GB4789.41-2016食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验.pdf 14页

'中华人民共和国国家标准犌犅４７８９．４１—２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验２０１６０８３１发布２０１６０９２０实施中华人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会 犌犅４７８９．４１—２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验１范围本标准规定了食品中肠杆菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数；第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。２术语和定义２．１肠杆菌科犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。２．２肠杆菌科计数犈狀狌犿犲狉犪狋犻狅狀狅犳犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲按本标准规定方法，对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。２．３最可能数犿狅狊狋狆狉狅犫犪犫犾犲狀狌犿犫犲狉；犕犘犖基于泊松分布的一种间接计数方法。３设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：３．１恒温培养箱：３６℃±１℃。３．２冰箱：２℃～５℃。３．３水浴箱：４６℃±１℃。３．４天平：感量０．１ｇ。３．５显微镜：１０倍～１００倍。３．６均质器。３．７振荡器。３．８无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器及吸头。３．９无菌锥形瓶或等效容器：容量１５０ｍＬ、５００ｍＬ。３．１０无菌培养皿：直径９０ｍｍ。３．１１无菌试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１５０ｍｍ。３．１２ｐＨ计或ｐＨ比色管或精密ｐＨ试纸。４培养基和试剂４．１缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）：见Ｂ．１。１ 犌犅４７８９．４１—２０１６４．２缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（ＥＥ肉汤）：见Ｂ．２。４．３结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（ＶＲＢＧＡ）：见Ｂ．３。４．４营养琼脂（ＮＡ）：见Ｂ．４。４．５葡萄糖琼脂：见Ｂ．５。４．６革兰氏染色液：见Ｂ．６。４．７氧化酶试剂：见Ｂ．７。４．８无菌１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ：见Ｂ．８。４．９无菌１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ：见Ｂ．９。第一法肠杆菌科平板计数法５检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图１。图１肠杆菌科平板计数法检验程序２ 犌犅４７８９．４１—２０１６６操作步骤６．１样品的稀释６．１．１固体和半固体样品：称取２５ｇ样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质杯中，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。６．１．２液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成１∶１０的样品匀液。６．１．３用１ｍＬ无菌吸管或微量移液器吸取１∶１０样品匀液１ｍＬ，沿管壁缓缓注入盛有９ｍＬＢＰＷ的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用１支１ｍＬ无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成１∶１００的样品匀液。６．１．４按６．１．３操作程序，依次制成１０倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释１次，换用１支１ｍＬ无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过１５ｍｉｎ。６．２倾注平板和培养６．２．１根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择２个～３个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种２个无菌平皿。同时，分别吸取１ｍＬＢＰＷ加入两个无菌平皿内作为空白对照。６．２．２将１０ｍＬ～１５ｍＬ冷却至４６℃的ＶＲＢＧＡ（可放置于４６℃±１℃恒温水浴箱中保温）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，使样品匀液与培养基充分混匀。６．２．３待琼脂凝固后，倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。６．２．４待ＶＲＢＧＡ平板上层琼脂凝固后翻转平板，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。６．３典型菌落计数和确认６．３．１肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）表示。６．３．２其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以２，代表一个平板菌落数。６．３．３当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。６．３．４从每个平板上至少挑取５个（小于５个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取１个菌落进行确认。６．３．５典型菌落的确认：ａ）分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。ｂ）革兰氏染色镜检：肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大小为（０．３～１．０）μｍ×（１．０～６．０）μｍ。ｃ）氧化酶试验：用铂／铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂３ 犌犅４７８９．４１—２０１６的滤纸上，滤纸的颜色在１０ｓ内变成蓝紫色，判为阳性反应。ｄ）葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。６．４结果的计算６．４．１一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，按式（１）计算，示例见Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。犖＝（狀∑犪…………………………（１）１＋０．１狀２）犱式中：犖———样品中肠杆菌科菌落数；∑犪———确证的肠杆菌科菌落数之和；狀１———第一稀释度（低稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；狀２———第二稀释度（高稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；犱———稀释因子（第一稀释度）。其中，犪按式（２）计算：犪＝犃犫×犆…………………………（２）式中：犪———确证的肠杆菌科菌落数；犫———某一平板中犃个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，犫≤犃；犃———某一平板中用于确认试验的菌落数；犆———某一平板中典型菌落总数。６．４．２低菌落数若最低稀释度（包括液体样品原液）平板的典型菌落数均小于１５ＣＦＵ，具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，或典型菌落数均小于１５ＣＦＵ，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。６．４．３特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于１５０ＣＦＵ，且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，示例见Ａ．５。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。７报告７．１菌落数小于１００时，以整数报告。７．２菌落数大于或等于１００时，对第３位数字进行修约后，取前２位数字，后面用０代替位数；也可用１０的指数形式来表示，采用两位有效数字。７．３数字修约按“四舍五入”原则进行。４ 犌犅４７８９．４１—２０１６７．４若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。７．５若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。７．６称重取样以ＣＦＵ／ｇ为单位报告，体积取样以ＣＦＵ／ｍＬ为单位报告。第二法肠杆菌科犕犘犖计数法８检验程序肠杆菌科ＭＰＮ计数法检验程序见图２。图２肠杆菌科犕犘犖计数法检验程序５ 犌犅４７８９．４１—２０１６９操作步骤９．１样品的稀释按６．１进行。９．２接种和培养９．２．１非选择性前增菌根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择３个适宜连续稀释度的样品匀液，每个稀释度３管，共９管ＢＰＷ于３６℃±１℃培养１８ｈ±２ｈ。９．２．２选择性增菌从ＢＰＷ各培养管中，分别移取１ｍＬ培养物，接种于１０ｍＬ的ＥＥ肉汤中，３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。９．２．３分离用接种环从ＥＥ各肉汤管中分别取培养物１环，划线接种于ＶＲＢＧＡ平板，３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，观察平板上有无典型菌落。９．３典型菌落的确认典型菌落确认见６．３。１０报告肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有１个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的ＥＥ管即为肠杆菌科阳性，依据ＥＥ阳性管数查ＭＰＮ表（见附录Ｃ），报告每克（毫升）样品中肠杆菌科的ＭＰＮ值。称重取样以ＭＰＮ／ｇ为单位报告，体积取样以ＭＰＮ／ｍＬ为单位报告。６ 犌犅４７８９．４１—２０１６附录犃结果计算示例犃．１两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的肠杆菌科菌落，数据见表Ａ．１。表犃．１肠杆菌科平板计数结果示例１稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）典型菌落数／ＣＦＵ１２６１４５２０２４用于确认试验的菌落数／ＣＦＵ５５５５确证的菌落数／ＣＦＵ４５４３犪４／５×１２６＝１０１５／５×１４５＝１４５４／５×２０＝１６３／５×２４＝１４犖＝［２１０＋１＋（０１．１４５×＋２）１］６×＋１１０４－２＝０２．０７２６２＝１２５４５上述数据按７．２数字修约后，表示为１３０００或１．３×１０４。犃．２两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板，数据见表Ａ．２。表犃．２肠杆菌科平板计数结果示例２稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）典型菌落数／ＣＦＵ１２６１１８２０１０用于确认试验的菌落数／ＣＦＵ５８５—确证的菌落数／ＣＦＵ４５４—犪４／５×１２６＝１０１５／８×１１８＝７４４／５×２０＝１６—犖＝［２＋１０（０１．１＋×７４１）＋］１×６１０－２＝０１．０９２１１＝９０９５上述数据按７．２数字修约后，表示为９１００或９．１×１０３。犃．３两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落，则相应的平板不作为计数平板，数据见表Ａ．３。表犃．３肠杆菌科平板计数结果示例３稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）典型菌落数／ＣＦＵ１２６１１８２０２０用于确认试验的菌落数／ＣＦＵ５６５５确证的菌落数／ＣＦＵ４６４０犪４／５×１２６＝１０１６／６×１１８＝１１８４／５×２０＝１６０犖＝［２１０＋１（＋０．１１１×８１＋）１］６×＋１００－２＝０２．０３２５１＝１１１９０上述数据按７．２数字修约后，表示为１１０００或１．１×１０４。７ 犌犅４７８９．４１—２０１６犃．４两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，但无已确证的肠杆菌科菌落，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。犃．５第一稀释度平板上的菌落数超过１５０ＣＦＵ，且有证实的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，数据见表Ａ．５。表犃．５肠杆菌科平板计数结果示例５稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）典型菌落数／ＣＦＵ２２０１９８２３１７用于确认试验的菌落数／ＣＦＵ５５５５确证的菌落数／ＣＦＵ４３００犪４／５×２２０＝１７６３／５×１９８＝１１９００犖＝（１７６＋２１１９）×１０２＝１４７５０８ 犌犅４７８９．４１—２０１６附录犅培养基和试剂犅．１缓冲蛋白胨水（犅犘犠）犅．１．１成分蛋白胨１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钠３．５ｇ磷酸二氢钾１．５ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．１．２制法将Ｂ．１．１成分加热溶解，于２５℃时调节ｐＨ至７．２±０．２，分装于５００ｍＬ广口瓶中，每瓶２２５ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犅．２缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（犈犈肉汤）犅．２．１成分蛋白胨１０．０ｇ葡萄糖５．０ｇ磷酸氢二钠（无水）６．４５ｇ磷酸二氢钾２．０ｇ牛胆盐２０．０ｇ煌绿０．０１３５ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．２．２制法将Ｂ．２．１成分溶于水中，加热煮沸至完全溶解，加热不宜超过３０ｍｉｎ，迅速冷却培养基，于２５℃调节ｐＨ至７．２±０．２，分装于灭菌的１８ｍｍ×１８０ｍｍ试管中，每管１０ｍＬ，不需高压灭菌，５℃±３℃可存放一个月。犅．３结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（犞犚犅犌犃）犅．３．１成分蛋白胨７．０ｇ酵母浸膏３．０ｇ３号胆盐１．５ｇ葡萄糖１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ９ 犌犅４７８９．４１—２０１６中性红０．０３ｇ（或０．６％酒精溶液５ｍＬ）结晶紫０．００２ｇ（或０．１％水溶液２ｍＬ）琼脂粉１０．０ｇ～１２．０ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．３．２制法将Ｂ．３．１成分溶于水中，加热煮沸至完全溶解，２５℃时调节ｐＨ至７．４±０．２，分装于灭菌的锥形烧瓶中，不需高压灭菌，用前制备。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板５℃±３℃可存放两周。犅．４营养琼脂（犖犃）犅．４．１成分牛肉浸膏３．０ｇ蛋白胨５．０ｇ琼脂粉１０．０ｇ～１２．０ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．４．２制法将Ｂ．４．１成分溶于水中，加热煮沸，２５℃时调节ｐＨ至７．３±０．２，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板于５℃±３℃可存放两周。犅．５葡萄糖琼脂犅．５．１成分胰蛋白胨１０．０ｇ酵母浸膏１．５ｇ葡萄糖１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ溴甲酚紫０．０１５ｇ（或０．４％溴甲酚紫酒精溶液３．７５ｍＬ）琼脂粉１０．０ｇ～１２．０ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．５．２制法将Ｂ．５．１成分溶于水中，加热煮沸，２５℃时调节ｐＨ至７．０±０．２，分装于１５ｍｍ×１５０ｍｍ试管，每管约５ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ后，试管垂直放置。于５℃±３℃可存放１周。为去除培养基中的氧气，使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中１５ｍｉｎ，然后迅速冷却，备用。犅．６革兰氏染色液犅．６．１结晶紫染色液犅．６．１．１成分结晶紫１．０ｇ１０ 犌犅４７８９．４１—２０１６９５％乙醇２０．０ｍＬ１％草酸铵水溶液８０．０ｍＬ犅．６．１．２制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。犅．６．２革兰氏碘液犅．６．２．１成分碘１．０ｇ碘化钾２．０ｇ蒸馏水３００．０ｍＬ犅．６．２．２制法将碘和碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至３００ｍＬ。犅．６．３沙黄复染液犅．６．３．１成分沙黄０．２５ｇ９５％乙醇１０．０ｍＬ蒸馏水９０．０ｍＬ犅．６．３．２制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。犅．６．４染色方法犅．６．４．１将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染１ｍｉｎ，水洗。犅．６．４．２滴加革兰氏碘液，作用１ｍｉｎ，水洗。犅．６．４．３滴加９５％乙醇脱色１５ｓ～３０ｓ，直至染色液被洗掉，但不要过分脱色、水洗。犅．６．４．４加沙黄复染液，复染１ｍｉｎ，水洗、干燥、镜检。犅．６．４．５革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。犅．７氧化酶试剂犅．７．１成分犖，犖，犖′，犖′四甲基对苯二胺盐酸盐１．０ｇ蒸馏水１００．０ｍＬ犅．７．２制法将Ｂ．７．１成分溶解于冷水中，少量新鲜配制。犅．７．３试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在１０ｓ内呈现粉红１１ 犌犅４７８９．４１—２０１６或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。犅．８无菌１犿狅犾／犔犖犪犗犎犅．８．１成分ＮａＯＨ４０．０ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．８．２制法称取４０ｇ氢氧化钠溶于１０００ｍＬ蒸馏水中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犅．９无菌１犿狅犾／犔犎犆犾犅．９．１成分ＨＣｌ９０．０ｍＬ蒸馏水１０００．０ｍＬ犅．９．２制法移取浓盐酸９０ｍＬ，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。１２ 犌犅４７８９．４１—２０１６附录犆肠杆菌科最可能数（犕犘犖）检索表每克（毫升）检样中肠杆菌科最可能数（ＭＰＮ）的检索见表Ｃ．１。表犆．１肠杆菌科最可能数（犕犘犖）的检索表阳性管数９５％置信区间阳性管数９５％置信区间ＭＰＮＭＰＮ０．１００．０１０．００１下限上限０．１００．０１０．００１下限上限０００＜３．０—９．５２２０２１４．５４２００１３．００．１５９．６２２１２８８．７９４０１０３．００．１５１１２２２３５８．７９４０１１６．１１．２１８２３０２９８．７９４０２０６．２１．２１８２３１３６８．７９４０３０９．４３．６３８３００２３４．６９４１００３．６０．１７１８３０１３８８．７１１０１０１７．２１．３１８３０２６４１７１８０１０２１１３．６３８３１０４３９１８０１１０７．４１．３２０３１１７５１７２００１１１１１３．６３８３１２１２０３７４２０１２０１１３．６４２３１３１６０４０４２０１２１１５４．５４２３２０９３１８４２０１３０１６４．５４２３２１１５０３７４２０２００９．２１．４３８３２２２１０４０４３０２０１１４３．６４２３２３２９０９０１０００２０２２０４．５４２３３０２４０４２１０００２１０１５３．７４２３３１４６０９０２０００２１１２０４．５４２３３２１１００１８０４１００２１２２７８．７９４３３３＞１１００４２０—注１：本表采用３个稀释度［０．１ｇ（ｍＬ）、０．０１ｇ（ｍＬ）和０．００１ｇ（ｍＬ）］，每个稀释度接种３管。注２：表内所列检样量如改用１ｇ（ｍＬ）、０．１ｇ（ｍＬ）和０．０１ｇ（ｍＬ）时，表内数字应相应降低１０倍；如改用０．０１ｇ（ｍＬ）、０．００１ｇ（ｍＬ）、０．０００１ｇ（ｍＬ）时，则表内数字应相应增高１０倍，其余类推。１３'