GB4789.9-2014食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验.pdf 13页

'中华人民共和国国家标准GB4789.9—2014食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验2014-12-01发布2015-05-01实施 GB4789.9—2014前言本标准代替GB/T4789.9-2008《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》。本标准与GB/T4789.9-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了范围；——修改了设备和材料；——修改了培养基和试剂；——修改了样品处理；——删除了药物敏感性试验；——删除了第二法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法。I GB4789.9—2014食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验1范围本标准规定了食品中空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）的检验方法。本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：25℃±1℃、36℃±1℃、42℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃；c)恒温振荡培养箱：36℃±1℃、42℃±1℃；d)天平：感量0.1g；e)均质器与配套均质袋；f)振荡器；g)无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h)无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL；i)无菌培养皿：直径90mm；j)pH计或pH比色管或精密pH试纸；k)水浴装置：36℃±1℃、100℃；l)微需氧培养装置：提供微需氧条件（5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气）；m)过滤装置及滤膜（0.22μm、0.45μm）；n)显微镜：10倍～100倍，有相差功能；o)离心机：离心速度≥20000g；p)比浊仪；q)微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1Bolton肉汤（Boltonbroth）：见附录A中A.1。3.2改良CCD琼脂（modifiedCharcoalCefoperazoneDeoxycholateAgar,mCCDA）：见附录A中A.2。3.3哥伦比亚血琼脂（Columbiabloodagar）：见附录A中A.3。3.4布氏肉汤（Brucellabroth）：见附录A中A.4。3.5氧化酶试剂：见附录A中A.5。3.6马尿酸钠水解试剂：见附录A中A.6。3.7Skirrow血琼脂（Skirrowbloodagar）：见附录A中A.7。3.8吲哚乙酸酯纸片：见附录A中A.8。3.90.1%蛋白胨水：见附录A中A.9。3.101mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液：见附录A中A.10。1 GB4789.9—20143.113%过氧化氢（H2O2）溶液：见附录A中A.11。3.12空肠弯曲菌显色培养基。3.13生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。4检验程序空肠弯曲菌检验程序见图1。样品处理Bolton肉汤预增菌，微需氧36℃±1℃4hBolton肉汤增菌，微需氧42℃±1℃24h～48h接种Skirrow与mCCD琼脂平板，或显色培养基42℃±1℃24h～48h挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板42℃±1℃24h～48h镜检动力氧化酶微需氧25℃±1℃有氧42℃±1℃试验试验生长试验生长试验弯曲菌属过氧化氢酶马尿酸钠吲哚乙酸酯水试验水解试验解试验空肠弯曲菌报告图1空肠弯曲菌检验程序2 GB4789.9—20145操作步骤5.1样品处理5.1.1一般样品取25g（mL)样品（水果、蔬菜、水产品为50g）加入盛有225mLBolton肉汤的有滤网的均质袋中（若为无滤网均质袋可使用无菌纱布过滤），用拍击式均质器均质1min～2min，经滤网或无菌纱布过滤，将滤过液进行培养。5.1.2整禽等样品用200mL0.1%的蛋白胨水中充分冲洗样品的内外部，并振荡2min～3min，经无菌纱布过滤至250mL离心管中，16000g离心15min后弃去上清，用10mL0.1%蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3mL于100mLBolton肉汤中进行培养。5.1.3贝类取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min，取25g样品至225mLBolton肉汤中（1:10稀释），充分震荡后再转移25mL于225mLBolton肉汤中（1:100稀释），将1:10和1:100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。5.1.4蛋黄液或蛋浆取25g（mL)样品于125mLBolton肉汤中并混匀（1:6稀释），再转移25mL于100mLBolton肉汤中并混匀（1:30稀释），同时将1:6和1:30稀释的Bolton肉汤进行培养。5.1.5鲜乳、冰淇淋、奶酪等若为液体乳制品取50g；若为固体乳制品取50g加入盛有50mL0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中，用拍击式均质器均质15s～30s，保留过滤液。必要时调整pH值至7.5±0.2，将液体乳制品或滤过液以20000g离心30min后弃去上清，用10mLBolton肉汤悬浮沉淀（尽量避免带入油层），再转移至90mLBolton肉汤进行培养。5.1.6需表面涂拭检测的样品2无菌棉签擦拭检测样品的表面（面积至少100cm以上），将棉签头剪落到100mLBolton肉汤中进行培养。5.1.7水样将4L的水（对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5mL1mol/L硫代硫酸钠溶液）经0.45μm滤膜过滤，把滤膜浸没在100mLBolton肉汤中进行培养。5.2预增菌与增菌在微需氧条件下，36℃±1℃培养4h，如条件允许配以100r/min的速度进行振荡。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.4±0.2，42℃±1℃继续培养24h～48h。5.3分离将24h增菌液、48h增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow血琼脂与mCCDA琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板作为补充。3 GB4789.9—2014观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态，mCCDA琼脂平板上的可疑菌落通常为淡灰色，有金属光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向。Skirrow血琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，边缘整齐、发亮。空肠弯曲菌显色培养基上的可疑菌落按照说明进行判定。5.4鉴定5.4.1弯曲菌属的鉴定5.4.1.1概述挑取5个（如少于5个则全部挑取）或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h，按照5.4.1.1～5.4.1.5进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。表1弯曲菌属的鉴定项目弯曲菌属特性革兰氏阴性，菌体弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形态观察a形、螺旋状或海鸥展翅状b动力观察呈现螺旋状运动氧化酶试验阳性微需氧条件下25℃±1℃生长试验不生长有氧条件下42℃±1℃生长试验不生长a有些菌株的形态不典型。b有些菌株的运动不明显。5.4.1.2形态观察挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。5.4.1.3动力观察挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。5.4.1.4氧化酶试验用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。5.4.1.5微需氧条件下25℃±1℃生长试验挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下25℃±1℃培养44h±4h，观察细菌生长情况。5.4.1.6有氧条件下42℃±1℃生长试验挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，有氧条件下42℃±1℃培养44h±4h，观察细菌生长情况。5.4.2空肠弯曲菌的鉴定5.4.2.1过氧化氢酶试验4 GB4789.9—2014挑取菌落，加到干净玻片上的3%过氧化氢溶液中，如果在30s内出现气泡则判定结果为阳性。5.4.2.2马尿酸钠水解试验挑取菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育2h或36℃±1℃培养箱中温育4h。沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在36℃±1℃的水浴或培养箱中再温育10min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。5.4.2.3吲哚乙酸酯水解试验挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上，再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5min～10min内出现深蓝色；若无颜色变化则表示没有发生水解。空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。表2空肠弯曲菌的鉴定空肠弯曲菌结肠弯曲菌海鸥弯曲菌乌普萨拉弯曲菌特征（C.jejuni）（C.coli）（C.lari）(C.upsaliensis)过氧化氢酶试验＋＋＋－或微弱马尿酸盐水解试验＋－－－吲哚乙酸脂水解试验＋＋－＋注：＋表示阳性；－表示阴性。5.4.2.4替代试验对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡代替5.4.2.1~5.4.2.3进行鉴定。5.5结果报告综合以上试验结果，报告检样单位中检出或未检出空肠弯曲菌。5 GB4789.9—2014附录A培养基与试剂A.1Bolton肉汤（Boltonbroth）A.1.1基础培养基A.1.1.1成分动物组织酶解物10.0g乳白蛋白水解物5.0g酵母浸膏5.0g氯化钠5.0g丙酮酸钠0.5g偏亚硫酸氢钠0.5g碳酸钠0.6gα-酮戊二酸1.0g蒸馏水1000.0mLA.1.1.2制法将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中，121℃灭菌15min，备用。A.1.2无菌裂解脱纤维绵羊或马血对无菌脱纤维绵羊或马血通过反复冻融进行裂解或使用皂角苷进行裂解。A.1.3抗生素溶液A.1.3.1成分头孢哌酮(cefoperazone)0.02g万古霉素（vancomycin）0.02g三甲氧苄胺嘧啶乳酸盐（trimethoprimlactate）0.02g两性霉素B（amphotercinB）0.01g多粘菌素B（polymyxinB）0.01g乙醇/灭菌水（50/50，体积分数）5.0mLA.1.3.2制法将A.1.3.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。A.1.4完全培养基A.1.4.1成分基础培养基1000.0mL无菌裂解脱纤维绵羊或马血50.0mL抗生素溶液5.0mL6 GB4789.9—2014A.1.4.2制法当基础培养基的温度约为45℃左右时，无菌加入绵羊或马血和抗生素溶液，混匀，校正pH至7.4±0.2（25℃），常温下放置不得超过4h，或在4℃左右避光保存不得超过7d。A.2改良CCD琼脂(modifiedCharcoalCefoperazoneDeoxycholateAgar,mCCDA)A.2.1基础培养基A.2.1.1成分肉浸液10.0g动物组织酶解物10.0g氯化钠5.0g木炭4.0g酪蛋白酶解物3.0g去氧胆酸钠1.0g硫酸亚铁0.25g丙酮酸钠0.25g琼脂8.0g～18.0g蒸馏水1000.0mLA.2.1.2制法将A.2.1.1中各成分溶于蒸馏水中，121℃灭菌15min，备用。A.2.2抗生素溶液A.2.2.1成分头孢哌酮（cefoperazone）0.032g两性霉素B（amphotericinB）0.01g利福平（rifampicin）0.01g乙醇/灭菌水（50/50，体积分数）5.0mLA.2.2.2制法将A.2.2.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。A.2.3完全培养基A.2.3.1成分基础培养基1000.0mL抗生素溶液5.0mLA.2.3.2制法当基础培养基的温度约为45℃左右时，加入抗生素溶液，混匀。校正pH至7.4±0.2（25℃）。倾注15mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h，或在4℃左右冷藏不得超过7d。A.3哥伦比亚血琼脂（Columbiabloodagar）7 GB4789.9—2014A.3.1基础培养基A.3.1.1成分动物组织酶解物23.0g淀粉1.0g氯化钠5.0g琼脂8.0g～18.0g蒸馏水1000.0mLA.3.1.2制法将A.3.1.1成分溶于蒸馏水中，121℃灭菌15min，备用。A.3.2无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A.3.3完全培养基A.3.3.1成分基础培养基1000.0mL无菌脱纤维绵羊血50.0mLA.3.3.2制法当基础培养基的温度为45℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。校正pH至7.3±0.2（25℃）。倾注15mL完全培养基于无菌平皿中，静置至培养基凝固。制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h，或在4℃左右冷藏不得超过7d。A.4布氏肉汤(Brucellabroth)A.4.1成分酪蛋白酶解物10.0g动物组织酶解物10.0g葡萄糖1.0g酵母浸膏2.0g氯化钠5.0g亚硫酸氢钠0.1g蒸馏水1000.0mLA.4.2制法将A.4.1中各成分溶于蒸馏水中，校正pH至7.0±0.2（25℃），121℃灭菌15min，备用。A.5氧化酶试剂A.5.1成分四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g8 GB4789.9—2014蒸馏水100.0mLA.5.2制法使用前将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中。A.6马尿酸钠水解试剂A.6.1马尿酸钠溶液A.6.1.1成分马尿酸钠10.0g磷酸盐缓冲液（PBS）组分：氯化钠8.5g磷酸氢二钠8.98g磷酸二氢钠2.71g蒸馏水1000.0mLA.6.1.2制法将马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中，过滤除菌。无菌分装，每管0.4mL，储存于-20℃。A.6.23.5%(水合)茚三酮溶液(质量/体积)A.6.2.1成分（水合）茚三酮（ninhydrin）1.75g丙酮25.0mL丁醇25.0mLA.6.2.2制备将（水合）茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液在避光冷藏时不超过7d。A.7Skirrow血琼脂（Skirrowbloodagar）A.7.1基础培养基A.7.1.1成分蛋白胨15.0g胰蛋白胨2.5g酵母浸膏5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLA.7.1.2制法将A.7.1.1中各成分溶于蒸馏水中，121℃灭菌15min，备用。A.7.2FBP溶液A.7.2.1成分9 GB4789.9—2014丙酮酸钠0.25g焦亚硫酸钠0.25g硫酸亚铁0.25g蒸馏水100.0mLA.7.2.2制法将A.7.2.1中各成分溶于蒸馏水中，经0.22μm滤膜过滤除菌。FBP根据需要量现用现配，在-70℃储存不超过3个月或-20℃储存不超过1个月。A.7.3抗生素溶液A.7.3.1成分头孢哌酮（cefoperazone）0.032g两性霉素B（amphotericinB）0.01g利福平（rifampicin）0.01g乙醇/灭菌水（50/50，体积5.0mL分数）A.7.3.2制法将A.7.3.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。A.7.4无菌脱纤维绵羊血无菌操作条件下，将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。A.7.5完全培养基A.7.5.1成分基础培养基1000.0mLFBP溶液5.0mL抗生素溶液5.0mL无菌脱纤维绵羊血50.0mLA.7.5.2制法当基础培养基的温度约为45℃左右时，加入FBP溶液、抗生素溶液与冻融的无菌脱纤维绵羊血，混匀。校正pH至7.4±0.2（25℃）。倾注15mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h，或在4℃左右冷藏不得超过7d。A.8吲哚乙酸酯纸片A.8.1成分吲哚乙酸脂0.1g丙酮1.0mLA.8.2制法10 GB4789.9—2014将吲哚乙酸脂溶于丙酮中，吸取25μL～50μL溶液于空白纸片上（直径为0.6cm～1.2cm）。室温干燥，用带有硅胶塞的棕色试管/瓶于4℃保存。A.90.1%蛋白胨水A.9.1成分蛋白胨1.0g蒸馏水1000.0mLA.9.2制法将蛋白胨溶解于蒸馏水中，校正pH至7.0±0.2（25℃），121℃高压灭菌15min。A.101mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液A.10.1成分硫代硫酸钠（无水）160.0g碳酸钠（无水）2.0g蒸馏水1000.0mLA.10.2制法称取160g无水硫代硫酸钠，加入2g无水碳酸钠，溶于1000mL水中，缓缓煮沸10min，冷却。A.113％过氧化氢(H2O2)溶液A.11.1成分30％过氧化氢(H2O2)溶液100.0mL蒸馏水900.0mLA.11.2制法吸取100mL30％过氧化氢(H2O2)溶液，溶于900mL蒸馏水中，混匀，分装备用。11'