GB4789.38-2012食品微生物检验大肠埃希氏菌计数.pdf 14页

'中华人民共和国国家标准GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB4789.38-2012前言本标准代替GB/T4789.38-2008《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。本标准与GB/T4789.38-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了培养基和试剂；——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；TM——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm测试片计数法”；——修改了附录A。I GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数1范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）计数的方法。本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产品。2术语和定义2.1大肠埃希氏菌Escherichiacoli大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。2.2最可能数基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：44.5℃±0.2℃；d）天平：感量为0.1g；c）均质器；d）振荡器；e）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500mL；g）无菌培养皿：直径90mm；h）pH计或pH比色管或精密pH试纸；i）菌落计数器；j）紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6W。4培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2EC肉汤（E.colibroth）：见附录A中A.2。4.3蛋白胨水：见附录A中A.3。1 GB4789.38-20124.4缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]：见附录A中A.4。4.5西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.5。4.6磷酸盐缓冲液：见附录A中A.6。4.7伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录A中A.7。4.8营养琼脂斜面：见附录A中A.8。4.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录A中A.9。4.10结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录A中A.10。4.11革兰氏染色液：见附录A中A.11。4.12Kovacs靛基质试剂：见附录A中A.12。4.13无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.13。4.14无菌1mol/LHCl：见附录A中A.14。2 GB4789.38-20125大肠埃希氏菌MPN计数（第一法）5.1检验程序大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图1。检样25g（mL）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36℃±1℃48h±2h不产气产气EC肉汤44.5℃±0.2℃48h±2h不产气产气EMB平板划线36℃±1℃18h～24h可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板36℃±1℃18h～24hIMViC生化试验，革兰氏染色阴性管阳性管查MPN表报告图1大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序3 GB4789.38-20125.2操作步骤5.2.1样品的稀释5.2.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。5.2.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。5.2.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。5.2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.2.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。5.2.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48h±2h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。5.2.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。5.2.4伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。5.2.5营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。5.2.6鉴定取培养物进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1。4 GB4789.38-2012表1大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别靛基质（I）甲基红（MR）VP试验（VP）柠檬酸盐（C）鉴定（型别）＋＋－－典型大肠埃希氏菌－＋－－非典型大肠埃希氏菌＋＋－＋典型中间型－＋－＋非典型中间型－－＋＋典型产气肠杆菌＋－＋＋非典型产气肠杆菌注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。注2：生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作。5.3大肠埃希氏菌MPN计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋――或－＋－－。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。6大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）6.1检验程序大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2。检样25g（ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA-MUG平板36℃±1℃18h～24h紫外灯照射，计数发荧光菌落报告结果图2大肠埃希氏菌平板计数法检验程序6.2操作步骤6.2.1样品的稀释按5.2.1进行。6.2.2平板计数5 GB4789.38-20126.2.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。6.2.2.2将10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。6.3平板菌落数的选择选择菌落数在10CFU～100CFU之间的平板，暗室中360nm～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照。6.4大肠埃希氏菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。6 GB4789.38-2012附录A培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mLpH6.8±0.2A.1.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。制备双料LST肉汤时，除蒸馏水外其他成分加倍。A.2EC肉汤（E.colibroth）A.2.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g3号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mLpH6.9±0.1A.2.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管8mL。121℃高压灭菌15min。A.3蛋白胨水A.3.1成分胰胨或胰酪胨10.0g蒸馏水1000.0mLpH6.9±0.2A.3.2制法加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15min。A.4缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]A.4.1成分多胨7.0g7 GB4789.38-2012葡萄糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g蒸馏水1000.0mLpH7.0A.4.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min，备用。A.4.3甲基红（MR）试验A.4.3.1甲基红试剂A.4.3.1.1成分甲基红10mg95%乙醇30.0mL蒸馏水20.0mLA.4.3.1.2制法10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。A.4.3.1.3试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水，36℃±1℃培养2d～5d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A.4.4V-P试验A.4.4.16%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。A.4.4.240%氢氧化钾溶液成分及制法：取氢氧化钾40g，加蒸馏水溶解，定容至100mL。A.4.4.3试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水，36℃±1℃培养2d～4d。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃±1℃继续培养4h再进行观察。A.5西蒙氏柠檬酸盐培养基A.5.1成分柠檬酸钠2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢铵1.0g硫酸镁0.2g溴百里香酚蓝0.08g琼脂8.0g～18.0g蒸馏水1000.0mLpH6.8±0.2A.5.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装10mL，121℃高压15min，制成斜面。A.5.3实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面，36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。A.6磷酸盐缓冲液A.6.1成分8 GB4789.38-2012磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500.0mLpH7.2A.6.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.7伊红美蓝（EMB）琼脂A.7.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0g琼脂15.0g伊红γ（水溶液）0.4g或2%水溶液20.0mL美蓝0.065g或0.5%水溶液13.0mL蒸馏水1000.0mLpH7.1±0.2A.7.2制法在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL，调节pH，121℃高压灭菌15min。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖溶液，2mL的2%的伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45℃～50℃倾注平皿。A.8营养琼脂斜面A.8.1成分牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLpH7.3±0.1A.8.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装合适的试管，121℃高压灭菌15min。灭菌后摆成斜面备用。A.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.9.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15g～18g蒸馏水1000.0mL9 GB4789.38-2012pH7.4±0.1A.9.2制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.10结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）A.10.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15g～18g蒸馏水1000.0mL4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）0.1gpH7.4±0.1A.10.2制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷至45℃～50℃使用。A.11革兰氏染色液A.11.1结晶紫染色液A.11.1.1成分结晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mLA.11.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.11.2革兰氏碘液A.11.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.11.2.2制法将碘与碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.11.3沙黄复染液A.11.3.1成分沙黄0.25g95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.11.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.11.4染色法10 GB4789.38-2012A.11.4.1涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。A.11.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.11.4.3滴加95%乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.11.4.4滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.12Kovacs靛基质试剂A.12.1成分对二甲氨基苯甲醛5.0g戊醇75.0mL盐酸（浓）25.0mLA.12.2制法将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A.12.3试验方法将培养物接种蛋白胨水，36℃±1℃培养24h±2h后，加Kovacs靛基质试剂0.2mL～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。A.13无菌1mol/LNaOH：A.13.1成分NaOH40.0g蒸馏水1000.0mLA.13.2制法：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.14无菌1mol/LHCl：A.14.1成分HCl90.0mL蒸馏水1000.0mLA.14.2制法移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。11 GB4789.38-2012附录B大肠埃希氏菌最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中大肠埃希氏菌最可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1大肠埃希氏菌最可能数（MPN）检索表阳性管数95%置信区间阳性管数95%置信区间MPNMPN0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限000＜3.0-9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.6383104391801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.4231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901000202204.542330240421000210153.742331460902000211204.54233211001804100212278.794333＞1100420—注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。12'