡病诊断技术GB/T19915.1猪链球菌2型平板和试管凝集试验操作规程GB/T19915.2猪链球菌2型分离鉴定操作规程GB/T19915.3猪链球菌2型PCR定型检测技术GB/T19915.7猪链球菌2型荧光PCR检测方法GB/T21674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法GB/T22333日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T22917猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法NY/T537猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术NY/T541动物疫病实验室检验采样方法NY/T545猪痢疾诊断技术NY/T546猪萎缩性鼻炎诊断技术NY/T548猪传染性胃肠炎诊断技术NY/T550动物和动物产品沙门氏菌检测方法NY/T564猪巴氏杆菌病诊断技术NY/T679猪繁殖和呼吸综合症免疫酶试验方法1 DB11/T828.1—2011SN/T1379.1猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验SN/T1445动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验SN/T1446.1猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验SN/T1919猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用小型猪experimentalminipig经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，12月龄体重不超过35kg，用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的小型猪。3.2普通级小型猪conventional(CV)minipig不携带所规定的重要人兽共患病病原和猪烈性传染病病原。3.3清洁级小型猪clean(CL)minipig除普通级应排除的病原外，不携带所规定的对猪危害大和对科学研究干扰大的病原。3.4无特定病原体级小型猪specificpathogenfree(SPF)minipig除清洁级应排除的病原外，不携带所规定的潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。4微生物学等级分类实验用小型猪微生物学等级分为普通级、清洁级和无特定病原体级。5检测要求5.1临床观察外观检查无异常。5.2微生物检测项目各等级实验用小型猪病原微生物检测项目见表1。2 DB11/T828.1—2011表1各等级实验用小型猪病原微生物检测项目动物等级微生物检测要求无清普口蹄疫病毒Footandmouthdiseasevirus▲特洁通猪瘟病毒Classicalswinefevervirus▲定级级猪繁殖与呼吸综合征病毒Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome病virus▲原乙型脑炎病毒Japaneseencephalitisvirus▲体布鲁氏菌Brucellaspp●级皮肤病原真菌Pathogenicdermalfungi●钩端螺旋体Leptospiraspp○伪狂犬病病毒Pseudorabiesvirus●猪痢疾蛇样螺旋体Serpul-Mahyodysenteriae●支气管败血波氏杆菌Bordetellabronchiseptica●多杀巴氏杆菌Pasteurellamultocida●肺炎支原体Mycoplasmahyopneumoniae●猪细小病毒Porcineparvovirus●猪圆环病毒2型Porcinecircovirustype2●猪传染性胃肠炎病毒Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus●猪水泡病病毒Swinevesiculardiseasevirus○猪胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilluspleuropeumoniae,●沙门氏菌Salmonellaspp○猪链球菌2型Streptococcussuistype2○注：▲必须检测，普通级可以免疫，清洁级和无特定病原体级不能免疫；●必须检测；○必要时检测5.3检测项目分类5.3.1必检项目在进行实验用小型猪质量评价时必须检测的项目。5.3.2必要时检测项目申请生产许可证、从国外引进实验用小型猪和疑有该病原体感染时必须增加检测的项目。6检测程序检测程序见图1。3 DB11/T828.1—2011编号外观检查采样*耳后、背部毛发或皮屑采血鼻拭子、肛拭子（或新鲜粪便）检测结果判定判定结论*：结合临床症状和实验室检查结果，需要进一步确证时，可取特定样本进行检测。图1检测程序7检测方法检测方法见表2。表2实验用小型猪病原微生物检测方法微生物方法口蹄疫病毒GB/T18935；GB/T22915猪瘟病毒GB16551；SN/T1379.1猪繁殖与呼吸综合征病毒GB/T18090；NY/T679乙型脑炎病毒GB/T18638；GB/T22333；SN/T1445伪狂犬病病毒GB/T186414 DB11/T828.1—2011表2实验用小型猪病原微生物检测方法（续）微生物方法猪细小病毒SN/T1919猪圆环病毒2型GB/T21674；附录A猪传染性胃肠炎病毒NY/T548猪水泡病病毒GB/T19200；GB/T22917布鲁氏菌GB/T18646皮肤病原真菌GB/T14926.4猪痢疾蛇样螺旋体NY/T545支气管败血波氏杆菌NY/T546多杀巴氏杆菌NY/T546；NY/T564肺炎支原体GB/T14926.8猪胸膜肺炎放线杆菌NY/T537钩端螺旋体GB/T14926.46沙门氏菌NY/T550猪链球菌2型GB/T19915.1～3；GB/T19915.78检测规则8.1检测频率每6个月至少检测一次。8.2抽样8.2.1方式选择6月龄以上的实验用小型猪用于检测，随机抽样。8.2.2数量根据实验用小型猪群体大小，抽样数量见表3。表3抽样数量群体大小（头）抽样数量＜100不少于5头100～500不少于10头＞500不少于15头8.2.3方法8.2.3.1按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。8.2.3.2采样方法按照NY/T541进行。8.3样本要求5 DB11/T828.1—2011样本要求有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量及检测项目等内容，安全送达实验室。9结果判定9.1抗体检查免疫项目，群体免疫合格率≥70%，判为合格。非免疫项目，血清抗体阴性判为合格。9.2抗原和核酸检查未见阳性结果判为合格。10判定结论所有项目的检测结果均合格，判为符合相应的等级标准。否则，判为不符合相应的等级标准。6 DB11/T828.1—2011A附录A（资料性附录）猪圆环病毒2型ELISA抗体检测A.1原理采用猪圆环病毒2型ORF2合成肽抗原包被微孔板，加入稀释的待检血清，经温育后，若样品中含有特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后，加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶标二抗，在孔中加入TMB底物液，与酶反应产生蓝色产物，加入HF溶液终止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。A.2样品采集A.2.1样品类型猪血清。A.2.2样品采集无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血3mL～5mL，置于试管中，分离血清，待检。A.3操作步骤A.3.1用样品稀释液将待检样品40倍稀释后加入预包被的抗原板孔中，每孔加100μl。阴、阳性对照各设2孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30min。A.3.2甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，300μl/孔，每次静置3min后倒掉，最后一次洗涤后在干净吸水纸上拍干。A.3.3每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30min。A.3.4洗涤3次，方法同A.3.2。A.3.5每孔加底物A液、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min。A.3.6每孔加终止液50μl，10min内测定结果。A.4结果判定A.4.1肉眼判定“++++”深度蓝色，液体不透明；“+++”蓝色，液体微透明；“++”中度蓝色，液体透光；“+”浅蓝色，液体透明；“－”无色，液体完全透明。以显色“++”以上判为阳性。A.4.2酶标仪判定A.4.2.1以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值≥0.6，阴性对照孔平均OD630值＜0.2。7 DB11/T828.1—2011A.4.2.2样品OD630值＞0.42，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD630值＜0.38，判为阴性。________________________8'