DB13T 210-1994 实验动物全价营养饲料标准.pdf 38页

'河北省地方标准实验动物全价营养饲料标准DB13/T210一941主题内容与适用范围本标准规定了实验动物全价营养饲料的技术要求、测定方法、检验规则、标志，包装、运输和储存。本标准适用于大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠、家兔、犬、猫等实验动物用饲料。2引用标准2.1原料标准GB10363-10368饲料用玉米、高梁、稻谷、小麦、皮大麦、小麦鼓原料标准GB10383’饲料用黑大豆原料标准GB10384饲料用大豆原料标准GB10389饲料用首楷草粉原料标准GB10397饲料用大豆饼标准2.2测定方法标准GB6432饲料粗蛋白测定方法GB6433饲料粗脂肪测定方法GB6434饲料粗纤维侧定方法GB6436饲料水分测定方法GB6436饲料钙测定方法GB6437饲料总磷量测定方法GB6438饲料灰分侧定方法GB6439饲料水溶性氯化物测定方法GB13079饲料中砷的测定方法GB13080饲料中铅的测定方法GB13081饲料中汞.的测定方法GB13086饲料中亚硝酸盐测定方法GB13090饲料中六六六、DDT测定方法GB6009.22黄曲霉毒素B侧定方法GBb009.20有机磷农药残留量侧定方法、河幼}j省技术监粉局1994-03-281肚准1994-04-01实施 ——~.一升~-一、-DBJ13T210-94一一一一一一一一一一一一一一一GB4789.2菌落总数测定方法GB4789.3大肠菌群侧定方法GB4789.4沙门氏菌检验方法GB4789.6病原性大肠艾希氏菌检验方法GB4789.12肉毒梭菌检验方法2.3饲料标签标准GB10648饲料标签3技术要求3.1成品饲料为以天然原粮为主要原料.加工制做成颗粒状，且应整齐均匀，适口性强。3.2成品饲料色泽新鲜一致，无杂质，无异味，无霉变，无发酵，无虫蛀、鼠咬。3.3·成品饲料中不得掺人抗生素、驱虫剂、防腐剂、防霉剂、色素、促生长剂以及激素等添加剂。维生素、常量元素、微童元素、氮基酸等添加剂应符合食用要求。3.4成品饲料配方经确定后，须保持其稳定性，不得任意更改其中组分。3.6营养成分指标(见表1)3.6饲料重金属含量及污染物质控制指标(见表2)3.7饲料徽生物控制指标(见表3)4试验方法各项监测项目，按国家标准方法进行，粗蛋白按GB6432执行，粗脂肪按G.B6433执行，粗纤维按GB6434执行，水份按GB6436执行，钙按GB6436执行，总磷按GB6437执行，灰分按GB66438执行，水溶性氯化物按GB6439执行，重金属砷、铅、汞分别按GB13079,GB13080.GB13081执行。亚硝酸盐按GB13K执行，六六六、DDT按13090执行，黄曲霉毒素B、按GB6009.22执行，有机磷农药残留量按GB6009.20执行，菌落总数按GB4789.2执行，大肠菌群按GB4789.3执行，沙门氏菌按GB4789.4执行，病原性大肠艾希氏菌按GB4789.6执行，肉毒梭菌按GB4789.12执行。无国家标准的按本标准规定的方法测定，见《实验动物全价营养饲料监测方法》。6检验规则6.1饲料原料按国家有关标准方法进行自检。6.2出厂检验6.2.1以同批原料制作的成品饲料为一批产品，每批成品饲料进行自检。 DBI13T213}946.2.2成品饲料检测项目为水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、灰分、钙、磷。5.2.3试样的选取和制备‘见实验动物全价营养饲料监测方法)6.3型式检验5.3.1每年一次一，由何北省主管部门指定监一测单位，按测定一方祛对成品饲一料取样检侧。6.,3.2一河北省卖验动物一工作主管部门，不定期妹成品饲料袖样检铡·，6.3.3型式检验项目6.3.3".1型式检验项目分禾标准表1,表2、表3中钓各项规定。6.8.3.2新配方成品饲料还应检测本标准附录A中表A1,A2,"A3,6.3.:4判定规则成品饲料检测中符.合表1.,表琴、表3各项指标t.合格e品，.不合格产品抓重新取样，对其中不符合规定的指V,进行复检p-in仍不符合规定时，则试产品为不合格产品。新配方成品饲料还应附合本标准附录A中表A1,A2,A3中的各项规定。作为判断的主要参考依据。6标志、包装、运物、贮存6.1标志成品饲料标志应符合GRIFOM的规定。6..最‘产"Lpl说明、书除成品饲料标志往明事项外，还须说明原A情况、一营养指标、认证编号及硕发单位。6.3包装包装材料必须无毒、无污染、无异味。成品饲料须双层包装，包装·须封口严密，无破损。6.4运输成品饲料运翰中须防止包装破损、日晒、雨淋、不得接触有害物质。6.6储存成品饲料与各种原料须分开储存、库房内须干燥、通风、清洁、无虫、无蝇、无野鼠，严禁存放有毒有害物品。6.6保质期成品饲料保质期不超过三个月(雨季不超过二个月)。 DB声13T210-94农1首养成分指标实段二种经公钾盛分(%)火。小.泊.肠.盆免犬翻水分一108-10一10e-10.一日6-10粗砚白质1一，‘1一，41一，01.一公.皿1一，.，o-污，.红.0..一1.420.88-1.400.77-0..，0.77-0.941..日一1.641.60-1。二甘十皿组..。，一七100.86-0.80.。47-0。二0.45-0。二0.64-0...0.07-1.04色妞.0.22-0.340.30-0.，.0.33-0.360.21-0.5犷.。，.-0.3..。3.一.。汤.粗口.4-6.一3-.a一‘4-2一皿0粗奸组‘-.肠一10-1610-16a一a一灰分.一.一，一，-.，-.，一男1.0-1.01.0-1..1.0-1.61.0-1.‘1.2-1二1.2-1.4.O:!-1.，..6-1.，0.6-1.0.。6-1.00.8-1.00.8-1.0维生众点11i0T1Sfi0I0is舀刃0-16000PGi0I013F1,10007500-1260002000-1350010000-16000(LUl切.哇双D12151i01250-1500760-1260750-12502000-45001100-2000(L叨如】.跳公CIioIe131d0(Mel如】4 DB/13T210-94表2饲料重金属及污染物质控制指标项目指标mg/kg汞<0.02砷重金属<0.6铅<1黄It霉素BI(Aflato:inB1)<0.006亚硝酸盐(Nitrite)六奴化苯(666)<0.9(Benzenehe:achloride)滴滴涕(DDT)(Dichiorodiphrny-<0.2trichloroethane)敌敌畏(Dichlorvos)摇<0.全污染物质乐果(Dimethate)<0.06马拉硫磷(Maiathion)<3对硫磷(Parathion)<0.1甲拌麟(P肺rate)<0.02杀螟硫僻(Fenitrothin)<0.4倍硫磷(Fenthin)<几。05农3饲料徽生物控制指标指标项目—大且、小成、地巨豚旦、家懊犬、猫细菌总数(个/克)《2x10"1x10"大肠菌群(个1克)‘致病菌成品饲料不允许有沙门氏菌，炭疽杆菌、肉毒杆菌、病原性大肠艾希氏菌存在·注:饲育饲料橄生物指标;经过不同方法稍毒处理.应使其与相应等级的实验动物一致。 __DB13/T210-94_附录A实验动物全价营养饲料监测方法(补充件)A1组基酸测定法A1.1十六种氮基酸的测定一一氮基酸自动分析仪法A1.1.1原理蛋白质经盐酸水解，成为游离纸基酸，再用氮基酸自动分析仪进行侧定。氮基酸自动分析仪是应用离子交换层析的原理进行氮基酸分析。所用树脂一般为Na-型阳离子交换树脂。各种氨基酸的酸碱性、极性和分子大小等性质不同，对树脂的亲合力也不一样，当用不同PH和离子浓度的缓冲液洗脱时，各种奴基酸被洗脱顺序不同，先是酸性氨基酸和极性较大的氮基酸，其次是非极性的和芳族氮基酸，最后是碱性氮基酸被洗脱，分子量小的比分子量大的先被先脱，从而达到分离的目的。被洗脱的氨基酸与苟三酮溶液产生颜色反应，可通过分光光度计比色测定各个氨基酸含it。一份水解液可同时测定天冬、苏、丝、谷、脯、甘、丙、绷，蛋、异亮、亮、酪、苯丙、组、赖、精氨酸等16种甄基酸。A1.1.2仪器氨基酸自动分析仪电热减压燕发器(见图1)图1电热减压燕发器1.调压变压器;2.J(空干澡器.有加热炉丝:8.压力表;4.级冲瓶;6.内装饱和氢暇化钠;‘.内装抓化钙水解用试管.18X180mm硬质玻璃管(见图2)。在距管口20.30mm处拉细，便于封管烘箱。 一~一一一一一一DH1317210-94一一一一Al.1.3试剂a.6N盐酸1份优级纯浓盐酸(比重1.19)加1份重燕馏水。b,酚须重燕馏后使用。c.高纯氮含量99.999%eA1.1.4测定步骤Al.1.4.1样品水解a、称取一定量样品到试管中(也可用带密封垫的螺丝盖管代替试管)，使样品含蛋白质在10-r20mg范围内。b、对固体样品可加人6N盐酸16m1，对液体样品可加人与样品等体积的浓盐酸。c、加人新燕馏的酚2-3滴。d、将试管置于冰盐、混合浴中，冰冻3-r6min，用真空泵抽空到1.33-2.66kPa(10-,-20mmHg)，然后充人氮气，重复3次。在试管的细颈处用火焰封口一边抽真空一边封管，注意在操作时勿使样品接触管口加热部分。f、将样品管置于烘箱中，于110℃水解22h,g.取出样品管用冷水冷却后切开试管，将水解液经滤纸过滤到60m1容量瓶中，用重蒸馏水淋洗试管及滤纸并定容。h.取样品滤液lml到6ml小容量瓶中，将瓶置于减压燕发器内在36"C减压燕干，用lml重蒸馏水冲洗瓶壁，再抽干，如比反复3次。i、加适量(1--2m1)0.02N稀盐酸(pH2.2)将燕干之样品溶解即可上机分析，若不立即进行分析，可在4℃短期存放·Al.1.4.2上机分析根据不同型号仪器选择合适的参数进行氨基酸分析。.将16种氨基酸标准混合液上机，得到标准氨基酸的出峰时间及峰面积，根据样品出峰时间可以鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标准对比，计算样品中各种氮基酸含t-A1.1.6计算上机样品液(50u1)中氮基徽总f(nmol)-上机标谁摘(‘。”1)中组malt(umol)X祥品姆面积1组基曲标准娜面积1008祥品中组基吸二盆一上机样品摘中组基.总f(二ol)x(DxIdx100)/(WXBx10")式中: ——一.-一—.—一DB13/"210-94‘一一一一一一一一一一一一一一D:样品的稀释倍数。M:氮基酸分子童(ng)ow:样品重量(g)eE:上机时的进样量(此处为60p1),Al.2胧氮酸的测定一一过甲酸氧化，氨基酸自动分析仪法Al.2.1原理在用盐酸水解蛋白质的过程中，脱氮酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的就氮酸及半脱氮酸氧化成半耽确酸。其反应式如下:OwHNH:l}}CH:一CH一COOH+3H一C一OOH--P-半耽技酸过甲酸OS03NH，.}}CH:一C一COOH+3H一C一OH半耽磺酸甲酸生成的半肮磺酸可在氮基酸自动分析仪上进行测定.与标准半耽磺酸比较，计算其含童。Al.2.2仪器水解瓶(见图3)，容积26ml。电热碱压燕发器(见图1)oAl.1.3试剂过甲酸取9m1分析纯酸加人lml30%过氧化氢混合，在室温放2h以上。Al.2.4测定步骤Al.2.4.1过甲酸氧化a称取一定量食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质量在6~10mg，加人lm挝甲酸试剂，在室温放置3h,b加lml乙醉中止氧化。c将样品瓶置于电热减压燕发器中，于460C减压蒸干，用lml去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次以除去过甲酸。Al.2.4.2盐酸水解同上述十六种氮基酸分析中步骤(2)及(4)--(9).Al.2.4.3上机分析 _pBI旦J7210坐一_在Beckman6300氨基酸自动分析仪上，在柱温60℃时用pH3.26柠膝酸缓冲液洗脱，半耽磺酸的出峰时间约在1.78minoAl.2.5计算上机样品液(60p1)中半脱确砚R(nmol)-上机标准被中半脱砚sm(nmol)X样品峰百jm/半吮砚.标准峰面积100g样品中价红二，吸·上机样品中半倪劝.jk(nmol)X(DXMX100)/(WXSX10"XR)式中:D:样品的稀释倍数。M:脱氨酸分子量(ng)oW:称样量(g)。E:上机时的进样量(此处为60N1),Al.3色氨酸的测定一一荧光分光光度法Al.3.1原理食物蛋白质在酸水解过程中，其色氮酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氮酸和酪氨酸可以检测到荧光。在PH为11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大10。倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点可在有大量酪氮酸存在下，检测色氨酸的含量。Al.3.2仪器荧光分光光度计。减压蒸发器(见图1)(无加热部分)。螺丝盖大口瓶瓶盖上有橡皮垫。小玻璃球直径1.8cm,Al.3.3试剂A1.3.3.16N氢氧化钠内含。.6%可溶性淀粉，临用前配制。A1.3.3.24mo1尿素溶液(调pH到11)oA1.3.3-36N盐酸1份优级纯浓盐酸加1份重燕馏水。Al.3.3.4澳百里酚蓝0.lg指示剂加0.1NNaOH溶液1.6m1配成0.06水溶液。·Al.3.3.6高纯氮(含量99.999%)。A1.3.3.6辛醇甲苯溶液含1%辛醇。Al.3.4测定步骤 侧由3/T21O--l4Al.3.4.1称取含粗蛋白质约‘二‘的样昌sit于豪四红乙始管中.加含可溶性淀粉的6NNaOHlml,加人1摘辛醉。Al.3.4.2将10-12支样品管，分别盖上小玻肩球，放于一只带级丝盖大口瓶内.将饭置于喊压燕发装置中，加冰、盐降温.，减压至真空度到1.3HP&IOmmH‘以下，继续保特16min，充纽气再减压，如此反复3次.迅速旋紧大口瓶的.丝盖。A1。3.4.3将充氮气的大口瓶置烘箱中，在110℃水解样品22h.Al。3.4.4冷却大口瓶，用重燕语水将样品分别洗至26=1容量抓中(内含6NHCL0.7ml)，用镇百里酚蓝为指示剂调pH至中性，用重燕招水定容至刻度。Al.S.4.6吸取样品液lml，于loml带盖刻度试管内，用pH为11之4mof了L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm、发射浪长为360n二下洲荧光强度，很据标准色氛酸的荧光强度曲线，计算样品中色甄酸含ItAl.S.4.6色甄酸标准溶液，用。.006NN&OH溶液溶解色扭醉标准.配翻成每。U二‘的色虹酸标准贮备液存放在冰箱中。每次分析样品前将贮备液稀释成每二1100,200,300,400p‘色觅酸标准系列。取每种标准1m1(双份)与样品管同样加试荆，同时水解，以色组酸标准液浓度为横座标.黄光强度为纵座标绘翻标准曲线。Al.3.5计算每100g样品中色扭酸含量(mg)一(AxDx100)/(100xW)式中:A:根据标准曲线得到的每二1侧健液中色扭酸含#(mg).D:稀释倍敬，此处为”x10.W:称样量(g).A2维生JRA洲定法(比色法)A2.1原理、仅器及试荆A2.1.1原理维生素A与三抓化锑抓仿溶液相互作用，产生蓝色。此蓝色的深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。此蓝色虽不德定.但在一定时间内可用分光比色计于620n二波长下侧定其强度·A2.1.2仪器 DB13/7210-94名称规格锥形烧瓶126-260m1回流冷凝管分液漏斗600ml量瓶(为稀释标准维生素A用)100、60、26m1吸管1、2、6m1漏斗量筒或快流吸管lOm1光电比色计〔或分光比色计)有盖三角瓶126-260m1A2.1.3试剂A2.1.3.1氢氧化钾溶液溶600g纯氢氧化钾于600ml蒸馏水中。A2.1.3.2乙醚需用无过氧化氢的试剂，以免使维生素A破坏。因此，买来的试剂应先试试是否含有过氧化氢。。如果没有就可直接使用，否则应蒸馏后再用。蒸时可于蒸馏瓶中放人无锈铁丝一段。A2.1.3.3乙醇。应不含醛类，一般的酒精应经过如下的脱醛处理:取2gAgNO:溶于少量水中。取4gNaOH溶于温乙醇中，将两者倾人1L乙醇中，振摇均匀，静置1---2h。将上层清液倾人蒸馏瓶中蒸馏。弃去初燕出的60m1,A2.1.3.4无水硫酸钠须粉状，纯的。用过的药品可以保存起来，经溶化再结晶回收使用。A2.1.3.6酚酞指示剂溶lg酚酞于100m196%乙醇中。A2.1.3.6氯仿应纯，不含分解物，否则会使维生素A破坏。买来的药品应先检查是否有分解物。;如有，则应于分液漏斗中加水洗数次后，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏之。A2.1.3.720-26%三氯化锑仿溶液溶20--26g三氯化锑于lOOm1氯仿中。储于棕色糖浆瓶中，并尽量减少吸收水分的机会。A2.1.3.8醋酸JI。A2.1.3.9维生素A醋酸醋或维生素A标准油剂。维生素A极易被光破坏，试验应在暗室中进行，或用棕色玻璃仪器。A2.2测定步骤与结果计算A2.2.1制备维生素A标准曲线 ——~DB13/T210-94一一一一一一一一一A2.2.1.1配制标准液精确称量一定It的标准维生素A，以抓仿在I瓶中溶解。再以抓仿稀释至不同浓度，顺次分别移抓仿lml及各种不同浓度的标准液各lml于相应的比色管中。每管加人醋酸酥一滴。A2.2.1.2、显色及比色先将一个比色管装人loml氛仿，插人比色架的一个孔中。再将盛有lml氯仿(试剂空白)或不同浓度的标准液的比色管先后插人比色计的另一孔中。将盛loml氛仿液管先放置于光道下于620nm波长下调节光密度至0.产即将插在另一孔的管子移人光道，迅速加人，ml三抓化锑氯仿溶液.。于6秒钟内测定光密度，将所得结果于方格纸上划成标准曲线。此曲线应为一直线即浓度与光密度成正比。例:比色管维生素A含量光密度光密度(IU)(减去试剂空白后).且0.02027.80.1310.111nO14.60.2410.221424.30.3830.363工0292.0.4660.4366389…0.6600.640叮486.0.6730.66386840.7900.770A2.262样品分析根据样品性质，可分别采取皂化法或研磨法。A2.2.2.1皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少维生素A以外的脂溶性物质的干扰。但全部试验过程太长，费时间，且易招致维生素A的损失。a皂化:·根据样品中维生素A含童不同，称取0.6-6g样品于三角瓶中，加人loml60%氢氧化钾及20-r40ml乙醉，于电热板上回流30min至皂化完全为止。b提取:0将皂化瓶内棍合物移至分液漏斗内。以30ml水洗皂化瓶，洗液并人分液漏斗。如有渣子，可将皂化的棍合物经过放有少许脱脂棉的润斗撼人分液拐斗内。0用60ml乙酸分两次洗皂化瓶.并人分液拐斗中。 一.一一广一—一一一一DB13/T210-94一一一一—口摇动分液漏斗，偶尔启塞，以减低瓶内压力。静置等待两层液体分离·摇时不要用力过猛，否则易成乳状，难于分离。如遇此种情况，可加乙醇数ml;若仍无效，可再加水数ml即可分开。④将水层放入第二个分液漏斗内，醚层仍留在第一个分液漏斗内。⑤再以醚约30ml分两次冲洗皂化瓶，倾人第二个分液漏斗中，振摇之。静置待两层分离后，将水层放人三角瓶中，酿层放人第一个分液漏斗中。⑥重复1-2次或至水液中无维生素A为止.。c洗涤:0将约30ml水加人第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去下层水液。0将约16---20ml0.6NRNC氢氧化钾液加人液漏斗中，轻轻振摇后，放人下层碱液。经此洗涤后可除去酸溶性酸皂。③继续用水洗涤，每次用水约30ml，直至最洗液与酚酞指示剂无颜色反应为止〔大约三次即可)。④在放去最后一次洗涤水后，将酿液静置10~20min，然后小心放出析出的水分。d蒸发醚液:①将醚液经过无水硫酸钠滤入260或300ml三角瓶。再用约26ml醚冲洗分液漏斗及硫酸钠两次，并人三角瓶中。、②将三角瓶于水浴上燕馏，收回醚液，待瓶中剩约6m1时取下，用抽气机减压抽干。，立即加人一定量的氯仿使溶液中维生素含量在适宜浓度范围内。e显色及比色:0于一比色管中加人loml氯仿，加人一滴醋酸酥。②于一’比色管中加入lml氯仿。③于其余的比色管中分别加入各lml样品溶液及1滴醋酸配。④象制备标准曲线时一样进行比色，记录光密度。例:样品2g皂化提取蒸千后，溶于6ml氯仿，吸llm氯仿液作比色测定，从标准曲线上得知此液每lml含维生素A23.41U,每100g样品含维生素A-23.4x5x(100/2)“68601U 侧由3/T210-9sA2.2.2.2研磨法适用于维生素A含A较高的样品，特别适用于肝的分析。此方法步骤简单同省时间，结果准确。但当每9样品中维生素A含t少子6-10Pg时不宜用此法。因在此情况下显色时受维生素A以外的脂溶性物质的干扰，加人三氯化锑时发生混浊。a研磨精确称2--6g样品放人事先已有3-5倍样品重的无水硫酸钠的乳钵中研磨之，至样品中水分完全被吸收，两者很匀为止。不要用太多硫酸钠，否则会在以后用乙酸提取时形成大量很细的棍悬物，不好分离。如果样品在冰冻状恋下就开始研磨，需用的硫酸钠要少些，磨干得也快些。b提取小心将全部磨干的样品棍合物移人带盖的三角瓶内。准确加人60-rlOOm1乙酸。紧压盖子，用力摇2min，使样品维生素A溶于乙酸中。然后将瓶子放置一边，待其自行橙清(大约需1-2h)，或用离心机来分开固体物。因乙醚易挥发，在夏天这几步最好都在冷水浴中进行。装乙酸的试剂瓶也应事先放人冷水浴中。c燕发取乙醚液2-,-6ml，放人比色管中，在?0-80℃水浴上抽气燕干。立即加入抓仿lml溶解残渣。首创此法的作者指出，应在通甄气的情况下燕干(我们试验的结果不通氮也可以，维生素A回收率在98%以上)。d显色及比色同皂化法中显色及比色部分。例:取肝样品2g与硫酸钠研磨后以lOOm1乙吐提取。取2ml乙醚液燕干后，溶于lml抓仿中，比色，从标准曲线上查出lml抓仿溶液中含有lOIIIo1008样品中维生素A含量一10x(100/2)x(100/2)=26000W注:0乙趁中是否有过载化氮的检脸法侧6ml乙吐入试苍中，加入灼1m160%HL，摇报0.6--lmine如来乙眺中含童有多7t过软化氮刻可将BL中的曦孰化，放出游离峨，水层呈黄色。扣无明A的黄色，别可加入1滴1%旋粉瘩液，有过载化氮则水层出则!色.2HL+H,O,~L,+2gOH口酒精中是否含睡的检脸法先配制孰化橄氛液备用(加浓氛液于6%AgNO,中，直至氧化银的沉沈重溶解为止.加入10%NaOH毅滴，如发生沉沈，再加入浓氛液使之洛解)。 一一一一一一一一一一一一一一一一DB13/T210-94一一一.一于试管中盛2m1上迷氧化银氛液，加入几滴英馏出的酒精摇匀，加入少许10%NaOH液加热。如酒精中已无醛，则没有银沉淀，否则有银镜发生。RCHO+2AgOH+NH,OH~RCOONH,+2Ag杏+2H,O③氛仿分解物的检验法氛仿不德定，放I后易受空气中氧的作用生成氛化氮及光气。2CHCL,+O:一2HCL+2CCL,0检查时可少取少量氛仿笠试管中，加水少许摇振之，使HCL溶到水层，加入几滴AgNO,液，如有白色沉淀即说明氛仿中有分解产物。④装过三氛仿锑的瓶子或管子应先用盐酸洗，然后再用水洗。如此时仍有白色沉淀产生，仍须再用盐酸洗，因三孰化锑易水解，生成不容解于水的白色沉淀:SbCL,+2H,0~SbOCL杏+H,0+2HCL⑤样品中维生素A已否提净的检脸法取最后一次的醚提取液2m1孟于试管中，加入少许三氛化锑。如无蓝色反应，说明维生素A已经提净。样品中含维生素A11000IU时用40ml乙醚提取6-6次即可提净，样品含量低者提取3-4次即可。⑥有人指出，蒸发及抽干时应通入二氧化破或氮气，以防止维生素A氧化玻坏。抽干的时候应尽速加入熟仿，因维生素A在干燥状态下极易被氧化破坏。使用一般分光比色计时，调节未知溶液使其透光度在30.70%之间，可得较准确的结果。A3.胡萝卜素测定法(柱层离分析法)A3.1原理、仪器及试剂A3.1.1原理胡萝卜素常和叶绿素、叶黄素等共存于植物中。这些色素都能被有机溶剂提取，所以测定时一定要将胡萝卜素与其它色素分开。以前常采用液层分离法，利用双丙酮醇或甲醇，将其中的叶黄素等与胡萝卜素分开。此法的缺点是不能完全除去不具生理价值的类胡萝卜素，因此所得结果不能代表真正的胡萝卜素含量。目前为大家广泛采用的柱层离分析法，利用一定的吸附剂对不同色素的不同吸着能力，将样品提取液中有生理价值的胡萝卜素从类胡罗卜素中分出来。在适当条件下，各种色素被吸在吸附柱的不同位置上，形成色层谱。然后用洗脱剂将所需要的胡萝卜素洗下，在吸收光最多的波(长下测定其浓渡，从而推算样品中所含胡萝卜素含量。A3.1.2仪器 —一一行DB13/TA0-94一一「—~一一一砂一一一下列仪器设备可够一个人同时作8个侧定之用。名称规格数量厚壁杯容量约lOOm1,底及壁要厚;8底部内面半回形.磨成糙面，另附研锤玻璃漏斗6~6cm8抽气管16x2.6cm，上侧有抽气支管8分液漏斗300-600m110水浴锅1离心管或试管15X160mm8层析管上端漏斗形部分容积约60m1;中部长约1Scm，内径0.8-1cm,下部长约7--8cm，内径。.6-0.6cmo塞棒可用一个木质或金属小板或软木塞上装长柄。小板或软木塞直径1应比层析管中部内径小0.1-0.2cm，使之能在其中上下自由移动，以压平吸附剂。锥形瓶126m18光电比色计1(或分光比色计)量筒26,100m1各1抽气机1普通燕锅1胡萝卜素因易为紫外线所破坏，所以玻璃器具最好用棕黄色的。AS.1.3试剂A3.1.3.1丙酮。AS.1.S.2石油酸为侧定新鲜蕊莱果品用的石油酸，沸点应为40"-70"C;为侧定干菜干果等用的石油醚，沸点应为80--100"C。此石油酸应不含水分及杂质。沸点限度及纯度均不够标准的市售品，应重行燕馏后再用。 一一一一一一一一一一一一一一DBl80}100℃石油醚可燕抽工业用汽油，收集80-100℃部分备用。AS.1.3.3活塞滑润剂22g甘油加9‘可溶性淀粉，‘加热至140℃后放it1.6h，倒出上层，静置隔夜即可用。A3.1.3.4玻璃粉将碎玻璃于铁磨中磨细.用20目网眼的筛子筛过后，先用浓盐酸浸泡，使铁溶去，然后再以淡氢氧化按浸泡，最后用清水洗净至中性后在烘箱中烤干。A3.1.3.6无水硫酸钠为脱水之用，不应有吸着胡萝卜素的能力，所以每用一批新的无水硫酸钠，都应将它和少量胡萝卜素溶液在一起摇振，然后看留在溶液中的胡萝卜素有多少，如损失过多则不能用。A3.1.3.6滤纸用不吸着胡萝卜素的滤纸;不吸着胡萝卜素的棉花也可用。A3.1.3.7吸附剂吸附剂的种类很多，一般采用纯氧化镁0。用前将氧化镁通过80-100目网眼筛子筛过，然后置烤箱(800--900.0)中烤3h备用。A3.1.3.8氢氧化钾60g氢氧化钾溶于60ml水中。A3.1.3.9脱醛乙醉制备方法见维生素A侧定法。A3.1.3.10乙醚须无过氧化物存在方可应用，其处理方法见维生素A侧定。A3.1.3.11酚酞溶液lg酚酞溶于少盆乙醉，然后稀释至100m1,A3.1.3.12洗脱剂3%丙酮的石油酸浴液。一般用3m1丙酮加人97m拓油醚(80-100℃部分)中作洗脱剂，加人丙阴之I可随悄况在2-10%间改变。丙酮越多，洗脱力越大;但必须注意只使胡萝卜素冲洗下来，而不使其他色素随着冲下来口。A3.1.3.13胡萝卜素标准液溶20mg晶体标准胡萝卜素印于3--6m1抓仿中，然后以石油酸稀释至50ml。由此再稀释至作标准曲线所需要的各种浓度。此标准液于临用时配制，因为它在2-3天内就会破坏。A3.2侧定步骤与结果计算A3.2.1侧定步骤胡萝卜素易为阳光破坏，所以在实验进行中应邀免阳光直接照射，在较暗的实验室即可。AS.2.1.1提取a从新鲜蕊莱及水果中提取胡萝素，主要用Booth氏法，略加改进。0将新鲜样品以燕汽处理02-6min后(燕前及燕后都要称重)!打碎机中打碎 __~一.-一DB13JT210-94一一一一一一一一一一一一一一一一(如样品过干不易打碎，则可加人已知重量的水分。但加人的水分应尽可能的少)或切碎。称1--2g样品(估计其中应含有60-100g胡萝卜素)，放人厚壁杯中，立即加人1--2g玻璃粉及6-8ml1:1的石油醚丙酮溶液，以玻璃锤研磨之。②静置片刻，将上部澄清液倒入一盛有约lOOm1水的分液漏斗中。③将剩下的残渣用力研碎，然后加人6-r8ml石油醚丙酮(1:1)混合液，再磨·待澄清后，倒入前一分液漏斗中。因重复前一步操作，如样品多时，可在提取一两次后用纯丙酮提取一次，然后再继续用混合液提取，直至没有胡萝卜素提出为止⑥。⑤摇动分液漏斗lmin后静置之，使水与石油酸分开，然后放水液层人另-600ml分液漏斗中。⑥以水洗3-4次⑦，将水液层集中在另一液漏斗中。0向盛水液的分液漏斗中，加入6ml石油酸，摇动，放去水液层，将石油醚液加人样品漏斗中曲。⑧向合并的石油醚样品溶液中，加少许无水硫酸钠，摇振后装人层离管进行分离。b从干制植物性样品中提取胡萝卜素，主要用Quac-Kenbush氏法·0将干样品磨碎，用40目网眼筛子过筛。②称干样品。.6-4g(一般用1g)，放人一锥形瓶内，加入20ml3:7丙酮和石油醚(8。一100℃部分)混合液，在电热板上回流1h。回流速度应调节至每min从冷凝管滴下石油醚1--3滴，或加上塞子放置室温暗处过夜(至少16h)0·③将锥形瓶内混合提取液倒人一盛有约l00ml水的分液漏斗中。④将残渣连续提洗数次，每次用约6-,-8ml石油醚，提洗液并人前一分液漏斗中，洗至提取液无色为止。(5)(6)(7)(8)四步同新鲜蔬菜及水果。。动物性食物及其它含脂肪的食物，称样品1--4g(约含胡萝卜素60-100jig),皂化，提取步骤完全与维生素A测定中的皂化与提取相同，唯最后乙醚液经减压蒸干后，加人20ml石油醚溶解之。准备装人层离管。A3.2.1.2层离a层离管制备。①装少许玻璃棉或脱指棉于层离管尖部，压紧后，装入氧化镁约1Ocm高晒，装时以手轻击管柱，可使其更加均匀。②将层离管接在抽气管上抽气。以有柄小塞棒轻压。如仍需加人吸附剂，则应先将表面用骨匙或铁丝弄松后再加，以免前后加的氧化镁不能很好地相连。管 一一一一一一D81塑810-94‘一一一一一一一一一一一内的氧化镁装至约高8cm后，将表面压平(见图4).图4层离装置③加人约lem高的无水硫酸钠(12)④加10--20m1石油醚于层离管内.使吸附剂湿透并赶走其中的空气。抽气管内可放一试管或离心管以接纳上面流下的液体。b分层及洗脱。0当硫酸钠上面还有少许石油醛时，即将提取液自分液拐斗中倒人层离管。立即抽气。0用6-10m1洗脱剂洗分液漏斗，待提取液已几乎全部进人硫酸钠时.加人层离管(13).0连续用洗脱剂洗层离管至胡萝卜素随溶剂洗下，溶液出现黄色。将此黄色液接于试管或离心管中.管子满后可倒人量瓶‘均。④继续冲洗至找液由黄色变无色为止。口集中全部黄色液体在一量瓶内。用石油酸稀释至刻度，浓度最好在每.1含1~tug-A.3.2.1.3、浓度侧定a未知液浓度洲定。0在分光比色计光波长440n.处侧定溶液硕色的强度，以石油酸作空白。溶液颜色愈深，表示所含胡萝卜素越多。0以比色所得读数在标准曲线上查出每iml所含胡萝卜素的量，然后根据取样 ______DB131T210-94______悄况计算每100‘样品所含胡萝卜素童(iq0b标准曲线或标准曲线表的制备0精确称取晶休纯日胡萝卜素或90%p及10%a胡萝卜素20mg，溶于少量抓仿中，然后以石油酸稀释至60m1,0用上述标准液配制不同浓度的标准液(0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,2.4ug/ml)，于分光比色计上440nm波长处侧定其光密度。口以标准液的不同浓度及比色所得光密度读数在方格纸上画成曲线。此曲线应为一直线，即浓度与光密度成正比。A3.2.2计算例:.新鲜菠菜100g,经过燕汽处理后重，8g，打碎后称取2g，用上法侧定胡萝卜素含量。最后收集滤液并稀释至60ml，在比色计中侧其光密度为0.42。样品中胡萝卜素含量可先查标准曲线表得出每ml溶液含1.723ug,则应计算为:1.723x50x(100((2x100)〕x〔98(燕后重f)/100(荟菌重2))二4.221mg/100g注:(1)由此法所侧得者系总胡萝卜素含童，即。一胡萝卜素+R一胡萝卜素+丫一胡萝卜素。但a一胡萝卜素及丫一胡萝卜素的生理价位均只及R一胡萝卜素的一半。不过一般筑莱中a一胡萝卜素，}&Y-胡萝卜素含黄极少，唯胡萝卜中a一胡萝卜素与R一胡萝卜素约相等，扁豆中也有少童a一胡萝卜素。(2)氧化提作胡萝卜素浏定很合用，因它的吸看力强，能将胡萝卜素与叶黄素、番茄红素、叶绿素等色素很好地分开，且不会孰化胡萝卜素。用氧化铁作标准液的回收试脸。回收率在96-100殆之间，用过的氧化镁还可以恢复其吸着力。其方法是首先将用过的氧化俱在层离管中抽干落荆，然后连管一起放日光下晒干或放洪箱中洪干。洪时务必注意先把洪箱门开放一点，使瘩剂气化后选出，以免发生斌烧危险。干后收集上钾硫酸钠留特再制，将下面氧化镬用细筛婶过，在800--900"C洪箱中烤3h即可恢复其吸着力。(3)根据我们的经验，当洲定新鲜筑菜果品时，仅用石油ifs(80---100"C钾分)作洗脱剂足以使人们满意，而不需要加入丙酮。不过若发现速度太慢，可以用加有30/0丙翻的石油酸液作为洗脱刘，以增加速度。(4)我们所用晶律标准胡萝卜素含90%日一胡萝卜素及10%a一胡萝卜素。(5)落气处理样品的目的在于玻坏其中的峰，使胡萝卜素免受损失。蕊气处理 _二DB13JT210-94_后，组织较松软，提取较容易。(6)XI脸样品是否提净，可将提取液侧入盛有3--4ml水的试管中，摇振后看上却石油硅层的衣色。扣为无色，则已提净;加为黄色，则仍须维续提取;加在两三次提取后样品完全脱水了，可加入3-4A水一起研磨。这不仅可带助提取色素，而且使残渣泉集，容易将提取液例出。⑦水洗的目的爱洗净丙酮，以免层析时，减低了吸附荆对色素的吸附力。(8)有的文伙说要洗3次，但我们的经脸1次即可。(9)有的文蔽说干样品应先用少全水池6-10min,然后再加提取荆。我们的经脸是加水后会使样品粘在一起，使提取更加困难，不易提净。帅一般跳莱浏定时，不需加入太多载化候，压梦后只要有8cm高即够。洲定名化样品中胡萝卜素，氧化模柱可稍加高(lOcm)e仙抽氛机应一直开动着，以便使吸附荆压得较均匀一些。如欲使色素分离较快，或者使色层看并更清楚，可用1:1的氧化铁与super-eel的混合物作吸附荆。super-cel爱一种劝滤荆，可增加过涟速度。叼加入无水硫酸钠，为的足防止上部吸附鹅在层离过程中被扰动，同时可吸收提取液中徽t的水分。叼aAE过层离管下来的首先是无色液体，因色素已被吸看。将此无色液例入一瓶中待落偏后再用;或用作冲洗液。b当第一次用冲洗荆洗分液资斗时，应少用一点，使色素能吸在较摄的段吸附剂上而有较长一段吸附荆留作分层用。c吸附柱上色素排列的次序加下(由上到下):叶绿素、叶黄素、德黄素、番茄红素.Y一胡萝卜素、日一胡萝卜素、a-胡萝卜素。树a在冲洗过程中应使硫酸钠一直有洗脱剂浸着，不可抽干，否则会有空气被吸入而使胡萝卜素玻坏。b层离管的冲洗速度与色层的清造程度，根据洗脱荆中丙酮的百分比来决定。丙酮的比例可在0-10%间变动，丙阴多些可使冲洗较快。若提取液中有多童无生理作用的色素，和叶黄素、番茄红素及其它固醉等杂质，别应使用丙阴较少或不加丙酮的冲洗液，使它慢慢分开。c如若胡萝卜素与非胡萝卜素同时被冲洗下来，到可将此液体浓编后再如前法例入一断的层离苦内层离之。的加热时日一胡萝卜素极易异构化，而生出断的日一胡萝卜素。断日一胡萝卜素同时录存在于自然食物中.因此要侧得较准确的胡萝卜素含I，可在436nm处比 DB13/T210-94色。因为在此波长处两种色素的吸光能力相等，所以一般选择440nm。有的人用460nm，其盖误在10%以内。A4配合饲料维生素D测定法(SbCL.比色法)A4.1原理、仪器、试制及层析柱、样品的制备A4.1.1原理维生素D测定法有生物学法、气相色谱法、高效液相色谱法及三氯比锑比色法。对于维生素D含量较高的样品，例如:鱼肝油或强化食品，三氯化锑比色法仍是一种可行的方法。维生素D与三氯化锑乙酞氯二氯乙烷溶液作用后呈淡粉红色，其颜色的深度与Vo量成比例关系，在比色以前用毛地黄皂贰沉淀胆固醇，用吸附剂除去干扰杂质，并用马来酥沉淀速留醇，然后在600nm和660nm处比色测定。A4.1.2仪器名称数量721型分光光度计1旋转浓缩仪1真空泵1高纯氮气1恒温水浴1振荡器1260m1圆底皂化瓶12600m1具塞三角瓶4层析主2.Ocm内径X30.Ocm长柱体，柱体上123.Oc。内径X10.Ocm长圆柱泡。圆柱泡上的磨口可接260m1分液漏斗，柱下端具塞A4.1.3试剂A4.1.3.1石油醚(AR30-,-60℃重燕)。A4.1.3.2无水乙醚(AR重蒸)。A4.1.3.3异辛烷(AR重燕)。A4.1.3.4甲苯(AR重燕) 侧血封T210-男A4.1.3.6苯(AR重燕)。A4.1.3.6乙跳抓(AR重燕)。A4.1.3.7醋酸醉(AR)。A4.1.S.8无水乙醉(AR).A4.1.S.9碑酸氢二钠(ARNa,HPO,"12H,0).A4.1.3.10丙三醉(AR).A4.1。3.11氢镇化钠(AR)。A4.1.3.12氢氧化钾(AR).A4.1.3.13BHT(2,6一二叔T基对甲醋AR).A4.1.3.14VD,(VitaminD,USP)。A4.1.3.16毛地黄皂贰·A4.1.3.16聚乙二醉600.A4.1.3.17中性氧化铝(80-10。目色谱纯)。A4.1.3.18酸性101白色担体(ChromosorbW色讼纯)。A4.1.S.19漂白土(fuller"searth色谱纯)。A4.1.3.20二抓乙烷(AR)用60gKOH和约‘Ocm哟侣箱回旅IL=抓乙烷，h,移走HOH和铝箱，将溶液和6gp,O者未一起摇动.燕.收集.弃去前50ml收集溶液。A4.1.3.21染色抑翻溶液异辛烷、甲苯、.巨醉1:1:1V矛V.A4.1.S.22抗坏血酸钠涪娜3.6g抗坏血曲于20m1INN&OH溶液中。当日配翻。A4.1.S.28硫化钠洛液溶解12gNa刀"9H,0于，Oml水中.用87%的丙三醉稀释至100=1.A4.1.5.24焦性没食子橄铸液称取20g焦性没i子酸于少许无水乙.中.称释至lOOml.A4.1.3.26马来醉溶液A.-贮任液:取IOg马来醉溶于少许苯中招释至100ml，存冰箱中。B.工作液:取1.0m1贮奋液用甲苯稀释至loml以获得1%洛液。A4.1.5.26染色剂a贮备A液称取110‘三抓化锑(AR或CP)溶于400=1=抓乙烷中。加人粗无水AL,O,M合，通过挂纸过泣于600=1容f瓶中。用二抓乙烷招释至刻度。取一定I配制好的A液到2cm比色瓶中，以二抓乙烷为空白.在600n二处翻定.吸收的光密度应小于0,070. 一一一一一一一-一一一一一一DB13b贮备液B液在通风柜中将lOOm1无色重燕抽的乙跳抓与400m1Z抓乙烷混合，贮存在冰箱中。。工作液取90mlA液与lomlB液混合，贮存在有盖棕色瓶中，不用时存于冰箱中。A4.1.S.27维生素D标准液。a贮备液准确称取26.Om‘维生素D标准品(VD,或VDJ。以少许异辛烷溶液(每lOOm1含有0.6gBHT,20%甲苯)溶解，移至l00ml棕色容I瓶中稀释至刻度，存放冰箱中。b工作液移20mlr备液至lOOm1棕色容it瓶中，用含20%甲苯的异辛烷溶液稀释至刻度。A4.1.4层析柱的制备A4.1.4.1柱I筛选AL,O.收集80-10。目的部分。称取260g置人2L锥形瓶中，加人1.BL水和40gNa,HPO,12H,0。将瓶置燕汽浴上加热30min，不时搅动。冷却后将AL,O.倒人布氏漏斗中，抽气过滤后，将AL,0.移至直径22cm玻璃盘中，置160℃干澡箱中3h后，移到真空器中抽真空，冷却到室温，贮存在具塞瓶中。称取30‘处理过的AL,0.于lOOm1具塞瓶中，加水1.Sml,盖塞，在燕气浴上加热到瓶中AL.0.自由流动为止(瓶中AL.0环成团，不粘瓶)。在柱中装2/3石油醚后，放一玻球及少许玻棉，用玻棒将玻棉压到柱底，使成一平面·玻棉中应无气泡。用石油酸将处理的AL,O,移人柱中后，用氮气压一下液面使AL,O,紧一些。此AL,0.柱仅可用一次。A4.1.4.2柱II将16g聚乙二醉60。置于1L具塞三角瓶中，用160m1苯溶解后，加人30g酸性lot白色担体·摇动6min,滤去苯液。用lOOm1石油醚冲洗后，滤去石油酸。重复二次。在柱中装2/3石油酸后，放一玻璃球及少许玻棉，用玻棒将玻棉压到柱底，使成一平面，无气泡。将处理好的担体倒人柱中少许，用玻棒压紧，再倒人少许，再用玻棒压紧，直至装完为止。打开柱塞，放掉石油酸至担体表面时，移100m1异辛烷至柱中冲洗出柱中石油酸。A4.1.4.3柱in称取100g漂白土(fuller,eearth)于1L三角瓶中，加人600m1无水乙醉，在燕气浴上煮沸数分钟，搅拌。滤去上层含有胶体的悬浮液，用2份260m1无水乙酸重复冲洗漂白土。滤去无水乙醚后，将漂白土移至260m1旋转燕发瓶中，I旋转浓缩 一一一一一一一一一一一一一一一一DB13/T210-94-____仪上，在沸水浴中真空干燥，然后将粉状漂白土存干千操器中。称取log处理过的漂白土置于lOOm1具塞三角瓶中，加水1.6ml。用玻棒将漂白土团搅碎，盖塞在蒸气浴上加热。轻轻摇动三角瓶，使漂白土成均匀粉状。如瓶中有小团块，可将漂白土移至研磨器中，加少许异辛烷磨匀。移20ml石油醚至盛漂白上的三角瓶中。柱中装2/3石油醚后放一玻球，加少许玻棉，并用玻棒将玻棉压到柱底，使成一平面，无气泡。用石油醚将三角瓶中处理好的漂白土冲洗至柱中，令其自然沉淀。五、样品制备1,配合饲料称取lOOg于粉样于600m1具塞三角瓶中，先加乙醚一一石油醚(1:1V/V)液100m1,盖塞，振荡30min，用玻璃漏斗和定量滤纸，将提取液滤入260m1旋转蒸发瓶中:再加l00ml乙醚一一石油醚到三角瓶中，盖塞振荡16min。将提取液滤人同一旋转蒸发瓶中:最后加60ml乙醚一一石油醚液到三角瓶中，振荡1Omin，将提取液滤人同一旋转蒸发瓶中混合。把旋转蒸发瓶置旋转浓缩仪上，在40℃水浴上真空蒸干。用氮气恢复大气压。取下瓶后，用氮气吹去瓶中残留溶剂。移20ml2。%焦性没食子酸，loml抗坏血酸钠溶液，3滴Na,S溶液，26ml无水乙醇和IOml60%KOHW/V水溶液至蒸发瓶中。将蒸发瓶置蒸气浴上，回流30min，立即移6m120%焦性没食子酸至热溶液中。待蒸发瓶中溶液温度降至60℃时，移loml2%(W/V)毛地黄贰水溶液至瓶中，放置30min，当瓶温至室温时，转移溶液至600ml分液漏斗中，移200ml6%(W/V)的KOH水溶液至燕发瓶中冲洗瓶壁并转移到600ml分液漏斗中，并加人lOOm1苯。用力摇分液漏斗数秒钟，静置分层，小心弃去水相。再移40ml3%(W/V)KOH水溶液至漏斗中，摇动后待其分层，弃去水相。移40ml水至漏斗中冲洗苯层，弃去水相，再重复冲洗6次。在放去最后几滴水后，用“片直径9cm的滤纸剪成数条，投入漏斗中，摇瓶待溶液清晰乓，转移溶液到260ml旋转蒸发瓶中。将旋转蒸发瓶置旋转浓缩仪上，在40℃水浴上真空蒸干。用氮气吹净瓶中残苯。2、胶九、油剂、粉、片剂称取一定量样品于10m1棕色容量瓶中，用苯稀释至刻度〔维生素D量约20001u/ml)。移lml样品到260ml皂化瓶中，用氮气吹去瓶中残留溶液，迅速加人10ml20%抗坏血酸钠溶液、3滴Na,S溶液、20ml焦性没食子酸溶液、lOml60%KOH溶液·26ml无水乙醇到皂化瓶中，在蒸气浴上回流30min。到时立即加6ml20%焦性没食子酸溶液和80ml无水乙醇至热溶液中，待溶液温度降至60℃时，再加 一—一—一一一一一一DB13/"210-9410m12%毛地黄贰水溶液和23=1无水乙醇。放置30min，待溶液温度降到室温后，力p100ml苯，把溶液转移至600ml分液漏斗中，再加40=l6%KOH水溶液，金塞，摇动108，使溶液静置分层，弃去水相。加40ml3%KOH水溶液到漏斗中，摇动后放置分层，弃去水相。当排去最后几滴水后，加人40m1水冲洗苯层，弃去水相。如此再重复6次。弃去最后几滴水，把2张直径9cm滤纸剪成数条投入分液漏斗中。摇动，待溶液清晰后，转移苯层至260ml旋转燕发瓶中。置旋转蒸发瓶于旋转浓缩仪上，40℃水浴真空蒸干。用氮气恢复大气压，取下瓶后，用氮气吹去瓶中残留苯。A4.2测定步骤与结果计算A4.2.1层析柱分离移2ml石油醚至蒸去苯的旋转燕发瓶中，轻轻转瓶，当将柱I中溶液移至担体表面时，用滴管小心地将瓶中溶液移至柱I中，然后用8ml石油醚分数次冲洗瓶壁并移至柱I中。当液面流到AL,O.表面时，用200ml8%(V/V)无水乙醚一一石抽醚洗柱，淋洗速度小于1Om1/min，弃去淋洗溶液。当最后一些淋洗液到达AL,O,表面时，用160ml30%(V/V)无水乙醚一一石油醚液淋洗层析柱，收集淋洗液于260=1旋转燕发瓶中。将旋转蒸发瓶置旋转浓缩仪上，在40℃水浴上真空燕发至干。用氮气恢复大气压.取下瓶后用氮气吹去瓶中残留溶液。把柱I的出口置柱IQ的进口处，打开柱1阀，使柱中溶液流至柱II中，当溶液流到柱II担体表面时，关阀。让柱IQ中的溶液也流至距柱M担体lcm处。从装有70ml异辛烷的260ml分液漏斗中，移2ml异辛烷至收集柱I淋洗液而燕干的燕发瓶中。轻轻转瓶后，用滴管将溶液移至柱I担体表面。重复2次。把以上装有异辛烷的260ml分液漏斗置柱II上，开塞。以2.Om1/min流速淋洗柱1使其流至柱Il中，保持柱II液面约6cm，并使柱m和柱n保持相同流速。弃去淋洗液。当柱ii中最后淋洗液到达担体表面时，VD已被淋至柱m中，VA仍在柱I中。关柱11阀，取下柱a，用160m1异辛烷淋洗柱I，供下次用。当柱m的淋洗液面到柱担体表面时，移30ml异辛烷至柱m中，淋洗，弃去淋洗液。当最后淋洗液到柱担体表面时，移160m1苯到柱m中淋洗，收集淋洗液于260m1旋转燕发瓶中，待苯淋完后，置燕发瓶于旋转浓缩仪上，在40℃水浴上真空干燥，用氮气恢复大气压，取下瓶后用氮气吹去瓶中残留溶液。A4.2.2马来酥失活移1.Om11%马来配溶液至以上收集柱m淋洗液而又被燕干的旋转燕发瓶中，盖塞，小心旋转燕发瓶洗瓶壁后，放置30min.移40m1异辛烷到燕发瓶中。 ___.__一.一一DB13/7210-94‘一一一一A4.2.3比色测定从蒸发瓶中移2.Oml马来配失活样品至2cmxlcm比色杯1中，移200IU/ml标准溶液2.Oml至杯2中(标准溶液取量吸收值和样品收值愈近愈好)，移1.Oml样品溶液和1.Oml染色抑制剂至杯3中，以2ml20%(V/V)甲苯异辛烷加6ml染色剂为空白，依次向杯1,2,3中移6ml染色剂，依次在600nm处测定46s时的吸收值为A,(600),A,(600).A,(600)，再准确测定120。时在660nm处吸收值为A,(660),A,(660)、A,(660)。A4.2.4计算对于不含多种维生素样品的计算，可查标准曲线或通过下式计算·VD/g=Cx(Vs/W)xA,(600)/A,(600)对于多种维生素样品计算如下:VD/g=Cx(Vs/W)xAD(600)/A,(600)又AD=〔Q/(Q-P)〕xA,(600)一〔1/(Q-P)〕xA,(600)式中:P:A,(660)/A,(600)Q:A,(660)/A,(600)C:VD。或VD,(ug或IU)/mlW:样品克数V。:最后样品体积A6总抗体血酸测定法(2,4一二硝基苯拼法)A6.1原理、仪器及试剂A6.1.1原理总抗坏血酸是包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸而言。目前应用最广泛的分析方法是2,4一二硝基苯脐比色法。本法的原理是将样品中的还原型抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，然后使之与2,4一二硝基苯麟作用，生成红色的脉。脉的含量与总抗球血酸含量成正比。将脉溶于硫酸后，进行比色，由标准曲线计算样品中的含量。A6.1.2仪器下列仪器是分析一个样品所需要的。 DB13/T210-94名称规格数量打碎机或乳钵1离心机适合于60m1离心管用1恒温箱1烧杯600MI1lOOm12漏斗6.0--6.Ocm直径量瓶lOOm1离心管60m1滤纸三角瓶looml126ml吸管1，2，6，10,26ml各若千刻度吸管6功12试管16X160mm滴定管60MI滴管A6。1·3试剂A6。1.3.19N硫酸谨慎地加260ml浓硫酸(比重1.84)于700ml燕馏水中，冷却后稀释至looomloA6.1.3.22%2,4一二硝基苯麟溶解2g2,4一二硝基苯麟于100ml9N硫酸内，过滤。不用时放冰箱内，每次用前必须过滤。A6.1.S.32%草酸溶解20g化学纯草酸结晶于700ml燕馏水中，稀释到1000m1,A6.1.3.41%草酸稀释600ml2%草徽到lo00ml,A6.1.3.61%硫服溶解6g硫服于60。二11%草酸中。A6.1.S.62%硫服溶解log硫崛于600m11%草酸中。A6.1.3.786%硫酸谨慎地加900ml硫酸(比重1.84)于lOOm1燕馏水中。A6.1.S.8活性炭100g活性炭加760m11NHCI中回流1--2h，过挂。用燕馏水洗数次，至滤液中无Fes+为止，然后置于110℃烘箱中烘千。A6.1.S.9标准抗坏血酸溶液溶解100mg纯抗坏血酸于loom11%草酸中。 ———一一一一-DB13/T210-94一一一一—_—A6".2测定步骤与结果计算A6.2.1测定步骤A6.2.1.1提取a称100g样品和100g2%草酸，倒人打碎机中.打成均匀的浆。流质及干样品无需经此手续。b称10--40g浆(含1-r2mg抗体血酸)倒人lOOm1量瓶中，用1%草酸稀释至100ml,I昆合均匀。当分析干样品时，称1-4g(含1-2mg抗坏血酸)放入乳钵内，加人1%草酸磨成浆状，灌人l00ml量瓶内，稀释至lOOm1混合均匀。c过滤不易过滤的样品可用离心机使固体沉淀，而‘后倒出上层清液，即得滤液。A6.2.1.2氧化成脱氢抗坏血酸a用上述滤液26ml加人活性炭0.6g,摇荡lmin，过滤。也可用液体澳作氧化剂。b加10ml2%硫服于loml氧化提取液中，混合均匀，此液每lml约含loug总抗坏血酸。A6.2.1.3睐之形成a于三个试管中各加人4m1稀释液。b一个试管作为空白，在其余试管中加人1.Oml2%的2,4一二硝基苯阱溶液。_c将所有试管放人37士0.6℃的恒温箱中〔或水浴锅中)保温3h.d过3h后取出，除空白管外，将所有的试管放人冰水中。空白管取出来后使其冷却到室温，然后加1.Oml2,4一二硝基苯麟溶液，在室温中置10-,-16m"in而后放人冰水内，分析品管同样处理。A6.2.1.486%硫酸处理a当试管放人冰水中后，向每.一管中加人6m186%硫酸。加硫酸时须一滴一滴地加，加完6ml硫酸至少需时lmin。边加边摇动试管，因为如果溶液中含有糖、硫酸加得太快或温度升高时能使溶液成黑色。b将试管自冰水中取出，在室温中放置半h后比色。‘试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以必须计算好，加人硫酸半11后准能比色。A6.2.1.6比色a打开光电比色计，待电流稳定后，在波长620nm进行比色。如果能选出些 _一一一一DB13/1210-94一一一一一一一一一一一一一一一均匀的试管用以比色时，就可以在这些管中形成脉.以便直接拿去比色。b将空白管放人空白管的格子中，使其透光度读数为100%:将样品与它比较，以便校正因其它杂质形成脉所引起的误差。。将样品管放人另一空格中，记下其透光度的读数。A6.2.1.6制标准曲线a加1.Og活性炭于60ml标准液中，摇动lmin，过滤。b吸lOm1放人600ml量瓶中，加6.Og硫服，用1%草酸稀释至600m1.c吸出6,10,20,26,40.60,60ml稀释液，分别放人7个lOOm1量瓶中，用10/0硫服稀释至looml，使最后稀释成的溶液的浓度为lml中含有lug,tug,4ug,6ug,Bug,loug和12ug的总抗坏血酸。d照前述手续形成脉并比色。e以光密度为纵座标，抗坏血酸浓度(ug/ml)为横座标，画成一直线。A6.2.2计算(lt/w)x(100/1000)-long样品中含总抗坏血酸mg数。式中:ft:从标准曲线上读出的lml稀液中所含总抗坏血酸ug数。W:每lml稀释液中所含样品的重量(的。A6饲料矿物质的原子吸收法测定A6.1原理、仪器、试剂及样品制备A6.1.1原理将经消解处理好的试样直接吸人火焰，样品溶液中的待测金属元素经火焰原子化器原子化，并对光源发射的特征波长的光产生吸收。在一定条件下待侧元素原子的吸光度与其浓度成正比。将测得的样品的吸光度与标准溶液的吸光度进行比较‘确定样品中被侧元素的相对含量。A6.1.2仪器A6.1.2.1原子吸收分光光度计A6.1.2.2空心阴极灯，锌(Zn)灯，铜(Cu)灯，铁(Fe)灯，锰(Mn)灯，钻(CO)灯，镁(Mg)灯，钾(K)灯。A6.1.2.3自动回流消化仪 一一一一一一一一一一一一一一一Dl__A6.1’.2.4分析天平，感量0.0001g,A6.1.2.6容量瓶等常规玻璃仪器A6.1.3试剂A6.1.3.1高纯金属Zn,Co,Mn,Fe,Cu,Mg,A6.1.3.2硝酸HNO,,(A.R.)。A6.1·3.3高氯酸HCO,,(A.R.)。A6.1.3.4-氯化钾KCL(基准)。A6.1.4试样的选取和制备取具有代表性的试样，粉碎至40目，用四分法缩分至200g，装于密封容器中，防止试样成分变化或变质。A6.2测定步骤与结果计算A6.2.1试样消解(湿法)称取试样0.6--1.6g(准确至0.0002幻。无损失地投人自动回流消化仪烧瓶内，加入消化液(HNO,:HCLO,=2:6)6ml.回流消化至无色或微黄色，除酸至样品近干·然后以0.6mol"L-1HNO.溶解，转移至60ml容量瓶，以。.6mol"L-IHNO.定容。A6.2.2金属标准贮备溶液制备A6.2.2.1Zn标准溶液:称取高纯金属锌1.0000g加1mof"L-"HN0,100m1,加热溶解，冷后转移至l000m1容量瓶中，以lmol"L-"HNO,定容，摇匀.该贮备液含lmg"ml-"Zno临用时用0.6mol"L-"HNO稀释40倍。Zn标准溶液含26pg"ml-"Zn,A6.2.2.2C。标准溶液:称取高纯金属钻1.0000g,溶于少量HNO,(1:1),蒸干(可在自动回流消化仪中进行)。用lmol"L-"HNO.溶解，转移至l000m1容量瓶中，以lmol"L-1定容，摇匀。该贮备液含lmg"ml-1Co.临用时用0.6mol"L""HNO,稀释4倍。Co标准溶液含260Ng"ml-"Co,A6.2.2.3Fe标准溶液:称取高纯金属铁1.0000g,溶于少量HNO,(1:1)，加热除去N0,,冷后转移至l000m1容量瓶中，以lmol"L-"HNO,定容，摇匀。该贮备液为lmg·ml-"Fe,或称取硫酸铁铁(NH,Fe(SO,)二12H,0)8.6928,溶于lmol"L-"HNO.中，转移至l000m1容量瓶中，用lmol"L-"HNO.定容，摇匀。该贮备液含lmg"ml-"Fe. —一..一DB13/"210-94一一一一一一一一—临用时用0.6mol"L-"HNO,稀释2。倍。Fe标准溶液含50Ng·ml-"Fe.A6.2.2.4Cu标准溶液:称取高纯金属铜1.0000g，溶于少量HNO,(1:1)中(可在自动回流消化仪中进行)。然后转移至l000m1容量瓶中，以lmo卜分"HN0,定容。该贮备液含lmg"ml-"Cue或称取硫酸铜(CuSO,"6H,0)3.9291g,溶于lmol"L-}HNO.中，转移至1000ml溶量瓶中，以lmol.L-"HNO.定容，摇匀。该贮备液含lmg"ml-"Cu.临用时用0.6mof"L-"HN0,稀释20倍。Cu标准溶液含60jug"ml-"Cu.A6.2.2.6Mn标准溶液:称取高纯金属锰1.0000g,溶于少量HN0,(1:1)中，冷后转移至l0000ml容量瓶中，以lmol"L-"HNO.定容，摇匀。该贮备液含lmol·ml-"Mn。或称取1.6826g氧化锰(Mn0,)，用lmol"L""HNO,溶解，转移至l000m1容’量瓶中，用1mof"L-"HN0,定容，摇匀。该贮备含lmg"ml""Mn,临用时用0.6mol"L""HNO而释2。倍。Mn标准溶液含60pg·二PMn,A6.2.2.6Mg标准溶液:称取高纯金属镁1.0000g,溶于1mo1.L""HNO,中，转移至l000m1容量瓶中，以1mof"L""HNO,稀释定容，摇匀。该贮备液含lmg·ml""Mg。或称取硫酸镁(MgSO,"7H,0)10.141g,溶于lmol"L""HNO.中，转移至1000ml容量瓶中，以lmol"L`HNO漏释定容，摇匀。该贮备液含lmg"ml-"Mg,临用时用0.6mol"LIHNO擂释100倍。Mg标准溶液为10)1g"ml""Mg,A6.2.2.7K标准溶液:称取氯化钾1.90688,溶于水，并转移至l000m1容量瓶中，以水稀释定容.摇匀。该贮备液含lmg"ml-"K.临用时用水稀释100倍。K标准溶液含lONg"m1""K,A6.2.3混合标准溶液:分别取上述标准溶液各6.OOml，在50ml容盆瓶中棍合，以0.6mol"L""HNO,定容·该混合标准溶液各金属元素含量为:Zn:2.6ug,"ml"";Co:26pg"ml"";Fe:6Ng·ml"";Cu:6Ng·ml-";Mn:6pg·ml";Mg:1pg·ml"";K:1N‘·MI-1.A6.2.4标准曲线 DB13/7210-94标准曲线:吸取混合标准溶液，0,1.00,6.00,10.00m1，在60m1容量瓶中.用。.6mol"L-1HNOa稀释定容，摇匀。此混合标准曲线系列溶液各金属元素的浓度如表to表1标准曲线系列溶液各金属元素浓度印g"m1"")混合标准溶液0.001.006.00体积ml一Zn0.000.060.260.60Co0.000.602.506.00Fe0.000.100.601.00Cu0.000.100.601。00Mn0.000.100.601.00Mg0.000.020.100.20K0.000.020.100.20各元素测定条件可参照表20表2各元素测定条件元素分析线nm灯电流mA然气/助嫩气(乙烷1空气)Zn213.8<101/3~1/4Co240.7<201/3~1/4Fe248.3<201/3~1/4Cu324.7<101/3~1/4Mn279.7<101/3~1/4Mg286。2<101/3~1/4K766.6<10贫然焰测出吸光度，以吸光度对浓度作图，绘出标准曲线或求出回归方程。 ___一一一一一.DB13/T210-94一一一一一一一一一一一一一一一一一一A6.2.6结果计算被测金属含量(mg/kg)一Cx60/w式中C为测出的试样浓度，W为试样质量。A7饲.料硒测定方法(荧光光度法)A7.1原理、仪器、试剂及样品制备A7.1.1原理样品经HNO:和HCOL。分解，把硒氧化成挥发性较低的H,SeO,，再加人HCL加热将其还原成H,Se0,。在酸性条件下2,3一二氮基蔡(DAN)与Se(IV)进行特异反应，生成能发荧光的4,6-节基苯并硒二哇，该物质能在酸性条件下转溶到环已烷中，而DAN在酸性溶液中不能转溶于环已烷中。测定环已烷溶液的荧光强度即可推算出Se的含量。A7.1.2仪器A7.1.2.1荧光分光光度计A7.1.2.2恒温水浴A7.1.2.3分液漏斗lOOm1A7.1.2.4分析天平:感量0.0001gA7.1.2.6烧杯、过滤装置等A7.1.3试剂A7.1.3.10.1%2,3一二氨基蔡溶液:取2,3一二氨基蔡0.06g加到0.lmol.L-tHCL溶液60ml中，避免阳光直射，在不断搅拌下，于60℃放置20分钟，’冷后用环已烷loml振摇洗二次，弃环已烷层，水层过滤备用，此液用时现配。A7.1.3.2高纯金属硒。A7.1.3.3荧光素钠A7.1.3.4EDTA:O.imol·L-lEDTA溶液A7.1.3.6盐酸HCL.(A.R.)A7.1.3.6高氯酸HCLO,(A.R.)A71.1·3·7氨水(A·R·)A7.1.3.8环已烷(A.R.)A7.1.4试样的选取和制备 一一一一一一一一一一一一一一一一DB13/"211(见饲徉矿物质测定方法)A7.2测定步骤与结果计算A7.2.1试样消解(湿法)称取试样0.6--1.6g，准确至0.0001g，无损失地投人自动回流消化仪烧瓶内，加人loml浓HNO,，室温放置4小时以上，然后直接缓慢加热16分钟，再继续加热1。分钟(火力可强些)，冷后加70%HCL0,6ml，加热浓缩，冒HCOL,白烟后，继续加热15分钟。冷后加水lml加热浓缩，冒白烟后加热2分钟，冷后加水lml，在沸水浴上加热30分钟，溶解，此液作试样溶液。A7.2.2硒标准溶液制备Se(N)标准溶液:准确称取高纯金属硒0.6000g，加浓HNO:约loml，加热溶解。可在自动回流消化仪中进行，燕发近干，除去大部分HNO,，然后加水2ml,.蒸发近干。再加70%HCLO.约2ml，加热浓缩至约lml。加HCL,6ml加热6分钟溶解，冷后转移至600ml溶量瓶中，用0.6mol"-"HCL定容，摇匀。该贮备液含lmg·ml""Se。临用时用0.lmol"L""HCL稀释6000倍。Se标准溶液含0.06Ng"ml""Se,A7.2.3测定步骤A7.2.3.1试样测定取试样溶液置于lOOm1烧杯中，加人0.lmol"L-"EDTA溶液2ml。用10%HCL或10%氨水调PH值1一1.6，加0.lmol"L-"HCL至全量约60ml，盖上表面皿，放人60℃水浴中，然后加0.1%2,3一二氨基蔡溶液6m1,避免阳光直射，轻轻振摇混合，于60℃下放置2。分钟。冷后将烧杯内容物移入lOOm1分液漏斗中，准确加环已烷loml，振摇抽提6分钟弃去水层，向环已烷层中加0.lmol"L-1HCL126ml洗二次，用干燥滤纸过滤脱水。于激发光波长378nm，发射波长620nm处测定荧光强度。苯并硒二哇溶液在测定前，只要避免日光照射能稳定2小时。A7.2.3.2标准曲线另取Se(N)标准溶液0,1,2,4,6ml，按试样同样操作绘制标准曲线，从而可求出硒含量。荧光分光光度计的灵敏度和重现性用荧光钠溶液调节。以标准溶液空白作空白试验，校正结果。A7.2.4结果计算 一一一一一一一一一一一一一一』竺样品硒含量(mg/]Kg)二m/W式中，为由标准曲线得到的含硒量，1i1为试样质量。 _DB/13T210-处-______附录B表B1组基酸参考指标实验动物种类营养成分(%)大、小鼠地鼠豚以家兔犬猫精益酸0.96一1.420.90-1.300.88一0.170.86一1.101，60一1.701.90一2.20组苏酸0.40-0.600.40-0.680.30一0.460.30一0.460.60一0.600.70-0.80异亮氮酸0.90一1.300.90-1.180.72一0.960.70一0.960.20一1.401.40一2.10.n亮组酸1.60一2.401.26-2.070.11一1.481.11-1.481.90-2.曰一。00-1.60.n0.86-1.300.70一1.000.69一0.910.69一0.91。20一1。UU1.20一1.40苯丙氮酸酷氮酸0.63一0.900.46一0.680.46一0.680.46一0.660.60-1.400.90一1.00苏抓酸0.70一0.940.70一0.900.67一0.760.66-0.760.90一1.001.20一1.60撷氮酸1.00一1.301。00一1.210.70一0.940.70一0.921.00一1.901.20一1。60表$2矿物质参考指标实验动物种类营养成分(%)大鼠、小鼠豚徽犬猫(mgtkg)地成家兔钾(%》0.7-1.00.6一1。90.7-0.60.7-0.8镁(%)0.2一0.90.2-0.40.2-0.30.2-0.3铁100一180100-180260-960260-900锰40一8040-6040一8640-96铜9一169一1418-1614一18锌60一6060一6060-9060一100确0.6-1.00.4-1.11.4-1.71.5-2.6硒0.05一0.20.06一0.20.06-0.20.06-0.2钻0.7一0.90.7一1.00.4-0.60.6-0.837 _p旦213T210-94_表B3维生素参考指标实验动物种类大砚、小鼠豚眼犬猫(-g/kg)地鼠家兔维生素B66一6660-7040-6090一100(I.Ulkg)维生素K0.2一0.80.2一0.30.1一0.90.7-0.9维生素B,8一127一109-107一14维生素B,10一306-205一68一10维生素B,6-106一96一126一9维生素B=0.06一0.080.04-0.080.03-0.060.02一0.06烟酸30-9040-6640-6040-60泛酸21-2612-199-119一14生物素0.4一1.10.2一0.450.2-0.40.1-0.3胆喊1000-16001000-16001400-20001800-2200附加说明:本标准由河北省实验动物管理委员会提出本标准由河北省实验动物管理委员会、河北省实验动物管理委员会专家委员会负责起草本标准主要起草人:刘满英王孙准。本标准由河北省实验动物管理委员会解释38'