GB5009.204-2014食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定.pdf 11页

'中华人民共和国国家标准GB5009.204—2014食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定2014-12-01发布2015-05-01实施 GB5009.204—2014前言本标准代替GB/T5009.204－2005《食品中丙烯酰胺含量的测定方法气相色谱一质谱（GC-MS）法》。本标准与GB/T5009.204－2005相比，主要变化如下：——增加第一法稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法；——气相色谱-质谱法将外标法改为稳定性同位素稀释法。I GB5009.204—2014食品安全国家标准食品中丙烯酰胺的测定1范围本标准规定了食品中丙烯酰胺的测定方法。本标准适用于热加工（如煎、炙烤、焙烤等）食品中丙烯酰胺的测定。第一法稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法2原理13本标准应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入C3标记的丙烯酰胺内标溶液，以水为提取溶剂，经过固相萃取柱或基质固相分散萃取净化后，以液相色谱-质谱/质谱的多反应离子监测(MRM)或选择反应监测(SRM)进行检测，内标法定量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲酸(HCOOH)：色谱纯。3.1.2甲醇(CH3OH)：色谱纯。3.1.3正己烷(n-C6H14)：分析纯，重蒸后使用。3.1.4乙酸乙酯(CH3COOC2H5)：分析纯，重蒸后使用。3.1.5无水硫酸钠(Na2SO4)：400℃，烘烤4h。3.1.6硫酸铵[(NH4)2SO4]。TM3.1.7硅藻土：Extrelut20或相当产品。3.2标准品3.2.1丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)标准品（纯度>99%）。131313133.2.2C3-丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）标准品（纯度>98%）。3.3标准溶液的配制3.3.1丙烯酰胺标准溶液的配制3.3.1.1丙烯酰胺标准储备溶液（1000mg/L）：准确称取丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并定容，使丙烯酰胺浓度为1000mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。3.3.1.2丙烯酰胺中间溶液（100mg/L）：移取丙烯酰胺标准储备溶液1mL，加甲醇稀释至10mL，使丙烯酰胺浓度为100mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。3.3.1.3丙烯酰胺工作溶液Ⅰ（10mg/L）：移取丙烯酰胺中间溶液1mL，用0.1%甲酸溶液稀释至1 GB5009.204—201410mL，使丙烯酰胺浓度为10mg/L。临用时配制。3.3.1.4丙烯酰胺工作溶液Ⅱ（1mg/L）：移取丙烯酰胺工作溶液Ⅰ1mL，用0.1%甲酸溶液稀释至10mL,，使丙烯酰胺浓度为1mg/L。临用时配制。133.3.2C3-丙烯酰胺内标溶液13133.3.2.1C3-丙烯酰胺内标储备溶液（1000mg/L）：准确称取C3-丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并13定容，使C3-丙烯酰胺浓度为1000mg/L，置﹣20℃冰箱保存。133.3.2.2内标工作溶液（10mg/L）：移取内标储备溶液1mL，用甲醇稀释至100mL，使C3-丙烯酰胺浓度为10mg/L，置﹣20℃冰箱保存。3.3.3标准曲线工作溶液取6个10mL容量瓶，分别移取0.1mL、0.5mL、1mL丙烯酰胺工作溶液II（1mg/L）和0.5mL、1mL和3mL丙烯酰胺工作溶液I（10mg/L）与内标工作溶液（10mg/L）0.1mL，用0.1%甲酸溶液稀释至刻度。标准系列溶液中丙烯酰胺的浓度分别为10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、3000μg/L，内标浓度为100μg/L。临用时配制。4仪器和设备4.1液相色谱-质谱/质谱联用仪（LC-MS/MS）。4.2HLB固相萃取柱：6mL、200mg，或相当产品。4.3BondElut-Accucat固相萃取柱：3mL、200mg，或相当产品。4.4组织粉碎机。4.5旋转蒸发仪。4.6氮气浓缩器。4.7振荡器。4.8玻璃层析柱：柱长30cm，柱内径1.8cm。4.9涡旋混合器。4.10超纯水装置。4.11分析天平：感量为0.1mg。4.12离心机：转速≤10000r/m。5分析步骤5.1试样制备5.1.1样品提取取50g试样，经粉碎机粉碎，﹣20℃冷冻保存。准确称取试样1g～2g（精确到0.001g），加入101313mg/LC3-丙烯酰胺内标工作溶液10μL（或20μL），相当于100ng（或200ng）的C3-丙烯酰胺内标，再加入超纯水10mL，振摇30min后，于4000r/m离心10min，取上清液待净化。5.1.2样品净化注：任选下列一种方法进行净化。5.1.2.1基质固相分散萃取方法（选择1）：在试样提取的上清液中加入硫酸铵15g，振荡10min，使其充分溶解，于4000r/m离心10min，取上清液10mL，备用。如上清液不足10mL，则用饱和硫酸铵补足。取洁净玻璃层析柱，在底部填少许玻璃棉并压紧，依次填装10g无水硫酸钠、2g硅藻土。称取TM5g硅藻土Extrelut20与上述试样上清液搅拌均匀后，装入层析柱中。用70mL正己烷淋洗，控制流2 GB5009.204—2014速为2mL/min，弃去正己烷淋洗液。用70mL乙酸乙酯洗脱丙烯酰胺，控制流速为2mL/min，收集乙酸乙酯洗脱溶液，并在45℃水浴中减压旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯洗涤蒸发瓶残渣三次（每次1mL），并将其转移至已加入1mL0.1%甲酸溶液的试管中，涡旋振荡。在氮气流下吹去上层有机相后，加入1mL正己烷，涡旋振荡，于3500r/m离心5min，取下层水相经0.22μm水相滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。5.1.2.2固相萃取柱净化（选择2）：在试样提取的上清液中加入5mL正己烷，振荡萃取10min，于10000r/m离心5min，除去有机相，再用5mL正己烷重复萃取一次，迅速取水相6mL经0.45μm水相滤膜过滤，待进行HLB固相萃取柱净化处理。HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化。取上述滤液5mL上HLB固相萃取柱，收集流出液，并用4mL80%的甲醇水溶液洗脱，收集全部洗脱液，并与流出液合并待进行BondElut-Accucat固相萃取柱净化；BondElut-Accucat固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化后，将HLB固相萃取柱净化的全部洗脱液上样，在重力作用下流出，收集全部流出液，在氮气流下将流出液浓缩至近干，用0.1%甲酸溶液定容至1.0mL，待LC-MS/MS测定。5.2仪器参考条件5.2.1色谱条件色谱柱为AtlantisC18柱（5μm、2.1mmI.D.×150mm）或等效柱。预柱：C18保护柱（5μm、2.1mmI.D.×30mm）或等效柱。流动相：甲醇/0.1%甲酸（10：90，体积分数）。流速：0.2mL/min。进样体积：25μL。柱温：26℃。5.2.2质谱参数5.2.2.1三重四极串联质谱仪检测方式：多反应离子监测（MRM）。电离方式：阳离子电喷雾电离源（ESI+）。毛细管电压：3500V。锥孔电压：40V。射频透镜1电压：30.8V。离子源温度：80℃。脱溶剂气温度：300℃。离子碰撞能量：6eV。丙烯酰胺：母离子m/z72、子离子m/z55、子离子m/z44。13C3丙烯酰胺：母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z45。13定量离子：丙烯酰胺为m/z55，C3丙烯酰胺为m/z58。5.2.2.2离子阱串联质谱仪检测方式：选择反应离子监测（SRM）。电离方式：阳离子电喷雾电离源（ESI+）。喷雾电压：5000V。加热毛细管温度：300℃。鞘气：N2，40Arb。辅助气：N2，20Arb。碰撞诱导解离（CID）：10V。碰撞能量：40V。3 GB5009.204—2014丙烯酰胺：母离子m/z72、子离子m/z55、子离子m/z44。13C3丙烯酰胺：母离子m/z75、子离子m/z58、子离子m/z45。13定量离子：丙烯酰胺为m/z55，C3丙烯酰胺为m/z58。5.3标准曲线的绘制将标准系列工作液分别注入液相色谱-质谱/质谱系统，测定相应的丙烯酰胺及其内标的峰面积，以13各标准系列工作液的丙烯酰胺进样浓度（μg/L）为横坐标，以丙烯酰胺（m/z55）和C3丙烯酰胺内标(m/z58)的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定13将试样溶液注入液相色谱-质谱/质谱系统中，测得丙烯酰胺（m/z55）和C3丙烯酰胺内标(m/z58)的峰面积比，根据标准曲线得到待测液中丙烯酰胺进样浓度（μg/L），平行测定次数不少于两次。5.5质谱分析分别将试样和标准系列工作液注入液相色谱-质谱/质谱仪中，记录总离子流图和质谱图（见附录A中图A.1～图A.2）及丙烯酰胺和内标的峰面积，以保留时间及碎片离子的丰度定性，要求所检测的丙烯酰胺色谱峰信噪比(S/N)大于3，被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致，同时被测试样中目标化合物的相应监测离子丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表1。表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度允许的相对偏差（基线峰的%）(RSD)＞50%±20%＞20%～50%±25%＞10%～20%±30%≤10%±50%6分析结果的表述试样中丙烯酰胺含量按公式（1）内标法计算：AfX………………………………………………（1）M式中：X——试样中丙烯酰胺的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；13A——试样中丙烯酰胺（m/z55）色谱峰与C3丙烯酰胺内标(m/z58)色谱峰的峰面积比值对应的丙烯酰胺质量，单位为纳克（ng）；f——试样中内标加入量的换算因子（内标为10μL时f=1或内标为20μL时f=2）；M——加入内标时的取样量，单位为克（g）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字（或小数点后1位）。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8其他4 GB5009.204—2014方法定量限为10μg/kg。第二法稳定性同位素稀释的气相色谱-质谱法9原理13本标准应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入C3标记的丙烯酰胺内标溶液，以水为提取溶剂，试样提取液采用基质固相分散萃取净化、溴试剂衍生后，采用气相色谱-串联质谱仪的多反应离子监测(MRM)或气相色谱-质谱仪的选择离子监测(SIM)进行检测，内标法定量。10试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为超纯水。10.1试剂10.1.1正己烷(n-C6H14)：分析纯，重蒸后使用。10.1.2乙酸乙酯(CH3COOC2H5)：分析纯，重蒸后使用。10.1.3无水硫酸钠(Na2SO4)：400℃，烘烤4h。10.1.4硫酸铵[(NH4)2SO4]。10.1.5硫代硫酸钠（Na2S2O3﹒5H2O）。10.1.6溴(Br2)。10.1.7氢溴酸(HBr)：含量>48.0%。10.1.8溴化钾(KBr)。10.1.9超纯水，电导率（25℃）≤0.01mS/m。10.1.10溴试剂。TM10.1.11硅藻土：Extrelut20或相当产品。10.2试剂配制10.2.1饱和溴水：量取100mL超纯水，置于200mL的棕色试剂瓶中，加入8mL溴，4℃避光放置8h，上层为饱和溴水溶液。10.2.2溴试剂：称取溴化钾20.0g，加超纯水50mL，使完全溶解，再加入1.0mL氢溴酸和16.0mL饱和溴水，摇匀，用超纯水稀释至100mL，4℃避光保存。10.2.3硫代硫酸钠溶液（0.1mol/L）：称取硫代硫酸钠2.48g，加超纯水50mL，使完全溶解，用超纯水稀释至100mL，4℃避光保存。10.2.4饱和硫酸铵溶液：称取80g硫酸铵晶体，加入超纯水100mL，超声溶解，室温放置。10.3标准品10.3.1丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)标准品：纯度>99%。1313131310.3.2C３-丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）标准品：纯度>98%。10.4标准溶液的配制10.4.1丙烯酰胺及其内标溶液：同3.3.1和3.3.2。10.4.2标准曲线工作溶液：取5个10mL容量瓶，分别移取0.1mL、0.5mL、2mL丙烯酰胺工作溶液Ⅱ（1mg/L）和0.5mL及1mL丙烯酰胺工作溶液Ⅰ（1mg/L）与0.5mL内标工作溶液（1mg/L），用超纯水稀释至刻度。标准系列溶液中丙烯酰胺浓度分别为10μg/L、50μg/L、200μg/L、500μg/L、5 GB5009.204—20141000μg/L，内标浓度为50μg/L。临用时配制。11仪器和设备11.1气相色谱-四级杆质谱联用仪(GC-MS)。11.2色谱柱：DB-5ms柱（30m×0.25mmi.d.×0.25μm）或等效柱。11.3组织粉碎机。11.4旋转蒸发仪。11.5氮气浓缩器。11.6振荡器。11.7玻璃层析柱：柱长30cm，柱内径1.8cm。11.8涡旋混合器。11.9超纯水装置。11.10分析天平：感量为0.1mg。11.11离心机：转速≤10000r/m。12分析步骤12.1试样制备12.1.1样品提取取50g试样，经粉碎机粉碎，﹣20℃冷冻保存。准确称取试样2g(精确到0.001g），加入10.0mg/L1313C3-丙烯酰胺内标溶液10μL（或20μL），相当于100ng（或200ng）的C3-丙烯酰胺内标，再加入超纯水10mL，振荡30min后，于4000r/m离心10min，取上清液备用。12.1.2样品净化在试样提取的上清液中加入硫酸铵15g，振荡10min，使其充分溶解，于4000r/m离心10min，取上清液10mL，备用。如上清液不足10mL，则用饱和硫酸铵补足。取洁净玻璃层析柱，在底部填少TMTM许玻璃棉，压紧，依次填装无水硫酸钠10g、Extrelut20硅藻土2g。称取5gExtrelut20硅藻土与上述备用的试样上清液搅拌均匀后，装入层析柱中。用70mL正己烷淋洗，控制流速为2mL/min，弃去正己烷淋洗液。用70mL乙酸乙酯洗脱，控制流速为2mL/min，收集乙酸乙酯洗脱溶液，并在45℃水浴下减压旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯洗涤蒸发瓶残渣三次（每次1mL），并将其转移至已加入1mL超纯水的试管中，涡旋振荡。在氮气流下吹去上层有机相后，加入1mL正己烷，涡旋振荡，于3500r/m离心5min，取下层水相备用衍生。12.1.3衍生试样的衍生：在试样提取液中加入溴试剂1mL，涡旋振荡，4℃放置至少1h后，加入0.1mol/L硫代硫酸钠溶液约100μL，涡旋振荡除去剩余的衍生剂；加入2mL乙酸乙酯，涡旋振荡1min，于4000r/m离心5min，吸取上层有机相转移至加有0.1g无水硫酸钠的试管中，加入乙酸乙酯2mL重复萃取，合并有机相；静置至少0.5h，转移至另一试管，在氮气流下吹至近干，加0.5mL乙酸乙酯溶解残渣（注意：根据仪器的灵敏度，调整溶解残渣的乙酸乙酯体积，通常情况下，采用串联质谱仪检测，其使用量为0.5mL，采用单级质谱仪检测，其使用量为0.1mL。），备用。标准系列溶液的衍生：量取标准系列溶液各1.0mL，按照上述试样衍生方法同步操作。13仪器参考条件6 GB5009.204—201413.1色谱条件色谱柱：DB-5ms柱（30m×0.25mmI.D.×0.25μm）或等效柱。进样口温度：120℃保持2min，以40℃/min速度升至240℃，并保持5min。色谱柱程序温度：65℃保持1min，以15℃/min速度升至200℃，再以40℃/min的速度升至240℃，并保持5min。载气：高纯氦气（纯度>99.999%），柱前压为69mPa，相当于10psi。不分流进样，进样体积1μL。13.2质谱参数检测方式：选择离子扫描（SIM）采集。电离模式：电子轰击源（EI），能量为70eV。传输线温度：250℃。离子源温度：200℃。溶剂延迟：6min；质谱采集时间：6min~12min。丙烯酰胺监测离子为m/z106、133、150和152，定量离子为m/z150。13C3-丙烯酰胺内标监测离子为m/z108、136、153和155，定量离子为m/z155。13.3标准曲线的制作将衍生的标准系列工作液分别注入气相色谱-质谱系统，测定相应的丙烯酰胺及其内标的峰面积，13以各标准系列工作液的丙烯酰胺进样浓度（μg/L）为横坐标，以丙烯酰胺及其内标C3丙烯酰胺定量离子质量色谱图上测得的峰面积比为纵坐标，绘制线性曲线。13.4试样溶液的测定13将衍生的试样溶液注入气相色谱-质谱系统中，得到丙烯酰胺和内标C3丙烯酰胺的峰面积比，根据标准曲线得到待测液中丙烯酰胺进样浓度（μg/L），平行测定次数不少于两次。13.5质谱分析分别将试样和标准系列工作液注入气相色谱-质谱仪中，记录总离子流图和质谱图（见附录A中图A.3~图A.4）及丙烯酰胺和内标的峰面积，以保留时间及碎片离子的丰度定性，要求所检测的丙烯酰胺色谱峰信噪比(S/N)大于3，被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致，同时被测试样中目标化合物的相应监测离子丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表1。14分析结果的表述采用内标法，按公式（1）计算试样中丙烯酰胺含量。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字（或小数点后1位）。15精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。16其他方法定量限为10μg/kg。7 GB5009.204—2014附录A色谱图和质谱图A.1图A.1～图A.2为LC-MS/MS测定丙烯酰胺的质量色谱图和质谱图。13注：从上至下依次为总离子流图（TIC），丙烯酰胺选择离子流图（72→55）和C3-丙烯酰胺内标选择离子流图（75→58）。13图A.1薯片中丙烯酰胺及同位素内标C3-丙烯酰胺的质量色谱图13图A.2丙烯酰胺及内标C3-丙烯酰胺的质谱图8 GB5009.204—2014A.2图A.3～图A.4为GC-MS测定丙烯酰胺的质量色谱图和质谱图。13注：上图：丙烯酰胺；下图：C3-丙烯酰胺。图A.3标准溶液的溴代衍生物GC-MS全扫描质谱图13注：从上至下依次为总离子流图、丙烯酰胺衍生物m/z150及C3丙烯酰胺衍生物m/z155的质量色谱图。图A.4薯片样品的GC-MS质量色谱图(四级杆)———————————————9'