GB4789.39-2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数.pdf 9页

'中华人民共和国国家标准GB4789.39—2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数2013-11-29发布2014-06-01实施 GB4789.39—2013前言本标准代替GB/T4789.39-2008《食品卫生微生物学检验粪大肠菌群计数》。本标准与GB/T4789.39-2008相比，主要修改如下：——修改了标准的中文名称；——修改了操作步骤；——增加了附录B。I GB4789.39—2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中粪大肠菌群计数的方法。本标准适用于各类食品中粪大肠菌群的计数。2术语和定义2.1粪大肠菌群一群在44.5℃培养24h～48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群来自人和温血动物粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。3技术要求设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃;b)冰箱：2℃～5℃;c)恒温水浴箱：44.5℃±0.2℃;d)天平：感量0.1g;e)均质器;f)振荡器;g)无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头;h)无菌锥形瓶：容量500mL;i)无菌培养皿：直径90mm;j)pH计或pH比色管或精密pH试纸。4培养基及试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2EC肉汤（E.coliBroth）：见附录A中A.2。4.3无菌生理盐水：见附录A中A.3。4.41mol/LNaOH：见附录A中A.4。4.51mol/LHCl：见附录A中A.5。5检验程序粪大肠菌群检验程序见图1。1 GB4789.39—2013检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤36℃±1℃48h±2h不产气产气EC肉汤44.5℃±0.2℃24h±2h不产气产气粪大肠菌群阴性管粪大肠菌群阳性管查MPN表报告结果图1粪大肠菌群MPN计数法检验程序6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液，或置225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验2 GB4789.39—2013每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。如采用多个稀释度，最终确定最适的三个连续稀释度方法参见附录B。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于预先升温至44.5℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放入带盖的44.5℃±0.2℃恒温水浴箱内，培养24h±2h，水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面，记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。定期以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.4粪大肠菌群MPN计数的报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表（见附录C），报告每g(mL)粪大肠菌群的MPN值。3 GB4789.39—2013附录A培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mLA.1.2制法将A.1.1成分溶解于蒸馏水中，校正pH至6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15min。A.2EC肉汤（E.coliBroth）A.2.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g3号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mLA.2.2制法将A.2.1成分溶解于蒸馏水中，校正pH至6.9±0.1。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管8mL，121℃高压灭菌15min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000.0mLA.3.2制法4 GB4789.39—2013称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.41mol/LNaOHA.4.1成分NaOH40.0g蒸馏水1000.0mLA.4.2制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。A.51mol/LHClA.5.1成分盐酸90.0mL蒸馏水1000.0mLA.5.2制法移取盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。5 GB4789.39—2013附录B确定最适的三个连续稀释度方法在10-1～10-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度（见表B.1示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同）；在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见表B.1示例c）；如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例d）；如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表B.1示例e）;b）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度（见表B.1示例f）；如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例g）。MPN计算阳性结果的选择示例见表B.1。表B.1关于MPN计算阳性结果的选择示例接种样品量示例编选择的三个连续稀释度阳性mLMPN/g(mL)号管数0.1g0.01g0.001g0.0001g0.00001ga331003-1-0430b231003-1-0430c322102-2-1280d322012-2-1280e333323-3-2110000f001000-0-13g221102-2-235注：下划线表示应选择的连续稀释度。6 GB4789.39—2013附录C粪大肠菌群最可能数（MPN）表每g(mL)检样中粪大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表C.1。表C.1粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数95%置信区间阳性管数95%置信区间MPNMPN0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限000<3.0—9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.6383104391801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.64231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901,000202204.542330240421,000210153.742331460902,000211204.54233211001804,100212278.794333>1100420—注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]、每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。7'