GB541315-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定.pdf 10页

'中华人民共和国国家标准GB5413.15—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminniacinandniacinamideinfoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproducts2010-03-26发布2010-06-01实施中华人民共和国卫生部发布 GB5413.15—2010前言本标准第二法等同采用国际分析家学会（AOAC）944.13NiacinandNiacinamide(NicotinicAcidandNicotinamide)inVitaminPreparations。本标准代替GB/T5413.15-1997《婴幼儿配方食品和乳粉烟酸和烟酰胺的测定》。本标准第二法与GB/T5413.15-1997相比，主要变化如下：——增加了光密度法测定；——增加了淀粉类试样的测定；——增加标准曲线绘制的文字描述。本标准附录A为资料性附录。本标准代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.15-1997。I GB5413.15—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定。2规范性引用性文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法高效液相色谱法3原理试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以C18色谱柱分离，用紫外检测器定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。4.2盐酸。4.3氢氧化钠。4.4盐酸(2.4mol/L)：准确移取10mL盐酸（4.2）于50mL容量瓶中，用水定容。4.5氢氧化钠溶液（2.5mol/L）：称取5.0g氢氧化钠（4.3）于50mL容量瓶中，用水定容。4.6高氯酸（HClO4）：体积分数为60%。4.7甲醇（CH4O）：色谱纯。4.8异丙醇(C3H8O)：色谱纯。4.9庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S)：优级纯。4.10标准溶液4.10.1烟酸及烟酰胺标准储备液（1.0mg/mL）：称取烟酸及烟酰胺标准品各0.1g（精确到0.0001g），分别置于100mL容量瓶中，用水溶解定容。4.10.2烟酸及烟酰胺混合标准中间液（40µg/mL）：分别准确吸取烟酸及烟酰胺标准储备液（4.10.1）2mL至50mL定量瓶中，用水定容。临用前配制。1 GB5413.15—20104.10.3烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液：分别准确吸取烟酸及烟酰胺混合标准中间液（4.10.2）0.0mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL，至50mL容量瓶中用水定容。该标准系列浓度分别为0.00µg/mL、0.80µg/mL、1.60µg/mL、4.00µg/mL、8.00µg/mL。临用前配制。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。5.2pH计：精度为0.01。5.3超声波振荡器。5.4天平：感量为0.1mg。5.5培养箱：30℃～80℃。6分析步骤6.1试样的预处理6.1.1含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.0001g）加入约25mL45℃～50℃的水，或称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.0001g）于150mL锥形瓶中，再加入约0.5g淀粉酶（4.1），摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞，置于50℃～60℃的培养箱内培养约30min，取出冷却至室温。6.1.2不含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.0001g）加入约25mL45℃～50℃的水，或称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.0001g）于150mL锥形瓶中，振摇，静置5min～10min，充分溶解，并冷却至室温。6.1.3提取：将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约10min。6.1.4沉淀及定容：待试样溶液降至室温后，用盐酸（4.4）调节试样溶液的pH值至1.7±0.1，放置约2min后，再用氢氧化钠溶液（4.5）调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。将试样溶液转至50mL容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后经滤纸过滤，滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为试样待测液。6.2参考色谱条件色谱柱：C18柱（粒径5μm，150mm×4.6mm）或具有同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）70mL，异丙醇（4.8）20mL，庚烷磺酸钠（4.9）1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸（4.6）调pH至2.1±0.1，经0.45μm膜过滤。流速：1.0mL/min。检测波长：261nm。柱温：25℃。进样量：10μL。6.3定量分析6.3.1标准曲线绘制将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液（4.10.3）依次进行色谱测定（其标准样品色谱图参见附录A中图A.1.1）。记录各组分的色谱峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。2 GB5413.15—20106.3.2试样测定将试样待测液（6.1.4）进行色谱测定。记录各组分色谱峰面积或峰高，根据标准曲线计算出试样待测液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度c。i7分析结果的表述7.1试样中烟酸或烟酰胺含量的计算试样中烟酸或烟酰胺的含量按（1）式计算：c×V×100iX=………………………………………………………………（1）1或2m式中：X1或2——试样中烟酸或烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；m——试样的质量，单位为克（g）；c——试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；iV——试样溶液的体积，单位为毫升（mL）。7.2试样中维生素烟酸总含量的计算试样中维生素烟酸的总含量按（2）式计算：X＝X+X……………………………………………………………………………（2）12式中：X——试样中维生素烟酸的总含量，单位为微克每百克（μg/100g）；X1——试样中烟酸的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；X2——试样中烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法微生物法9原理利用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014对烟酸和烟酰胺的特异性，在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定烟酸和烟酰胺的含量。10试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。10.1硫酸溶液A（10mol/L）：将质量分数为95%～98%的浓硫酸560mL缓慢加入到600mL水中，边加边搅拌，冷却后定容至1000mL。3 GB5413.15—201010.2硫酸溶液B（1mol/L）：吸取100mL10mol/L的硫酸溶液A（10.1），转移至1000mL容量瓶用水定容。10.3氢氧化钠溶液A（3.75mol/L）：称取150g氢氧化钠于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。10.4氢氧化钠溶液B（0.375mol/L）：吸取100mL氢氧化钠溶液A（10.3）转移至1000mL容量瓶用水定容。10.5氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L±0.0002mol/L）：称取4g（精确至0.0001g）氢氧化钠用水稀释至1000mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗透。10.5.1氢氧化钠标准溶液的标定：称取约0.18g（精确至0.0001g）于105℃～110℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，用50mL除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴5g/L的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。氢氧化钠标准溶液的浓度为：mc=……………………………………………………………(3)(V−V)×.0204212式中：c——氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m——邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g）；V1——氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）；V2——空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）。10.5.2酚酞溶液：称取0.5g酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，并加入20mL水，加入氢氧化钠标准滴定溶液（10.5），直至加入一滴立即变成粉红色，再加入水定容至100mL。10.6盐酸（0.1mol/L）：吸取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。10.7乙醇溶液：体积分数为25%。量取250mL无水乙醇，加入750mL水，混匀。10.8菌株：植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014。10.9培养基（或可使用商品化的合成培养基）10.9.1乳酸杆菌琼脂培养基：光解胨15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。10.9.2乳酸杆菌肉汤培养基：光解胨15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。10.9.3烟酸测定用培养基：维生素测定用酸水解酪蛋白氨基酸（CasaminoAcids）12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。加蒸馏水至1000mL，调pH至6.7±0.2（20℃～25℃）。10.10标准溶液4 GB5413.15—201010.10.1烟酸标准贮备液（100μg/mL）：在五氧化二磷干燥器中取出已干燥的烟酸标准品，称取50.0mg(精确至0.1mg)，用乙醇溶液（10.7）溶解并定容至500mL，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为4个月。10.10.2烟酸标准中间溶液（10μg/mL）：从烟酸标准贮备液（10.10.1）中吸取10mL至100mL容量瓶，用乙醇溶液（10.7）定容，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为1个月。10.10.3烟酸标准工作液（100ng/mL）：从标准中间液（10.10.2）中吸取5.0mL，用水稀释至500mL。临用前配制。10.110.9%生理盐水：称0.9g氯化钠于100mL容量瓶中，稀释至刻度，振荡溶解。分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min，每周准备一次。10.12溴麝香草酚蓝指示剂：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加入1.6mL氢氧化钠标准滴定溶液（10.5）研磨，加少许水至完全溶解，转移至250mL容量瓶中用水定容。11仪器和设备11.1分光光度仪。11.2pH计：精度为0.01。11.3涡旋振荡器。11.4天平：感量为0.1mg。11.5生化培养箱：36℃±1℃。11.6离心机：转速≥2000转/分钟。11.7滴定管：分刻度值为0.1mL。12分析步骤12.1测试菌液的制备12.1.1把植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基（10.9.2）试管中，36℃±1℃培养24h，转接至乳酸杆菌琼脂培养基（10.9.1）试管中，36℃±1℃再培养24h。培养好的乳酸杆菌琼脂培养基（10.9.1）试管的培养物作为贮备菌种。12.1.2从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基（10.9.1）试管中，放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次，作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌株。12.1.3从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基（10.9.1）试管，36℃±1℃培养24h，作为日接种管每日测定用。12.1.4从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基（10.9.2），36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min（2000转/分钟），弃去上清液。用10mL生理盐水（10.11）振荡洗涤菌体，离心10min（2000转/分钟），弃去上清液，再加入10mL生理盐水（10.11）振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（10.11），混匀。吸取适量该菌悬液于10mL生理盐水（10.11）中，混匀制成测试菌液。12.1.5以生理盐水（10.11）做对照，用分光光度计于550nm波长下，测测试菌液（12.1.4）的透光率，此值应在60%～80%之间。5 GB5413.15—201012.2试样的制备称取2g（精确至0.0001g）固态试样或5g（精确至0.0001g）液态试样（约含烟酸0.1mg）于250mL三角烧瓶中，加20mL的硫酸溶液B（10.2）溶解试样，放入高压灭菌釜中121℃保持30min，取出冷却至室温。用氢氧化钠溶液A（10.3）和氢氧化钠溶液B（10.4）调pH至6.0～6.5，再用盐酸（10.6），调pH至4.5±0.1，用水定容至100mL，过滤。吸取25mL滤液于100mL烧杯中，用氢氧化钠标准滴定溶液（10.5）调pH至6.8±0.1，转入250mL容量瓶中定容。12.3标准曲线管的制作按表1顺序加入蒸馏水、标准溶液和培养基于试管中，表1中每一编号需制作3管。试管S2至S7中，相当烟酸含量为0ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng。表1标准曲线管的制作试管号S1S2S3S4S5S6S7蒸馏水（mL）5543210标准溶液（mL）0012345培养基（mL）555555512.4试样管的制作按表2顺序加入蒸馏水、试样和培养基于试管中，表中每一编号需制作3管。表2试样管的制作试管号1234蒸馏水（mL）4321样品（mL）1234培养基（mL）555512.5灭菌将标准曲线管和试样管121℃灭菌5min，迅速冷却到室温（商品化培养基按标签说明进行灭菌)。注：保证加热和冷却过程中条件均匀，灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响。12.6接种在无菌条件下，向上述每管中各加入一滴（约50μL）测试菌液（12.1.4），加盖，充分振荡混匀所有试管（标准曲线未接种空白管S1除外）。12.7培养12.7.1酸度法：在36℃±1℃，培养72h。通过对每个试管的目测检查，未接种试管内培养液应是澄清的，标准曲线管和试样管中培养液的浊度应有梯度。未接种管若混浊，则测定无效。12.7.2光密度法：在36℃±1℃，培养16h～24h。其他同12.7.1。12.8测定12.8.1酸度法12.8.1.1用10mL水将未接种空白管S1和接种空白管S2的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（10.12）作指示剂，或用pH计以pH6.8±0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（10.5）滴定标准曲线管中未接种空白管S1和接种空白管S2。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。6 GB5413.15—2010注：如果接种空白滴定反应消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积数等于或高于未接种空白水平的1.5mL，则测定结果无效。12.8.1.2用10mL水将标准曲线管和试样管中的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（10.12）作指示剂，或用pH计以pH6.8±0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（10.5）滴定标准曲线管和试样管的培养物。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。注：通常标准曲线管S7消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积数在8mL～12mL之间。12.8.2光密度法以接种空白管（表1中试管号S2）作对照，取出最高浓度标准曲线管S7，振荡5s，在波长550nm条件下读取光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。12.9标准曲线的绘制以标准曲线管烟酸含量作横坐标，以消耗氢氧化钠标准滴定溶液的滴定毫升数或光密度值为纵坐标绘制标准曲线。12.10试样管中烟酸含量的计算按照12.8每个试样管测定消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数或光密度值，从标准曲线中查得对应的烟酸含量。每一编号的三个试样管应计算管中每毫升测定液烟酸的含量，并与其平均值相比较。相对偏差小于15%的试管为有效试管，无效试样管应舍去，有效试样管总数应大于所有试样管总数的2/3。重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液烟酸含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx。注：样品管中烟酸含量低于100ng，高于500ng的值应舍去。13分析结果的表述试样中烟酸（烟酰胺）含量按式（4）计算：CxfX=××100…………………………………………………………………（4）m1000式中：X——试样中烟酸（烟酰胺）含量，单位为微克每百克（μg/100g）；Cx——12.10中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；f——稀释倍数；m——试样的质量或体积，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他本标准第一法检出限为：烟酸30μg/100g，烟酰胺40μg/100g。7 GB5413.15—2010附录A（资料性附录）烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图A.1烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图见图A.1。图A.1烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图8'