DB11T829-2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法.pdf 23页

'ICS65.020.20B21备案号：DB11北京市地方标准DB11/T829—2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法MethodsofidentifyingvarietalpurityandgenuinenessofChinesecabbagebyusingmolecularmarkers2011-11-10发布2012-03-01实施北京市质量技术监督局发布 DB11/T829—2011目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语与定义.........................................................................14原理...............................................................................25仪器设备及耗材.....................................................................26试剂和溶液配制.....................................................................27引物选用原则及筛选方法.............................................................38操作步骤...........................................................................49检测结果...........................................................................6附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法..............................................8附录B（资料性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列.......................11附录C（资料性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列........................13附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法.........................................15附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法...................................17附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法.................................19I DB11/T829—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市种子管理站。标准主要起草人：田雷、赵山普、贾希海、赵青春、彭瑞迪、王辉、福德平、高勇、张连平、黄寰。II DB11/T829—2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法1范围本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。本标准适用于结球白菜和不结球白菜常规种子、杂交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1SSR标记simplesequencerepeatmarker，SSR简单重复序列（SSR）,又称短串联重复序列或微卫星序列，它是一类以1bp～5bp的短核苷酸序列为基本单位串联重复状分布于整个基因组内的重复序列。3.2ISSR标记intersimplesequencerepeatmarker，ISSR内部简单重复序列(ISSR)，是利用包含重复序列并在3’端或5’端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶的作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，使引物得以延伸。然后不断重复变性、退火和延伸这一循环过程，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。3.4引物primer1 DB11/T829—2011在DNA合成反应时，提供3’－OH末端作为DNA合成的起点,能够与DNA模板特定区域特异结合的多核苷酸单链。4原理简单重复序列（SSR）和内部简单重复序列(ISSR)广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点的重复单位或序列会因为品种的不同而存在遗传结构上的差异，这些差异表现为多态性。针对重复单位或序列的不同，设计相应的SSR引物和ISSR引物，通过PCR技术进行扩增、电泳、染色，形成白菜品种的SSR和ISSR指纹图谱，进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。5仪器设备及耗材5.1仪器设备5.1.1天平(感量0.0001g、0.001g、0.01g、0.1g）。5.1.2水浴锅(0℃～100℃）。5.1.3微波炉（额定功率800W）。5.1.4酸度计。5.1.5磁力搅拌器。5.1.6高速台式离心机（12000r/min）。5.1.7高压灭菌锅。5.1.8冰箱（最低温度-20℃）。5.1.9微量加样枪（0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）。5.1.10PCR扩增仪。5.1.11紫外成像仪。5.1.12紫外分光光度计。5.1.13水平仪。5.1.14高压电泳仪（0V～3000V、0mA～400mA、额定功率400W）。5.1.15电泳槽。5.1.16染色盒（55cm×38cm×8cm）。5.1.17水平摇床。5.1.18胶片观察灯。5.1.19数码照相机。5.2耗材离心管（0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL）、枪头（10µL、200µL、1mL）、96孔PCR板、一次性手套、夹子、吸水纸、玻璃棒等。6试剂和溶液配制6.1试剂除另有规定外，仅使用分析纯试剂。6.1.1乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）。2 DB11/T829—20116.1.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）。6.1.3盐酸（HCl）。6.1.4硼酸（H3BO3）。6.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。6.1.6氯化钠（NaCl）。6.1.7乙酸钠（NaAc）。6.1.8Tris-饱和酚。6.1.9三氯甲烷。6.1.10异戊醇。6.1.11异丙醇。6.1.12无水乙醇。6.1.13四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTP。6.1.14TaqDNA聚合酶。6.1.1510×PCR缓冲液。6.1.16DNA标准分子量标记（Marker）。6.1.17SSR引物。6.1.18ISSR引物。6.1.19丙烯酰胺。6.1.20N，N’－亚甲基双丙烯酰胺。6.1.21N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED）。6.1.22过硫酸铵[(NH4)2S2O8]。6.1.23尿素。6.1.24亲水硅烷（bind-silane）。6.1.25疏水硅烷（repel-silane）。6.1.26甲酰胺。6.1.27溴酚蓝。6.1.28二甲苯青FF。6.1.29冰乙酸（HAc）。6.1.30硝酸银（AgNO3）。6.1.31甲醛。6.1.32琼脂糖。6.1.33蔗糖。6.1.34溴化乙锭（EtBr）。6.1.35超纯水。6.1.36蒸馏水。6.2溶液配制按照附录A的规定配制溶液。7引物选用原则及筛选方法7.1引物选用原则3 DB11/T829—20117.1.1应优先选用核心引物库中的引物。当不能满足需求时，可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。7.1.2当自行筛选适宜品种纯度检测的SSR引物时，应遵循扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲互补带型，条带清晰、重复性好的原则。7.1.3当自行筛选适宜真实性鉴定的ISSR引物时，应遵循扩增后的ISSR电泳谱带多态性高，条带清晰、重复性好的原则。7.2引物筛选方法7.2.1自行筛选用于品种纯度检测的SSR引物时，选取有代表性的杂交种种子10粒及父母本种子各5粒。利用一系列SSR引物进行试验，根据扩增后的杂交种电泳谱带含有双亲互补带型，条带清晰、重复性好的原则，确定适宜的引物。7.2.2自行筛选用于真实性检测的ISSR引物时，选取有代表性的常规种子或杂交种种子5粒～10粒及至少10个以上不同品种。利用一系列ISSR引物进行试验，根据扩增后的常规种或杂交种电泳谱带多态性高，条带清晰、重复性好的原则，确定适宜的引物。7.3核心引物库7.3.1白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列参见附录B。7.3.2白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列参见附录C。8操作步骤8.1纯度检测8.1.1样品DNA的提取使用种子直接提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.5的规定，从送检样品中随机数取100粒种子作为试样；使用幼苗提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.4的规定，从净种子中随机数取一定数量种子（保证100株幼苗）作为试样，进行幼苗培养。按照附录D规定的方法提取样品DNA。8.1.2SSR-PCR扩增8.1.2.1SSR-PCR反应体系SSR-PCR反应的总体积为20uL，反应体系见表1。表1SSR-PCR反应体系试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积超纯水—10.7µL10×PCR缓冲液1×2µL25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L2µL2.5mmol/LdNTP混合溶液0.25mmol/L2µL10µmol/L上、下游引物溶液0.5µmol/L1µL5U/µLTaq酶1.5U/管0.3µLDNA模板10ng/µL～50ng/µL2µL4 DB11/T829—2011表1SSR-PCR反应体系（续）试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积总体积—20µL备注如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积超纯水。8.1.2.2SSR-PCR反应程序参数SSR-PCR反应程序参数见表2。表2SSR-PCR反应程序参数程序SSR-PCR反应温度、时间循环数预变性95℃，5min1个循环变性：94℃，45s10个循环，退火温度每1降落PCR退火：60℃～51℃，1min循环下降1℃延伸：72℃，1.5min变性：94℃，45s35个循环扩增退火：50℃，45s延伸：72℃，1min最终延伸72℃，7min1个循环保存4℃，无限长1个循环注：使用不同的PCR扩增仪，应对仪器进行调整。8.1.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录E规定的方法，进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。8.2真实性鉴定8.2.1样品DNA的提取使用种子直接提取DNA进行鉴定的样品数量，按照GB/T3543.5的规定，从送检样品和标准样品中各随机数取10粒种子作为试样；使用幼苗提取DNA进行鉴定的样品数量，按照GB/T3543.4的规定，从净种子和标准样品中各随机数取一定数量种子（保证10株幼苗）作为试样，进行幼苗培养。按照附录D规定的方法提取样品DNA。8.2.2ISSR-PCR扩增8.2.2.1ISSR-PCR反应体系ISSR-PCR反应的总体积为20uL，反应体系见表3。5 DB11/T829—2011表3ISSR-PCR反应体系试剂ISSR-PCR终浓度ISSR-PCR体积超纯水—10.7µL10×PCR缓冲液1×2µL25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L2µL2.5mmol/LdNTP混合溶液0.25mmol/L2µL10µmol/L引物溶液0.5µmol/L1µL5U/µLTaq酶1.5U/管0.3µLDNA模板10ng/µL～50ng/µL2µL总体积—20µL备注如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积超纯水。8.2.2.2ISSR-PCR反应程序参数ISSR-PCR反应程序参数见表4。表4ISSR-PCR反应程序参数程序ISSR-PCR反应温度、时间循环数预变性95℃，5min1个循环变性：94℃，1min10个循环，退火温度每1降落PCR退火：63℃～54℃，1min循环下降1℃延伸：72℃，1.5min变性：94℃，1min35个循环扩增退火：53℃，1min延伸：72℃，1.5min最终延伸72℃，7min1个循环保存4℃，无限长1个循环注：使用不同的PCR仪，应对仪器进行调整。8.2.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录F规定的方法，进行5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。9检测结果9.1纯度计算鉴定SSR电泳谱带带型的一致性，计数供检样品种子粒数（株数）和非本品种种子粒数（株数），并按下列公式计算电泳测定值（品种纯度）：供检种子粒数（株数）-非本品种种子粒数（株数）品种纯度（%）=´100.........(1)供检种子粒数（株数）6 DB11/T829—20119.2真实性判定9.2.1对供检样品与标准样品的20个ISSR引物位点的DNA指纹谱带数据进行比较：——引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；——引物位点差异＝1，判定两个品种为相近品种；——引物位点差异＝0，判定两个品种为疑同品种。9.2.2对相近品种和疑同品种，利用供检样品与标准样品的40个引物位点的DNA指纹谱带数据进行比较：——引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；——引物位点差异＝1，判定两个品种为近似品种；——引物位点差异＝0，判定两个品种为相同品种或极近似品种。7 DB11/T829—2011AA附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法A.1DNA提取溶液的配制A.1.11mol/LTris-HCl(pH8.0)称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）121.1g溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至8.0后，加蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌。A.1.20.5mol/LEDTA(pH8.0)称取乙二胺四乙酸二钠盐（EDTANa2·2H2O）186.1g溶于800ml蒸馏水中,用NaOH调节pH值至8.0（约需NaOH颗粒20g），加蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌。A.1.320％十二烷基硫酸钠（SDS）称取十二烷基硫酸钠（SDS）20g缓慢加入到60ml蒸馏水中，边加热边搅拌，完全溶解后加蒸馏水定容至100ml。A.1.41%SDS-DNA提取液称取氯化钠（NaCl）58.44g溶于700mL蒸馏水中，加入20％十二烷基硫酸钠（SDS）50mL，1mol/LTris-HCl(pH8.0)100mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，加蒸馏水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.5饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(25:24:1)25份饱和酚:24份氯仿:1份异戊醇（v/v）A.1.670％乙醇溶液30份水:70份无水乙醇（v/v）A.1.7TE缓冲液（pH8.0）取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，加蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌。A.1.83mol/L乙酸钠溶液称取乙酸钠（NaAc）40.8g溶于80ml蒸馏水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，加蒸馏水定容到100ml，高压灭菌。A.2PCR扩增试剂配制A.2.1dNTP溶液8 DB11/T829—2011用超纯水分别配制ATP、GTP、CTP、TTP终浓度为100mmol/L的储存液，各取20μL混合，加入720μL超纯水定容至终浓度2.5mmol/L的工作液（也可直接购买2.5mmol/L的dNTP商品溶液），-20℃保存。A.2.210µmol/L引物溶液用超纯水或TE缓冲液分别配制上、下游引物至终浓度为20µmol/L的储存液，等体积混合成10µmol/L引物溶液。A.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配制A.3.16倍变性加样缓冲液量取甲酰胺49mL，加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青FF0.125g，混匀。A.3.26倍非变性加样缓冲液称取蔗糖40g溶于99ml去离子水中，加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青FF0.125g，混匀。A.3.310×TBE缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）108g，硼酸55g，加适量去离子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）37mL，去离子水定容至1000mL。A.3.46%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取57g丙烯酰胺，3gN，N’-亚甲基双丙烯酰胺，420.42g尿素，倒入1000mL烧杯中，加入700mL去离子水溶解后，加入100mL10×TBE溶液，加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤。A.3.55%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液称取48.14g丙烯酰胺，1.66gN，N’-亚甲基双丙烯酰胺，倒入1000mL烧杯中，加入700mL去离子水溶解后，加入100mL10×TBE溶液，加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤。A.3.6亲和硅烷（bind-silane）缓冲液量取无水乙醇49.75mL和冰乙酸250µL，混匀。A.3.70.5%亲和硅烷（bind-silane）在9.95mL亲和硅烷缓冲液中加入50µL亲和硅烷原液，混匀。A.3.825％过硫酸铵称取0.25g过硫酸铵，加1mL去离子水溶解，现用现配。A.3.91×TBE缓冲液量取10×TBE500mL，加4500mL去离子水，混匀。A.4银染试剂配制9 DB11/T829—2011A.4.1固定液量取冰乙酸100mL，加去离子水定容至1000mL。A.4.2染色液称取硝酸银2g，加去离子水定容至1000mL。A.4.3显影液称取氢氧化钠30g,量取甲醛5mL，加去离子水定容至1000mL。10 DB11/T829—2011附录B（资料性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列表B.1给出了白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列。表B.1白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列，，引物名称SSR引物序列（5—3）上游GGTGGTGGGCTGGGGAGTAPrimer—SSR1下游CGTCGATCGATTCATAACCGTAGA上游ATACAATCTTCGTGACTCTACAGPrimer—SSR2下游AGCATCAACGCCAACTTTATCC上游GACGCCTCAATTGCTTACTTPrimer—SSR3下游AGGGAATGAGGATGGGTCTG上游TCTCGAAACCCAGCATCAGAPrimer—SSR4下游GTGGAATGGAAACCCCAGAA上游TGCTTGCAGAAAGACGAACAPrimer—SSR5下游TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT上游TGCTTGCAGAAAGACGAACAPrimer—SSR6下游TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT上游GCGGCAAAAACGGGCTCATTAPrimer—SSR7下游CTCTCCGGCTTCTTCCTCACCTCT上游CTTCCAGTAGCCATTGTTGAPrimer—SSR8下游ATCGGGTTTTATACTCCTGAA上游AGCCGCTTCCTTTTCACTCCACTPrimer—SSR9下游CCCTTCCTACTTCCCCTCACAGAT上游TCGTTGCGTTTGAATGTTPrimer—SSR10下游CTCGTGGAAGCGGTTAC上游CCTCTCCGGCTTCTTCCTCACCTPrimer—SSR11下游GCGGCAAAAACGGGCTCATTAC上游CTTTTGCTGCCCGACGAGAPrimer—SSR12下游AAGGAAGCAGGAAAGAGATAAAAG上游GATGGCTCCGGCAAGGTCPrimer—SSR13下游TTAACAAAAGATCCAAAAAGAAAC上游TTCCGTCCCTTCCCTAAACAPrimer—SSR14下游GAACACTACTGCCCAGAGAACAC上游CGTCCGTAGCGCTATTTTTCAGAPrimer—SSR15下游ACGTTGTCGATCGCCCAGTTC上游CGTTGCAGAATGTAGGAAGAGAPrimer—SSR16下游AGAGGGCCCCAAGAAAACT11 DB11/T829—2011表B.1白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列（续），，引物名称SSR引物序列（5—3）上游TCGGCGATGGCTCTTTTCACCPrimer—SSR17下游AAGGATCGTTCAGCGGAGAGTAT上游AGTTGGCCCCATTTCATTGTTATPrimer—SSR18下游CATCTTGACGGCCTCCATCTCCA上游CAAACTCCCCCAGATCCCCAAACCPrimer—SSR19下游CGAGCGCGAACATGAGGAAGAGAA上游CGCAGAGACGGTTCAGTPrimer—SSR20下游TACGTGTTACATCTTTATTATCCA12 DB11/T829—2011BB附录C（资料性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列表C.1给出了白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列。表C.1白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列，，引物名称ISSR引物序列（5—3）Primer—ISSR1AGAGAGAGAGAGAGAGTPrimer—ISSR2AGAGAGAGAGAGAGAGCGPrimer—ISSR3GAGAGAGAGAGAGAGACPrimer—ISSR4AGAGAGAGAGAGAGAGCCPrimer—ISSR5AGAGAGAGAGAGAGAGGAPrimer—ISSR6GAGAGAGAGAGAGAGACCPrimer—ISSR7AGAGAGAGAGAGAGAGTAPrimer—ISSR8AGAGAGAGAGAGAGAGGCPrimer—ISSR9GAGAGAGAGAGAGAGAATPrimer—ISSR10GAGAGAGAGAGAGAGATPrimer—ISSR11GAGAGAGAGAGAGAGATCPrimer—ISSR12GAGAGAGAGAGAGAGATGPrimer—ISSR13AGAGAGAGAGAGAGAGTCPrimer—ISSR14AGAGAGAGAGAGAGAGTTPrimer—ISSR15AGAGAGAGAGAGAGAGGTPrimer—ISSR16AGAGAGAGAGAGAGAGGGPrimer—ISSR17GAGAGAGAGAGAGAGAACPrimer—ISSR18GAGAGAGAGAGAGAGAAGPrimer—ISSR19GAGAGAGAGAGAGAGATAPrimer—ISSR20AGAGAGAGAGAGAGAGATPrimer—ISSR21GAGAGAGAGAGAGAGACGPrimer—ISSR22GAGAGAGAGAGAGAGAGT13 DB11/T829—2011表C.1白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列（续），，引物名称ISSR引物序列（5—3）Primer—ISSR23GAGAGAGAGAGAGAGAGCPrimer—ISSR24CTCTCTCTCTCTCTCTGPrimer—ISSR25CTCTCTCTCTCTCTCTGAPrimer—ISSR26CTCTCTCTCTCTCTCTACPrimer—ISSR27CTCTCTCTCTCTCTCTGGPrimer—ISSR28TCTCTCTCTCTCTCTCAPrimer—ISSR29TCTCTCTCTCTCTCTCCPrimer—ISSR30CACACACACACACACAGPrimer—ISSR31CACACACACACACACAGTPrimer—ISSR32CACACACACACACACAAGPrimer—ISSR33CACCACACACACACACAPrimer—ISSR34ACACACACACACACACTPrimer—ISSR35ACACACACACACACACCPrimer—ISSR36ACACACACACACACACCTPrimer—ISSR37ACACACACACACACACCAPrimer—ISSR38ACATGTGTGTGTGTGTGPrimer—ISSR39CAGCAGCAGCAGCAGGPrimer—ISSR40TCCTCCTCCTCCTCCC14 DB11/T829—2011CC附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法D.1白菜基因组DNA提取方法一D.1.1白菜单粒干种子夹在硫酸纸（称量用）中砸碎，放入1.5mL离心管中。每管加入1%SDS-DNA提取液100μL，混匀。单株幼苗放入1.5mL离心管中，每管加入1%SDS-DNA提取液200μL及少量石英砂,用尖头玻璃棒碾碎，混匀。D.1.2将1.5mL离心管置于80℃～90℃水浴锅中水浴10min，水浴过程中混匀2～3次。D.1.3将1.5mL离心管从水浴锅中取出，放入离心机中12000r／min离心5min。D.1.4每管取上清液10μL，加入到一个新的1.5mL离心管中，里面预先放入1×TE缓冲液（pH8.0）90μL，混匀，12000r／min稍做离心后，作为下一步SSR或ISSR扩增的DNA模板，或放入4℃冰箱备用。D.2白菜基因组DNA提取方法二D.2.1白菜单粒干种子或单株幼苗放入1.5mL离心管中，每管加入1%SDS-DNA提取液300μL及少量石英砂,用尖头玻璃棒碾碎，混匀。D.2.2将1.5mL离心管置于65℃水浴锅中水浴30min，水浴过程中混匀2～3次。D.2.3将1.5mL离心管从水浴锅中取出，每管加入300μL饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(25:24:1)，混匀，12000r／min离心5min。D.2.4将每管中的上清液移入到一个新的1.5mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，混匀，-20℃冰箱放置20min，充分沉淀DNA。D.2.512000r／min离心5min沉淀DNA。D.2.6每管加入70％乙醇300μL，12000r／min离心1min，清洗DNA，清洗过程重复2次。D.2.7室温晾干DNA，加入1×TE缓冲液（pH8.0）50μL～100μL充分溶解DNA，12000r／min稍做离心后，作为下一步SSR或ISSR扩增的DNA模板，或放入4℃冰箱备用。D.3白菜基因组DNA提取方法三使用商品化的植物基因组DNA提取试剂盒，进行白菜单粒干种子或单株幼苗基因组DNA的提取。D.4DNA质量检测D.4.1DNA质量检测方法一将提取的白菜样品DNA适当稀释，用紫外分光光度计在260nm波长和280nm波长处测定并记录其紫外光吸收率，质量好的样品DNA溶液OD260nm/OD280nm的比值应在1.8～2.0之间。D.4.2DNA质量检测方法二15 DB11/T829—2011在1%琼脂糖凝胶中，每个提取样品加入约50ng～100ng样品DNA，5V/cm的条件下电泳，加EB染色。提取质量好的样品DNA应是一条没有拖尾的亮带，提取质量较差的样品DNA有拖尾现象，靠近胶底部的亮带是样品DNA中混杂的RNA。16 DB11/T829—2011DD附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法E.1凝胶制备将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂0.5%亲和硅烷（bind-silane）0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂2.0%疏水硅烷（repel-silane）0.5mL，操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边缘对齐。然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水平仪调平。吸取6%变性聚丙烯酰胺凝胶80mL，加入四甲基乙二胺80mL和25%过硫酸铵80mL，迅速摇匀。在凹槽一端，沿灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端后，在凹槽一端，将梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其聚合1h以上。E.2预电泳拔出已经聚合好的胶板上的梳子。将胶板的正、反面用水清洗干净，擦干，装在电泳槽上，用夹子夹紧。在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入1×TBE缓冲液600mL，接通电源，90W恒功率预电泳15min～20min。E.3点样在20mlPCR扩增产物中加入5mL6倍变性加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上变性：95℃变性5min，4℃冷却10min。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入5mL扩增产物。E.4电泳90W恒功率电泳1h～1.5h。E.5染色电泳结束后，分开两块玻璃板，按以下步骤进行染色：——固定：将胶板放入10%冰乙酸固定液中，轻轻晃动5min；——漂洗：双蒸水漂洗胶板3次，每次2min；——染色：将胶板放入0.2%硝酸银溶液中，染色5min；——漂洗：双蒸水快速漂洗胶板1次，时间不超过10s；——显影：将胶板放入显影液中,轻轻晃动至带纹清晰显现；——定影：将胶板放入10%冰乙酸溶液中，定影5min；——漂洗：双蒸水漂洗胶板1min，室温晾干胶板。E.6记录17 DB11/T829—2011对胶板上显色的条带进行观察记录并照相。18 DB11/T829—2011EE附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法F.1凝胶制备将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂0.5%亲和硅烷（bind-silane）0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂2.0%疏水硅烷（repel-silane）0.5mL，操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边缘对齐。然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水平仪调平。吸取5%非变性聚丙烯酰胺凝胶80mL，加入四甲基乙二胺80mL和25%过硫酸铵80mL，迅速摇匀。在凹槽一端，沿灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端后，在凹槽一端，将梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其在1h左右聚合。F.2预电泳拔出已经聚合好的胶板上的梳子。将胶板的正、反面用水清洗干净，擦干，装在电泳槽上，用夹子夹紧。在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入1×TBE缓冲液600mL，接通电源，90W恒功率预电泳15min～20min。F.3点样在20mlPCR扩增产物中加入5mL6倍非变性加样缓冲液，混匀。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入5mL扩增产物。F.4电泳90W恒功率电泳1h～1.5h。F.5染色电泳结束后，分开两块玻璃板，按以下步骤进行染色：——固定：将胶板放入10%冰乙酸固定液中，轻轻晃动5min；——漂洗：双蒸水漂洗胶板3次，每次2min；——染色：将胶板放入0.2%硝酸银溶液中，染色5min；——漂洗：双蒸水快速漂洗胶板1次，时间不超过10s；——显影：将胶板放入显影液中,轻轻晃动至带纹清晰显现；——定影：将胶板放入10%冰乙酸溶液中，定影5min；——漂洗：双蒸水漂洗胶板1min，室温晾干胶板。F.6记录19 DB11/T829—2011对胶板上显色的条带，依照标准样品的条带进行观察记录并照相。F_________________________20'