GBT14926.21-2008实验动物兔出血症病毒检测方法.pdf 6页

'ICS65．020．30B44园宜中华人民共和国国家标准GB／T14926．21—2008代替GB／T14926．212001实验动物兔出血症病毒检测方法Laboratoryanimal--MethodforexaminationofRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV)2008—12—10发布2009—03-01实施丰瞀嬲紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19 刖昂GB／T14926．2卜一2008GB／T14926<<实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。本部分自实施之日起代替GB／T14926．21—2001《实验动物兔出血症病毒检测方法》。本部分与GB／T14926．2l一200l相比主要技术差异如下：a)增加兔出血症病毒核酸(RHDV)核酸检测方法；b)确定兔免疫接种RHDV疫苗后的血清抗体合格判定标准。本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归口。本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会。本部分主要起草人：贺争鸣、付瑞、田克恭。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T14926．211994，GB／T14926．212001。 实验动物兔出血症病毒检测方法1范围GB／T14926的本部分规定了兔出血症病毒(RHDV)的检测方法。本部分适用于兔RHDV抗原、抗体和病毒核酸的检测。2规范性引用文件GB／T14926．21—2008下列文件中的条款通过GB／T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB／T14926．53实验动物血凝试验GB／T14926．54实验动物血凝抑制试验3原理血凝试验(HA)：在一定条件下，RHDV能凝集人“O”型红细胞，产生可见的凝集反应。根据这一特性检测兔肝组织中有无RHDV抗原。血凝抑制试验(HAI)：在一定条件下，RHDV凝集人“o”型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制。根据这一特性检测兔血清中有无RHDV抗体。核酸检测：根据RHDVVP60基因序列保守的特点，设计特异引物，扩增目的片段，检测兔组织中的RHDV核酸。4主要试剂与器材4．1试剂4．1．1血凝素人工感染或自然发病的兔肝组织，经研磨制成10％悬液，3000r／min离心10min而获得的上清液。4．1．2阳性血清RHDV抗原免疫或RHDV自然感染恢复后的兔血清。4．1．3阴性血清无RHDV感染、未经免疫的兔血清。4．1．4人“0”型红细胞。4．1．5缓冲液与溶液4．1．5．1PBS(pH7．4)NaCl8gKCl0．2gNa2HP04·12H202．83gKHzPOt0．2g去离子水1000mL4．1．5．2TRIzolReagent。1 GB／T14925．21—20084．1．5．350×TAEBuffer(pH8．5)Tris242g醋酸57．1mLNazEDTA·2H2037．2g去离子水1000mL5．4溴乙锭(10mg／mL)。5．56×LodingBuffer。5．6氨苄青霉素(100mg／mL)。5．7三氯甲烷(分析纯)。5．8乙醇(分析纯)。5．9异丙醇(分析纯)。6酶与缓冲液6．15×AMVRTBuffer，AMVRTase(10U／pL)。6．2RNaseinhibitor(40U／uL)。6．3DEP(、_H：O。6．4随机引物9mers(500pg／mL)。6．5dNTPmixture(2．5mmol／Leach)。6．6MgCl2(25mmol／L)，10×PCRBuffer，TaqDNApolymerase(5U／pL)。7培养基7．1LB培养基tryptone10gyeastextract5gNaCl10g去离子水1000mL4．1．7．2LB／Amptryptone10gyeastextract5gNaCI10gampicillin100pg／mL去离子水1000mL4．1．8琼脂糖凝胶AgaroseL03。4．1．9感受态细胞与载体4．1．9．1适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞。4．1．9．2DNA片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒。4．1．9．3可用于连接PCR产物的商品化T载体。4．1．9．4质粒小量提取试剂盒。4．2器材4．2．1微量振荡器。4．2．2微量血凝反应板(u型或V型)。4．2．3微量加样器(容量0．5pL～10ffL，10ffL～100弘L，20tzL～200p-L，i00卜L～l000pL)。4．2．4生物安全柜。4．2．5冷冻离心机。4．2．6紫外分光光度仪。24 4．2．7PCR仪。4．2．8电泳仪。4．2．9紫外透射仪。4．2．10恒温培养箱。4．2．11恒温摇床。4．2．12恒温水浴箱。4．2．13超纯水系统。4．2．14冰箱。GB／T14926．21—20085操作步骤5．1采用HA方法(见GB／T14926．53)进行病毒抗原检测。5．2采用HAl方法(见GB／T14926．54)进行病毒抗体检测。5．3病毒核酸检测5．3．1引物设计根据RHDVFDR株序列(GenBank登录号：Nc-001543)，针对VP60基因区段设计引物。引物在RHDV基因组中的位置、核苷酸组成及预期扩增目的基因长度见表1。表1RT-PCR引物引物位置序列产物大小正向引物P1nt6254一nt62715’一ATGCCAATGCTGGG2、CT03’368bp反向引物P2nt6621nt66025’TTGAGGCGTGTATGTGATGG3，5．3．2RNA提取5．3．2．1在生物安全柜内，取RHDV感染的兔肝组织50mg～100mg，置于灭菌玻璃研磨器中，加1mI，灭菌PBS(pH7．4)充分研磨。5．3．2．2将肝组织匀浆转移至1．5mL洁净离心管中，加入1mLTRfzolReagent，混匀，室温放置10min。5．3．2．3加0．2mL三氯甲烷，充分混匀10s，室温放置10min，4℃12000r／min离心15min。5．3．2．4取上清，加等体积异丙醇，室温20min，4℃12000r／min离心15min。5．3．2．5弃上清，沉淀以1mL75％乙醇(现用现配)洗涤后，室温干燥至RNA呈透明膜状。5．3．2．6加40pLDEPC-H。O溶解RNA(沉淀)，紫外分光光度仪测定所提取的RNA，立即进行反转录(RT)或一70℃保存。警告：DEPC对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴口罩，不小心沾到手上应立即冲洗。5．3．3反转录(RT)5．3．3．1RT反应体系为25pL，依次加入如下成分：5pL5×AMVRTBuffer，5肛LdNTPmixture(2．5mmol／Leach)，1pL随机引物(500pg／mL)，0．5pLRNaseinhibitor(40U／pL)，12．5pLRNA模版，1pLAMVRTase(10U／pL)。5．3．3．2反转录反应条件为：37℃90min，95℃5min，所得cDNA可用作PCR反应模板。5．3．3．3每次进行RT时均设标准阳性、阴性及空白对照。5．3．4R2"-PCR5．3．4．1PCR反应体系为50止，依次加入如下成分：5吐loXPCRBuffer，2pLMgCl2(25mmol／L)，2pLdNTPmixture，1pL正向引物P1(50pmol／L)，1pL反向引物P2(50pmol／L)，2pLeDNA，0．5pLTaqDNApolymerase(5U／pL)，36．5pLddH20。 GB／T14926．21—20085．3．4．2PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃1min，59℃1min，72oc1min，共30次循环；最后一次循环后72℃再延伸10min。5．3．4．3每次进行RT-PCR时均设标准阳性、阴性及空白对照。5．3．5琼脂糖凝胶电泳5．3．5．1配制2％琼脂糖凝胶(含0．5／zg／mL溴化乙锭)。5．3．5．2取PCR扩增产物8pL，分别与2pL的6×载样缓冲液混匀，加到凝胶孔格中。5．3．5．3电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为i00V恒压电泳30min～60min，紫外透射仪下观察结果。5．3．6RHDV基因的克隆、鉴定及序列测定5．3．6．1RHDVRT-PCR和RT-nestedPCR产物经2．0％琼脂糖凝胶电泳后，用洁净锋利的手术刀切下目的条带，用WizardPCRPrepsDNAPurificationSystem回收纯化，取1pL电泳检测。5．3．6．210pL的连接反应体系中依次加入下列成分：5pL2×RapidLigationBuffer，pGEM—TEasyVector1pL，回收纯化的PCR目的片段3pL，1pLT4DNALigase。连接反应条件为：室温1h，4℃12h。5．3．6．3取5pL连接产物转化E．coliDH5a感受态细胞，然后将转化的菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(100ug／mL)的LB平板上，37℃培养过夜。挑取光滑、圆整的白色菌落，接种于含氨苄青霉素(100Pg／mL)的LB液体培养基，37℃200r／min摇振培养6h，然后用质粒小量提取试剂盒制备质粒DNA供限制性酶切分析，并进行PCR鉴定。5．3．6．4将筛选到的阳性克隆分别送检测单位，以T7和SP6通用引物，用ABI测序仪进行序列测定。测序结果经计算机软件分析与OenBank中相关序列进行同源性比较。6结果判定6．1HA经研磨制成10％的兔肝上清液，HA滴度小于等于1：16判为阴性。对阳性(HA滴度大于1：16)检测结果，选用同一种方法重试，如仍为阳性则判为阳性。6．2HAI6．2．1基础级兔：如接种疫苗，HAI抗体效价大于1：10，同时免疫抗体合格率[(被检动物抗体阳性数／被检动物总数)×100％]大于等于70％判定该兔群免疫合格。6．2．2清洁级兔、SPF兔：HAI抗体效价小于等于1：10判为阴性；对阳性(HAI抗体效价大于1：10)检测结果，选用同一种方法重试，如为阳性则判为阳性。6．3RT-PCR每个样本均进行两次试验检测，以标准Marker及阳性对照为基准，在368bp处见到电泳条带并测序结果正确者为阳性。7结果报告根据判定结果，作出报告。'