DB11T828.3-2011实验用小型猪遗传质量控制.pdf 14页

'ICS65.020.30B44备案号：DB11北京市地方标准DB11/T828.3—2011实验用小型猪第3部分：遗传质量控制ExperimentalminipigPart3：Geneticqualitycontrol2011-11-10发布2012-03-01实施北京市质量技术监督局发布 DB11/T828.3—2011目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14遗传分类及命名.....................................................................15繁殖...............................................................................26近交系实验用小型猪的遗传质量监测...................................................37封闭群实验用小型猪的遗传质量监测...................................................3附录A（规范性附录）近交系实验用小型猪的微卫星DNA标记检测方法......................5附录B（规范性附录）封闭群实验用小型猪的微卫星DNA标记检测方法......................9I DB11/T828.3—2011前言DB11/T828的本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。DB11/T828《实验用小型猪》分为六个部分：——第1部分：微生物学等级及监测；——第2部分：寄生虫学等级及监测；——第3部分：遗传质量控制；——第4部分：病理学诊断规范；——第5部分：配合饲料；——第6部分：环境及设施。本部分为DB11/T828的第3部分。本部分由北京市科学技术委员会提出并归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、首都医科大学、中国人民解放军军事医学科学院、吉林大学。本部分主要起草人：李奎、陈振文、杨述林、吴艳花、冯书堂、杜小燕、牟玉莲、董罡、公维华、任文陟、张宁波、徐玲玲。II DB11/T828.3—2011实验用小型猪第3部分：遗传质量控制1范围DB11/T828的本部分规定了实验用小型猪的遗传分类、繁殖方法和近交系及封闭群的遗传质量标准。本部分适用于实验用小型猪的遗传质量控制。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14923实验动物哺乳类动物的遗传质量控制3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用小型猪experimentalminipig经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，12月龄体重不超过35kg，用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的小型猪。3.2近交系inbredstrain经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配和全同胞兄妹交配有等同效果。近交系的近交系数（inbreedingcoefficient）应大于99%。3.3封闭群（远交群）closedcolony（outbredstock）以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验用小型猪种群，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上。4遗传分类及命名1 DB11/T828.3—20114.1遗传分类根据遗传特点的不同，实验用小型猪分为近交系和封闭群。4.2命名4.2.1近交系命名近交系一般以大写英文字母命名，亦可以用大写英文字母加阿拉伯数字命名，符号应尽量简短。如WZSP等。4.2.2近交代数近交系的近交代数用大写英文字母F表示。例如当一个近交系的近交代数为30代时，写成（F30）。4.2.3其它近交系亚系，重组近交系，同源突变近交系，同源导入近交系的定义和命名按照GB14923执行。4.2.4封闭群命名封闭群的命名按照GB14923执行。5繁殖5.1近交系的繁殖5.1.1原则选择近交系实验用小型猪繁殖方法的原则是保持近交系小型猪的同基因性及基因纯合性。5.1.2引种作为繁殖用种子的近交系实验用小型猪，应来自于近交系的基础群或血缘扩大群，遗传背景明确，有完整的资料（包括品系名称、近交代数、遗传基因特点及主要生物学特征等）。5.1.3方法可分为基础群（foundationstock）、血缘扩大群（pedigreeexpansionstock）和生产群（productionstock）。当近交系小型猪生产供应数量不是很大时，一般不设血缘扩大群，仅设基础群和生产群。基础群、血缘扩大群和生产群的具体繁殖方式按照GB14923执行。5.2封闭群的繁殖5.2.1原则选择封闭群实验用小型猪繁殖方法的原则是保持封闭群小型猪的遗传异质性及基因多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升。5.2.2引种5.2.2.1作为繁殖用种子的封闭群小型猪应遗传背景明确或来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）。2 DB11/T828.3—20115.2.2.2根据繁殖方式，在保证每代近交系数增量不大于1%的前提下，决定最小引种规模。如采用循环交配方式，引种数量不得少于13对无血缘关系（三代以内无共同祖先）的公母猪；若采用随机交配方式，引种数量不得少于25对无血缘关系的公母猪。5.2.3方法封闭群应足够大，以保持封闭群实验用小型猪的遗传基因的稳定，并尽量避免近亲交配。具体繁殖方法按照GB14923执行。6近交系实验用小型猪的遗传质量监测6.1检测方法采用微卫星DNA标记检测方法。具体方法执行附录A。6.2抽样对基础群，凡在子代留有种猪的双亲动物都应进行检测。对生产群，按表1要求从每个近交系中随机抽取非同窝成年猪，公母各半。表1近交系实验用小型猪遗传检测抽样要求生产群中种母猪数量抽样数量少于100头6头大于100头不少于6%6.3结果判定近交系实验用小型猪遗传检测结果的判定按表2执行。表2近交系实验用小型猪遗传检测结果判定检测结果判定与标准遗传概貌完全一致未发现遗传变异有一个位点的标记基因与标准遗传概貌不一致遗传发生变异6.4判定结论所有样品检测位点的等位基因都符合品系的特征，没有新的等位基因出现为合格实验用小型猪近交系，否则判为不合格。6.5检测时间间隔近交系实验用小型猪生产群每年至少进行一次遗传质量检测。7封闭群实验用小型猪的遗传质量监测7.1检测方法3 DB11/T828.3—2011采用微卫星DNA标记检测方法。具体方法执行附录B。7.2抽样按表3要求从每个封闭群中随机抽取非同窝成年猪，公母各半。表3封闭群实验用小型猪遗传检测抽样要求群体数量抽样数量少于100头不少于15头大于100头不少于30头7.3结果判定群体内遗传变异采用平均杂合度指标或群体平衡状态方法进行评价。当平均杂合度在0.5～0.7时，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为合格的封闭群实验用小型猪群体。或用群体是否达到平衡状态来判定，如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群实验用小型猪群体判为不合格。具体方法执行附录B。7.4检测时间间隔封闭群实验用小型猪生产群每两年至少进行一次遗传质量检测。4 DB11/T828.3—2011AA附录A（规范性附录）近交系实验用小型猪的微卫星DNA标记检测方法A.1微卫星分子标记检测的原理采集近交系实验用小型猪的血液或耳组织，提取基因组DNA。对特定的微卫星标记座位进行PCR扩增，通过遗传分析仪检测各座位基因的峰形和大小，确定各近交系的微卫星标记的遗传概貌。A.2仪器设备A.2.1常压电泳仪。A.2.24℃、－20℃冰箱。A.2.3低温高速离心机。A.2.4水浴锅。A.2.5感量为0.0001g的分析天平。A.2.6pH计。A.2.7紫外分光光度仪。A.2.8PCR仪。A.2.9遗传分析仪。A.3微卫星DNA标记检测方法A.3.1样本的采集A.3.1.1耳静脉或前腔静脉采血2ml，加等量的血液裂解液。A.3.1.2采集大小＞0.5g的耳组织样，放入75%乙醇保存。A.3.2基因组DNA的提取用苯酚氯仿法或试剂盒提取基因组DNA。A.3.3微卫星标记位点用10个分布于猪单倍体10条主要染色体上的微卫星位点检测近交系小型猪的遗传概貌。各微卫星位点的染色体位置、等位基因数、引物序列及荧光标记，PCR反应的Tm值、镁离子浓度见表A.1。A.3.4PCR扩增A.3.4.1PCR扩增的体系PCR总反应体积为15μl,其中含1×PCRbuffer,200μMdNTPs,各400pM的上下游引物，MgCl2（浓度见表A.1），0.1μl(5U/μl)的TaqTM,100ng的基因组DNA。PCR反应程序为94ºC,4min；94ºC，30s；退火，30s；72ºC,30s,30个循环，72ºC延伸7min。A.3.4.2PCR产物的检测5 DB11/T828.3—2011PCR产物，以2％的琼脂糖检测扩增效率。凝胶成像系统记录检测结果。A.3.5个体基因型的判定A.3.5.1PCR产物的变性根据琼脂糖检测的结果，对PCR产物进行稀释。若2%的琼脂糖检测的条带亮度基本相同，即PCR的扩增效率基本相同，则FAM、HEX、TAMRA三种标记的三个位点的PCR产物分别取1ul混合，加到每孔含8.5ul的甲酰胺和内标的96孔板上（860ul甲酰胺加10ul内标，混匀，分装到96孔板上），95ºC变性5分钟，迅速放在冰上。待96孔板降温后，用铝箔纸包好，4℃保存备用。A.3.5.2基因型的判定含变性后的PCR产物的96孔板放入遗传分析仪内进行分析，原始峰图用基因分型软件进行分析，确定特定位点各个体的峰形和大小，判定个体的基因型。A.3.6结果判定所有样品检测位点的等位基因都符合品系的特征(见表A.2)，没有新的等位基因出现为合格实验用小型猪近交系,否则判为不合格。A.4结果报告根据判定结果对被检测的实验用小型猪群体做出检测报告。6 DB11/T828.3—2011表A.1各微卫星座位的染色体位置、等位基因数、等位基因片段范围、荧光标记、两侧引物序列（左侧：F，右侧：R）、退火温度和镁离子浓度染色体等位基等位基因Mg2+座位名称5"荧光标记引物序列5"→3"Tm℃位置因数范围bp(mM)F-ATAGACATTATGTAAGTTGCTGATCGA1q12250-320FAM552.5R-GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGTF-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGGSW2402P896-115TAMRA551.5R-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAAF-ATCAGAACAGTGCGCCGTSW723P8100-116TAMRA551.5R-GTTTGAAAATGGGGTGTTTCCF-TCCTTCCCTCCTGGTAACTAS00055q10205-248FAM553.0R-GCACTTCCTGATTCTGGGTAF-CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATAS009012q4244-251TAMRA551.5R-GCTATCAAGTATTGTACCATTAGGF-GGTATGACCAAAAGTCCTGGGSW769137106-140HEX553.0R-TCTGCTATGTGGGAAGAATGCF-TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACCSW857146144-160TAMRA551.5R-GATCCTCCTCCAAATCCCATF-TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATGS03551514243-277HEX553.0R-GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGAF-CTTTGGGTGGAGTGTGTGCSW2417896-121FAM551.5R-ATCCAAATGCTGCAAGCGF-GTGTAGGCTGGCGGTTGTS0218X8164-184TAMRA551.5R-CCCTGAACCCTAAAGCAAAG7 DB11/T828.3—2011表A.2五指山小型猪近交系、广西巴马小型猪和贵州小型猪近交系培育过程中，遗传质量控制的微卫星座位及优势等位基因座位座位座位座位座位座位座位座位座位座位等位等位等位等位等位等位等位等位等位等位群体基因CGA基因SW769基因SW857基因S0005基因SW240基因S0355基因SW72基因S0090基因S0218基因SW24五指山小型猪近交系1890.0231050.0931500.1632380.6711160.1712580.7501060.5882410.7561730.0121040.6311990.8721290.9071580.8371240.5372660.1381140.2382470.0121790.5472030.0231810.4192930.081等位基因频率合计1.0000.9071.0000.6710.7070.8880.8250.7560.5470.631广西巴马小型猪2710.4901230.1941460.1462160.223940.5312580.0831100.6982410.0321670.1151020.7502770.2811270.8061540.5732260.660980.3332600.4271200.0832430.1171730.7401040.0212970.2291040.1152620.4272470.4891790.1252490.1171870.021等位基因频率合计1.0001.0000.7190.8830.9790.8540.7810.6060.8540.750贵州小型猪2710.0111050.2911560.1672020.558960.2272520.1831020.1702470.0451810.1511000.1142830.1361210.2671600.4522040.2441020.1822540.0982490.5801870.1861040.1142850.3641290.0931660.2022140.1862720.1101120.6252530.3751950.0231080.2163050.2951330.1512740.3411180.0451970.5001120.1361390.0811450.116等位基因频率合计0.7950.9070.8210.9880.4090.7320.8410.9550.7090.4668 DB11/T828.3—2011附录B（规范性附录）封闭群实验用小型猪的微卫星DNA标记检测方法B.1基因组DNA的提取用苯酚氯仿法或试剂盒提取基因组DNA。B.2微卫星位点用25个分布于猪17条常染色体和X性染色体上的微卫星位点检测封闭群小型猪的遗传概貌。各微卫星位点的名称、引物序列、在染色体位置、等位基因数、PCR反应的Tm值、镁离子浓度及等位基因分布范围见表B。B.3PCR扩增B.3.1PCR扩增的体系PCR总反应体积为15μl,其中含10×PCRbuffer:1.5μl，上下游引物(100pmol/μL)各1μL,4×dNTP100μmol/L:1μL,Taq酶1U:1μL,50ng～100ng基因组DNA:1μL,纯水(ddH2O):8.5μL。PCR反应程序为：95℃预变性,4min；94℃变性，30s；退火温度（各位点退火温度参见表B），30s；72℃延伸，30s；35个循环；72℃继续延伸7min；扩增产物4℃保存。B.3.2PCR产物的检测PCR产物，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。B.3.3扩增产物的STR扫描扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后，选择分别以FAM、HEX、TAMRA标记的三个位点的扩增产物，以1：3：5体积比混合，取1µl上样进行STR扫描。B.4STR扫描结果的判读与统计分析B.4.1STR扫描结果的判读扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波。同时，根据软件读出波峰处的扩增产物的bp数。由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩增片断从小到大顺序排列纪录为a,b,c,d等。B.4.2运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析将所有样本的每个微卫星位点的基因型以ab,bb等形式输入群体遗传分析软件的数据文件，计算样品在各微卫星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数（Ne）、相隆指数、平均杂合度（H）等。B.5结果判定平均杂合度在0.5～0.7时，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为合格的封闭群实验用小型猪群体。或者，首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率的实际值，然后可计算出基因频率和基因型频率的预期值。用实际值和预期值比较，通过卡方检验，可知被监测群体是否达到9 DB11/T828.3—2011平衡状态。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群实验用小型猪群体判为不合格。B.6结果报告根据判定结果对被检测的封闭群实验用小型猪群体做出检测报告。10 DB11/T828.3—2011表B各微卫星座位的引物序列、染色体位置、最佳扩增条件、等位基因数及等位基因分布范围位点引物序列(5′-3′)所在染镁离子浓退火温等位基等位基因色体(mmol/L)度(℃)因数范围SW974GGTGAAGTTTTTGCTTTGAACC12.05817129-175GAAAGAAATCCAAATCCAAACCS0091TCTACTCCAGGAGATAAGCCAGAT21.5551496-174CAGTGACTCCATGCACAGTTATGASW240AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG21.5581192-114AAACCATTAAGTCCCTAGCAAASW1066GCAGGATGAACCACCCTG32.06019166-214CTCTTGAGGCAACCTGCTGSW1089TTTTCCCCTTCACTCACCC41.55810142-190GATCAAAGTCCCTTACTCCGGS0005TCCTTCCCTCCTGGTAACTA52.05411204-244GCACTTCCTGATTCTGGGTASW1057TCCCCTGTTGTACAGATTGATG62.05814142-191TCCAATTCCAAGTTCCACTAGCSW632TGGGTTGAAAGATTTCCCAA72.0549148-173GGAGTCAGTACTTTGGCAOPNCCAATCCTATTCACGAAAAAGC82.05912138-170CAACCCACTTGCTCCCACSW29AGGGTGGCTAAAAAAGAAAAGG82.06112133-187ATCAAATCCTTACCTCTGCAGCSW911CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC92.06014151-178CATCTGTGGAAAAAAAAAGCCSW511AAGCAGGAATCCCTGCATC91.56212161-196CCCAGCCACCAGTCTGACSWr158TCCAATTCAACTCCTGGCTC102.06018158-200GAATGTGCACATACCACATGCSW951TTTCACAACTCTGGCACCAG101.55814108-142GATCGTGCCCAAATGGACSW271TTCCAGTGGCTTTCTGTGC111.55813111-144CATTCATTCCCAGTGAAACTTGS0386TCCTGGGTCTTATTTTCTA112.04812155-178TTTTTATCTCCAACAGTATS0068CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC132.06210210-256AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCTSWr1008ACAGCCACCAACAGTGTTTG132.0621698-256GAACTTCCATATGCTGCAAGTGS0007TTACTTCTTGGATCATGTC142.05415142-192GTCCCTCCTCATAATTTCTGSW857TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC142.05816129-173GATCCTCCTCCAAATCCCATSWr312ATCCGTGCGTGTGTGCAT151.56411116-136CTGGTGGCTACAGTTCCGATSW81gatctggtcctgcacaggg161.5608128-144GGGGCTCTCAGGAAGGAGSWr1120CAAATGGAACCCATTACAGTCC171.56011147-178ACTCCTAGCCCAGGAGCTTCS0062AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAG182.05612144-204TCTGATAGGGAACATAGGATAAATS0218GTGTAGGCTGGCGGTTGTX1.55411158-196CCCTGAAACCTAAAGCAAAG___________________________11'