GB4789.36-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157H7NM检验.pdf 13页

'中华人民共和国国家标准GB4789.36—2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布国家食品药品监督管理总局 GB4789.36—2016前言本标准代替GB/T4789.36—2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》。本标准与GB/T4789.36—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验”;———修改了标准的范围;———修改了设备和材料;———修改了培养基和生化反应的文字描述;———删除“第二法免疫磁珠捕获法的原理”;———删除“第三法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”;———删除“第四法全自动病原菌检测系统筛选法”。Ⅰ GB4789.36—2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验1范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的检验方法。本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36℃±1℃。2.2冰箱:2℃~5℃。2.3恒温水浴箱:46℃±1℃。2.4天平:感量0.1g、0.01g。2.5均质器。2.6显微镜:10倍~100倍。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸头。2.8无菌均质杯或无菌均质袋:容量500mL。2.9无菌培养皿:直径90mm。2.10pH计或精密pH试纸。2.11长波紫外光灯:365nm,功率≤6W。2.12微量离心管:1.5mL或2.0mL。2.13磁板、磁板架、样品混合器。2.14微生物鉴定系统。3培养基和试剂3.1改良EC肉汤(mEC+n):见A.1。3.2改良山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC):见A.2。3.3三糖铁琼脂(TSI):见A.3。3.4营养琼脂:见A.4。3.5半固体琼脂:见A.5。3.6月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG(MUG-LST):见A.6。3.7氧化酶试剂:见A.7。3.8革兰氏染色液:见A.8。3.9PBS-Tween20洗液:见A.9。3.10亚碲酸钾(AR级)。1 GB4789.36—20163.11头孢克肟(Cefixime)。3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基。3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。3.14鉴定试剂盒。3.15抗-E.coliO157免疫磁珠。第一法常规培养法4检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1。图1大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取检样25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min~2min;或放入盛有225mLmEC+n肉汤的均质杯中,8000r/min~10000r/min均质1min~2min。36℃±1℃培养18h~24h。2 GB4789.36—20165.2分离取增菌后的mEC+n肉汤,划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上,36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落形态。在CT-SMAC平板上,典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定。5.3初步生化试验在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种TSI琼脂,同时接种MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株(ATCC25922或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效标准菌株)做阴性对照,于36℃±1℃培养18h~24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36℃±1℃培养18h~24h,并进行下列鉴定。5.4鉴定5.4.1血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代3次,动力试验均阴性,确定为无动力株。如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行。5.4.2生化试验5.4.2.1自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征见表1。表1大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征生化试验特征反应三糖铁琼脂底层及斜面呈黄色,H2S阴性山梨醇阴性或迟缓发酵靛基质阳性甲基红-伏普试验(MR-VP)MR阳性,VP阴性氧化酶阴性西蒙氏柠檬酸盐阴性赖氨酸脱羧酶阳性(紫色)鸟氨酸脱羧酶阳性(紫色)纤维二糖发酵阴性棉子糖发酵阳性MUG试验阴性(无荧光)动力试验有动力或无动力3 GB4789.36—20165.4.2.2如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。5.4.3毒力基因测定(可选项目)样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7或O157:NM时,如需要进一步检测Vero细胞毒素基因的存在,可通过接种Vero细胞或HeLa细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反应(PCR)方法进行志贺毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的检测。如使用试剂盒检测上述基因,应按照产品的说明书进行。6结果报告综合生化和血清学试验结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157:H7或大肠埃希氏菌O157:NM。第二法免疫磁珠捕获法7检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2。图2大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序4 GB4789.36—20168操作步骤8.1增菌同5.1。8.2免疫磁珠捕获与分离8.2.1应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。8.2.2将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1只微量离心管,然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠悬液。8.2.3取mEC+n肉汤增菌培养物1mL,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s。每个样品更换1只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染。8.2.4结合:在18℃~30℃环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微转动10min,使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。8.2.5捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来。此时,在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。8.2.6吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则应将其放回到微量离心管中,并重复8.2.5步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL上清液于微量离心管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的。8.2.7洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入1mLPBS-Tween20洗液,放在样品混合器上转动或用手轻微转动3min,洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤8.2.5~8.2.7。8.2.8重复上述步骤8.2.5~8.2.6。8.2.9免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。8.2.10涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36℃±1℃培养18h~24h。注:若CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板表面水分过多时,应在36℃±1℃下干燥10min~20min,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。8.3菌落识别大肠埃希氏菌O157:H7/NM在CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征同5.2。8.4初步生化试验同5.3。8.5鉴定同5.4。5 GB4789.36—20169结果报告同第6章。6 GB4789.36—2016附录A培养基和试剂A.1改良EC肉汤(mEC+n)A.1.1成分胰蛋白胨20.0g3号胆盐1.12g乳糖5.0gK2HPO4·7H2O4.0gKH2PO41.5gNaCl5.0g新生霉素钠盐溶液(20mg/mL)1.0mL蒸馏水1000mLA.1.2制法除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH至6.9±0.1,分装。于121℃高压灭菌15min,备用。制备浓度为20mg/mL的新生霉素储备溶液,过滤法除菌。待培养基温度冷至50℃以下时,按1000mL培养基内加1mL新生霉素储备液,使最终浓度为20mg/L。A.2改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂A.2.1山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂A.2.1.1成分蛋白胨20.0g山梨醇10.0g3号胆盐1.5g氯化钠5.0g中性红0.03g结晶紫0.001g琼脂15.0g蒸馏水1000mLA.2.1.2制法除琼脂、结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH至7.2±0.2,加入琼脂、结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装。于121℃高压灭菌15min。A.2.2亚碲酸钾溶液A.2.2.1成分亚碲酸钾0.5g7 GB4789.36—2016蒸馏水200mLA.2.2.2制法将亚碲酸钾溶于水,过滤法除菌。A.2.3头孢克肟(Cefixime)溶液A.2.3.1成分头孢克肟1.0mg95%乙醇200mLA.2.3.2制法将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌。分装试管,储存于-20℃,有效期1年。解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在2℃~8℃下有效期14d。A.2.4CT-SMAC制法取1000mL灭菌融化并冷却至46℃±1℃的山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂,加入1mL亚碲酸钾溶液和10mL头孢克肟溶液,使亚碲酸钾浓度达到2.5mg/L,头孢克肟浓度达到0.05mg/L,混匀后倾注平板。A.3三糖铁琼脂(TSI)A.3.1成分蛋白胨20.0g牛肉浸膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O]0.2g氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0mL琼脂12.0g蒸馏水1000mLA.3.2制法除酚红和琼脂外,将其他成分加于400mL蒸馏水中,煮沸溶解,在20℃~25℃下校正pH至7.4±0.2。另将琼脂加于600mL蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,加入5%酚红水溶液5mL,混匀,分装小号试管,每管约2mL~4mL。于121°C10min或115°C15min,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在2℃~8℃条件下可储存一个月。8 GB4789.36—2016A.4营养琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLA.4.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装。于121℃高压灭菌15min。A.5半固体琼脂A.5.1成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.3g~0.4g蒸馏水100mLA.5.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装小试管,于121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。A.6月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-MUG(LST-MUG)A.6.1成分胰蛋白胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4)2.75g十二烷基硫酸钠0.1g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)0.1g蒸馏水1000mLA.6.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于20℃~25℃下校正pH至6.8±0.2,分装到带有倒管的试管中,每管10mL,于121℃高压灭菌15min。9 GB4789.36—2016A.7氧化酶试剂A.7.1成分N,N"-二甲基对苯二胺盐酸盐或N,N,N",N"-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100mLA.7.2制法少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d内使用。A.7.3试验方法用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mLA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300mLA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0mL蒸馏水90.0mL10 GB4789.36—2016A.8.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。A.8.4染色法A.8.4.1涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。A.8.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。A.8.4.3滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。A.8.4.4滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。A.9PBS-Tween20洗液按照商品用E.coliO157免疫磁珠的洗液配方进行制备,或按照下列配方制备。A.9.1成分氯化钠8.0g氯化钾0.2g磷酸氢二钠(Na2HPO41.15g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2gTween200.5g蒸馏水1000mLA.9.2制法将上述成分溶解于水中,于20℃~25℃下校正pH至7.3±0.2,分装锥形瓶。121℃高压灭菌15min,备用。11'