GBT14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂.pdf 23页

'ICS65020.30I344词免费标准网(www.freebz.net)臀中华人民共和国国家标准GB/T14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂Laboratoryanimal-Bacterioogicalmonitoring-Staining,mediaandreagents2001-08-29发布2002-05-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总婿免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001前言本标准规定了实验动物微生物学检测的染色法、培养基和试剂。在以前的相关标准中对染色法、培养基和试剂的具体内容没有进行描述，基本上是引用GB4789.4-1994《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验),GB4789.10一工994(食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验),GB4789.工工-1994《食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》和GB4789.28-1994《食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》中相关内容，给本标准的使用造成不便。为将染色法、培养基和试剂的配制方法和操作程序标准化并便于查找，特制定本标准。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红、黄韧、范薇。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)中华人民共和国国家标准实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T14926.43-2001Laboratoryanimal-Bacteriologicalmonitoring-Staining,mediaandreagents范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴的细菌学检测。2原理实验动物微生物从培养基中摄取营养物质，维持正常的生长繁殖和代谢，其所含细胞物质能与各种染料结合，呈现不同颜色。3染色液的配制和染色法3.1革兰染色法3.1.1结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸钱水溶液80mL将结晶紫在乳钵内研磨，用乙醇溶解，加人草酸按水溶液混合，即可使用。3.1.2碘液碘1g碘化钾29蒸馏水300mL将碘化钾与碘先用少量水溶解，待全部溶解后，加蒸馏水至300mL,3.1.3脱色液95%乙醇3.1.4沙黄(番红)复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄在乳钵内研磨.用乙醇溶解，加人蒸馏水混合，即可使用。3.1.5染色法3.1.5.1涂片风干后在火焰上固定。3.1.5.2滴加结晶紫染色液，染色1min，流水冲洗，甩干。中华人民共和国国家质It监督检验检疫总局2001-08-29批准2002-05-01实施1免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20013.1.5.3滴加碘液，媒染1min，流水冲洗，甩干。3.1.5.4滴加95%乙醇脱色约15^30s，流水冲洗，甩干。3.1.5.5滴加沙黄复红染液，染色1min，流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。3.1.6结果使用油镜放大1000倍观察，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。3.2姬姆萨染色法3.2.1姬姆萨染液3.2.1.1储存液姬姆萨粉末。.59甘油(中性)25mL甲醇25mL将姬姆萨粉于研钵内，先加少许甘油研磨，至甘油加完为止，倒人棕色试剂瓶中，再用少量甲醇加人研钵内，逐渐将甘油洗下，倒人试剂瓶内，直至用甲醇洗净研钵体内甘油为止。并将剩余甲醇一并加人瓶中，塞紧瓶盖，充分摇匀，置600C温箱内24h或室温一周后即可使用。3.2.1.2应用液使用前储存液用pH7.2-7.4PBS10倍稀释即成。3.2.2染色法涂片或压印片风干后用甲醇固定5min后滴加姬姆萨应用液，染色20-30min，用流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。3.2.3结果使用油镜放大1000倍观察，组织、脓汁或红细胞呈红色，细菌呈紫色。3.3英膜染色法3.3.1染色液甲醛中加人2%印度黑汁;革兰染色液中的沙黄复染液。3.3.2染色法3.3.2.1取一接种环肉汤培养物于载玻片上，再取一接种环甲醛印度黑汁与其混匀，推成薄片，自然干燥后火焰固定。3.3.2.2滴加沙黄复染液，染色30s，吸去多余液体，干燥后油镜观察。3.3.3结果使用油镜放大1000倍观察，细菌周围有透明带者为英膜染色阳性。3.4支原体菌落染色法3.4.1染色液(Dienes染色液)美兰2.59刃天青(azure)1.25g麦芽糖10.0g苯甲酸。.29蒸馏水100mL3.4.2染色方法临用前将染色液用蒸馏水稀释100^-300倍，滴加到疑似有支原体菌落的平皿中，使其铺满个平皿，不断摇动，15min后倒掉染色液，用pH7.4PBS洗3次。3.4.3结果平皿置解剖镜或低倍镜下观察，支原体菌落呈蓝色，L型细菌菌落在短时间内能染上蓝色，但30-60min后褪色，呈无色。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20013.5乳酸酚棉蓝染色液3.5.1染色液结晶酚20g乳酸20mL甘油40mL蒸馏水20mL棉蓝0.05g除棉蓝外，其余成分混匀后水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，然后加人棉蓝，混合均匀，必要时过滤，瓶装备用3.5.2染色方法:取载玻片并加染色液数滴，用接种针(环)取培养物置于染色液中，然后加盖玻片，静置10min后，吸去周围染液，用高倍镜检查。3.5.3结果:真菌菌体呈蓝色。3.6鞭毛染色液3.6.1染色液3.6.1.1甲液:单宁酸5g,氯化高铁(FeCl,)1.5g溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加人1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL.3.6.1.2乙液:2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化按溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止，(此为关键性操作，应特别小心)，滴加氢氧化按和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用。3.6.2染色法:在风干的载玻片上滴加甲液4-6mL后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒气，维持约30s(加热时注意勿使出现干燥面)，在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，烘干镜检。3.6.3结果:用油镜放大1000倍观察，菌体及鞭毛呈深褐色或黑色。3.7氢氧化钾二甲基亚矾液3.7.1成分二甲基亚矾(DMSO)40mL氢氧化钾10--20g蒸馏水60mL3.7.2制法:将DMSO与蒸馏水混匀后加人氢氧化钾，置棕色瓶中备用。4一般培养基、选择性培养基和鉴定用培养基4.1牛肉浸液培养基4.1.1成分新鲜除脂牛肉500g氯化钠5g蛋白陈10g蒸馏水1000mLpH7.4一7.64.1.2制法将完全除去脂肪、肌腔和筋膜的牛肉500g，加蒸馏水1000mL，充分搅拌后置4℃冰箱过夜。次日煮沸30min，并不时搅拌。用绒布或多层纱布粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在滤液中加人其他成分溶解后用氢氧化钠溶液矫正pH至8.0，并煮沸10min，补充蒸馏水至1000mL>pH有明显下降时再矫3免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001正至7.6-7.8，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，121‘C灭菌15min备用，此时的pH值应该是7.4--7.6.4.2营养肉汤4.2.1成分蛋白陈10g牛肉膏39氯化钠59蒸馏水1000mLpH7.44.2.2制法将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，分装中试管，每管5mL,121℃灭菌15min,置4℃冰箱保存，两周内用完。4.3普通营养琼脂4.3.1成分营养肉汤中加人1.2%-1.5%的琼脂。4.32制法煮沸溶解琼脂后121℃灭菌15min.待冷至50℃左右时倾注无菌平皿，凝固后置4"C冰箱保存，两周内用完。4.4血琼脂4.4.1成分营养琼脂中加人5%-10%的脱纤维羊血。4.4.2制法待已灭菌的营养琼脂冷至50℃左右时以无菌手续加人血液，轻轻摇匀后倾注平皿，凝固后置4℃冰箱保存，一周内用完。4.5半固体琼脂4.5.1成分营养肉汤中加人。3%的琼脂。4.5.2制法加热煮沸，待琼脂溶化后分装小试管，每管2mL.塞上透气塞，121℃灭菌15min，直立放置，冷却后4℃冰箱保存，两周内用完。4.6DHL琼脂(胆盐硫乳琼脂培养基)4.6.1成分蛋白陈209牛肉膏39乳糖10g蔗糖10g去氧胆酸钠19硫代硫酸钠2.39构椽酸钠19水解酪蛋白59构椽酸铁馁191肠中性红3mL琼脂粉159免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001蒸馏水1000mLpH7.44.6.2制法除1%中性红溶液及琼脂外，上述成分混和，微温使溶解，调节pH值至7.4，加人琼脂，加热煮沸溶化后再加人中性红溶液，摇匀，冷至约50^-55℃时倾注平皿。凝固后放置4℃冰箱保存，两周内用完。4.7SS琼脂4.7.1成分蛋白脉5g牛肉膏5g乳糖10g胆盐(3号)3.5g构椽酸钠(H2O)8.5g硫代硫酸钠8.5g构穆酸铁按1g1洲中性红溶液2.5mL。1%亮绿溶液。.33mL琼脂5--20g蒸馏水1000mLpH7.0一7.24.7.2制法除中性红、亮绿及琼脂外，混和其他成分，加热溶解，调节pH值，加人琼脂，加热溶化，再加人中性红和亮绿摇匀，冷至约55--60℃时倾注平皿。凝固后放置4℃冰箱保存，一周内用完。4.8麦康凯琼脂4.8.1成分蛋白陈20g氯化钠5g胆盐(猪、牛等)5g乳糖10g琼脂1520g1写中性红溶液5mL蒸馏水1000mLpH7.24.8.2制法将上述成分(中性红和琼脂除外)混合，加热溶解，校正pH，加人琼脂，煮沸溶化后再加人中性红溶液，摇匀，115℃灭菌20min，待冷至50^-55℃时倾注平皿。凝固后置4℃冰箱保存，一周内使用。4.9亚硒酸盐增菌液(SF)4.9.1成分蛋白脉5g乳糖4g磷酸氢二钠4.5g磷酸二氢钠5.5g亚硒酸氢钠4g蒸馏水1000mL5免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001pH7.0-7.24.9.2制法先将亚硒酸盐加到200mL蒸馏水中，充分摇匀溶解。混合其它成分，加人蒸馏水800mL，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH值(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正)。最后分装中试管，每管5mL，置水浴隔水煮沸10^15min，立即冷却，4℃冰箱保存，一周内使用。4.10李氏增菌肉汤(LB1,LB2)4.10.1成分胰蛋白膝59多价陈5g酵母浸膏59氯化钠59磷酸二氢钾1.35g磷酸氢二钠12g七叶昔1g蒸馏水1000mL4.10.2制法将上述成分加热溶解，调pH至7.2-7.4，分装，1210C15min灭菌。LB1:225mL中加人1写蔡陡酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)0.45mL1%丫咙黄(用灭菌蒸馏水配制)0.27mLLBZ:200mL中加人1纬禁吮酮酸0.40mL1%丫陡黄。50mL分装中试管，每管5mL,4.11改良的McBride琼脂(MMA)4.11.1成分胰蛋白脉59多价脉59牛肉膏3g葡萄糖19抓化钠5g磷酸氢二钠19苯乙醇2,smL无水甘氨酸10g氯化铿0.59琼脂15g蒸馏水1000mLpH7.2-7.44.11.2制法除琼脂外混合上述成分，加热溶解，校正pH后再加人琼脂，煮沸溶化，121℃灭菌15min，待冷却至50--55℃时倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.12Cary-Stair氏运送培养基4.12.1成分免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001硫乙醇酸钠1.59磷酸氢二钠1.1g氯化钠59琼脂5g蒸馏水1000mL1%氯化钙溶液9ml-pH8.44.12.2制法除氯化钙外混合其他成分，加热煮沸溶解，冷至50℃时加人氯化钙溶液，校正pH。分装中试管，每管5mL，加胶塞，121℃灭菌15mina4.13改良磷酸盐缓冲液4.13.1成分磷酸氢二钠8.23g磷酸二氢钠(NaH,Pq·12H,0)1.2g氯化钠59三号胆盐1.59山梨醇20g蒸馏水1000mL4.13.2制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加人其余成分，溶解后校正pH7.6，分装中试管，每管5mL,121℃灭菌15min备用。4.14CIN-1培养基4.14.1基础培养基胰蛋白膝20g酵母浸膏29甘露醇20g氯化钠1g去氧胆酸钠29硫酸镁(MgS04·7H20)0.01g琼脂129蒸馏水950mLpH7.4-7.64.14.2Irgasan:以95%乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成。.4%的溶液，待基础培养基冷至80"C时加人1mL混匀。4.14.3冷至50℃时加人中性红(3mg/mL)10mL结晶紫(0.1mg/mL)10mL头抱菌素(1.5mg/mL)10mL新生霉素(0.25mg/mL)10mL最后不断搅拌着加人10mL100o氯化银溶液，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.15改良Y培养基4.15.1成分蛋白陈15g7免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001氯化钠59乳糖10g草酸钠29去氧胆酸钠69三号胆盐59丙酮酸钠29孟加拉红40mg水解酪蛋白59琼脂17g蒸馏水1000mL4.15.2制法混合上述成分，加热煮沸溶解后121℃灭菌15min,冷至50--55℃时倾注平皿，凝固后冷藏备用4.16葡萄糖蛋白陈琼脂(沙氏培养基)4.16.1成分蛋白脉10g葡萄糖40g琼脂18g蒸馏水1000mL4.16.2制法加热溶解调pH至5.6，分装大号中试管，10mL/管，116℃灭菌30min后放成斜面，凝固后冷藏备用。4.17皮肤癣菌鉴别琼脂(DTM)4.17.1成分蛋白脉10g葡萄糖20g酚红(0.2写)6ml盐酸(0.6mol/L)6mL琼脂18g蒸馏水1000mL抗生索:氯霉素40mg或金霉素100mg硫酸庆大霉素100mg4.17.2制法除抗生素外，其他成分加热溶解调pH至5.5,121℃灭菌15min备用将抗生素制备成溶液后，过滤除菌，使用前临时加人。在室温中制成斜面。4.18支原体半流体培养基4.18.1成分含0.3写琼脂的支原体基础培养基(支原体液体培养基干粉，按使用说明书称量、并加人。.3%琼脂，配制)3.5mL马血清1.0mL醉母浸出液0.5mL青霉素添加液。.25mL乙酸铭添加液。.1mL免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20014.18.2制备方法:各种成分均需分别制备，使用时按上述比例混合。4.18.2.1含。.3环琼脂的支原体基础培养基:按使用说明书称量并加人琼脂，蒸馏水煮沸溶解，分装中试管，每管3.5mL，用胶塞塞紧后灭菌4℃保存备用。4.18.2.2马血清:市售马血清经56"C30min灭活后一20℃保存4.18.2.3酵母浸出液:市售酵母浸出粉用蒸馏水配制成7%的溶液，0.22pm滤膜过滤除菌，小量分装一20℃保存。使用时分装小试管，每管。.6-0.7ml，用于咽及气管洗脱液的制备。4.18.2.4青霉素添加液:注射用青霉素钾盐或钠盐用灭菌蒸馏水配制成每毫升含1万U的溶液，小量分装一20℃保存。4.18.2.5乙酸铭添加液:乙酸铂1g溶于100ml灭菌蒸馏水中，小量分装一20"C保存。4.18.3使用:基础培养基溶化后置50℃水浴中，将马血清、青霉素添加液及乙酸铭添加液根据需要量按上述比例混合作为总添加液，取出冷至50℃的基础培养基，分别加人总添加液1.35mL、用酵母浸出液制成的洗脱液0.5mL,混匀后即可培养。4.19支原体液体培养基4.19.1成分支原体基础培养基(干粉，按使用说明书称量、配制)3.5mL马血清1.0mL酵母浸出液0.5mL青霉素添加液0.25mL乙酸铂添加液。.1mL4.19.2制法支原体基础培养基:按使用说明书称量，加人蒸馏水煮沸溶解，分装中试管，每管3.5mL，用胶塞塞紧后灭菌4℃保存备用。临用时将各种成分混均即可。4.20支原体固体培养基4.20.1成分支原体固体培养基基础(干粉，按使用说明书称量、配制)70mL马血清20mL酵母浸出液10mL青霉素添加液5mL乙酸蛇添加液2.5mL4.20.2制法固体培养基基础冷至50℃时加人各种添加液，混匀后倾注无菌平皿，凝固后用保鲜袋保装后置4"C保存，一周内使用。4.21高盐甘露醇琼脂(SP)4.21.1成分牛肉膏19蛋白陈或多价脉10g氯化钠75g甘露醇10g酚红0.025g琼脂15g蒸馏水1000mL9免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001pH7.44.21.2制法除酚红和琼脂外混合上述成分，加热溶解，校正pH至7.4，加人酚红，115℃灭菌15min，冷至50-550C时倾注平皿，凝固后冷藏，两周内使用。4.22葡萄糖肉浸液肉汤4.22.、成分牛肉浸液培养基中加人1%葡萄糖。4.22.2制法待葡萄糖完全溶解后先后装中试管，每管5mL,115℃灭菌20min。也可用少量已灭菌的牛肉浸液溶解葡萄糖，过滤除菌后混合，摇匀，分装。4.23链球菌增菌肉汤4.23.1成分胰蛋白陈159大豆陈59氯化钠4g柠檬酸钠(CH,Na,07·2H,0)1g1-胧氨酸0.2gD葡萄糖59亚硫酸钠。.29三氮化钠。2g结晶紫0.0002g蒸馏水1000mLpH7.3-7.54.23.2制法除结晶紫外，将其它成分混合，加热溶解调pH至7.3--7.5，加人结晶紫，混匀，分装，经116"C,15min高压灭菌，以无菌手续加其余成分，摇匀，分装中试管，每管5mL，冷藏备用。4.24NAC增菌液4.24.1成分磷酸氢二钾。39硫酸镁(MgSO,·7H20)0.3g蛋白脉20g十六烷三甲基澳化按。29禁咤酮酸15mg蒸馏水1000mLpH7.64.24.2制法除十六烷三甲基澳化铁外，将上述成分混合、溶解，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.4--7.5后，加人十六烷三甲基澳化按溶解后分装中试管.每管5mL,121℃灭菌1min，冷却后冷藏备用。4.25NAC琼脂4.25.1成分NAC液体培养基1000mL琼脂1594.252制法10免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001将琼脂加人:VAC液体培养基中，121℃灭菌1min，冷至50-55,C，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.26改良Camp-BAP培养基4.26.1成分4.26.1.1基础培养基胰蛋白陈10g蛋白脉10g葡萄糖19酵母浸膏29氯化钠59焦亚硫酸钠。.19硫乙醇酸钠1.59琼脂15g蒸馏水1000mL4.26.1.2抗生素添加剂万古霉素。.01g多粘菌素B2500IU两性霉素B0.002g头抱菌素0.015g4.26.1.3脱纤维羊血50mL.4.26.2制法混合基础培养基成分，加热溶解，校正pH至7.0，分装，121℃灭菌15min，冷至50`C时加人抗生素添加剂及脱纤维羊血，摇匀后倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.27Skirrow氏培养基4.27.1成分4.27.1.1基础培养基蛋白陈15g胰蛋白豚59酵母浸膏59氯化钠5g琼脂12g蒸馏水1000mL4.27.1.2甲氧节氨啼咙(TMP)、抗生素万古霉素10mg多粘菌素B2500IU甲氧节氨啼咙(TMP)5mg4.27.1.3脱纤维羊血70mL.4.27.2制法4.27.2.1TMP、抗生素添加液。4.27.2.1.1乳酸62mg(约2滴)加人100mL灭菌蒸馏水中，然后加人TMP100mg，煮沸。4.27.2.1.2取上述溶液5mL加人万古霉素和多枯菌素B,摇匀后即成。4.27.2.2混合基础培养基各成分加热溶解，调pH至7.2，分装，每瓶100mL,121`Cl5min灭菌，冷藏备用。临用前加热溶解，冷至50℃时每100ml中加人脱纤维羊血7ml.,TMP、抗生素添加液0.5mL摇匀，倾注平皿。l1免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20014.28脑心浸液肉汤4.28.1成分脑浸液干粉12.5g心浸液干粉59胰蛋白陈10g氯化钠59葡萄糖29磷酸二氢钠(无水)2.59蒸馏水1000mlpH7.44.28.2制法混合上述成分，加热溶解后调整pH值，分装中试管，每管5mL，使用透气塞，121℃灭菌15min，冷却后冷藏，一周内使用。4.29硫乙醇酸钠肉汤4.29.1成分酵母浸出粉59胰蛋白陈15g葡萄糖5.5g硫乙醉酸钠0.59氯化钠25g刃天青0.001g琼脂0.59蒸馏水1000mLpH7.24.29.2制法混合上述成分，煮沸溶解，调整pH值，分装中试管，每管5mL，使用不透气胶塞，121℃灭菌15min，冷却后冷藏，一周内使用。4.30大豆蛋白陈肉汤4.30.1成分胰酶消化酪蛋白17g木瓜酶消化大豆粉39氯化钠59磷酸氢二钾2.59葡萄糖25g蒸馏水1000mLpH7.34.30.2制法混合上述成分，加热溶解，调整pH值，分装中试管，每管5mL，使用透气塞，1210C15min灭菌，冷却后冷藏，一周内使用。5生化培养基和血清学试剂‘月.J..糖醇发酵培养基工口O.-基础液成分1户土7︸免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GI3/T14926.43-2001牛肉膏59蛋白脉10g氯化钠39磷酸氢二钠(Na,HPO,·12H,0)2g0.2%澳察香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.45.1.2制法在基础培养基中加人。.5%的葡萄糖,0.1%的其他糖醇.溶解后分装小试管，其中葡萄糖发酵管中倒置一个小管,1150C20min灭菌，冷却后冷藏备用。5.2氨基酸脱梭酶试验培养基5.2.1成分蛋白陈59酵母浸出粉39葡萄糖1g1.6%澳甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mLL-氨基酸。.5g/100mL或DL氨基酸1g/100mLpH6.85.2.2制法除氨基酸以外的成分混和，加热溶解后分装，每瓶100mL，分别加人各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸，再校正pH至6.8，同时用不加氨基酸培养基作对照。分装于灭菌的小试管内，每管3mL，并加一层液体石蜡，121℃灭菌10min.5.3苯丙氨酸培养基5.3.1成分酵母浸膏3g氯化钠59D,L-苯丙氨酸2g(或L一苯丙氨酸1g)琼脂12g蒸馏水1000mL磷酸氢二钠195.3.2制法将上述成分加热溶解，分装试管，121℃灭菌15min，置成斜面。5.3.3试剂10纬三氯化铁溶液。5.3.4使用方法挑取琼脂培养物沿斜面划线接种，(36士1)0C培养18--24h,5.3.5结果观察滴加to写三氯化铁溶液数滴，自斜面培养物上流下，培养物呈深绿色者为阳性。5.4蛋白陈水(靛基质试验用)5.4.1成分13免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001多价陈20g氯化钠59蒸馏水1000mLpH7.45.4.2制法按上述成分配制，分装小试管，121℃灭菌15min，冷藏备用。5.4.3靛基质试剂5.4.3.1柯凡克试剂:将5g对二甲基氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加人浓盐酸25ml。5.4.3.2欧一波试剂:将1g对二甲基氨基苯甲醛溶解于95mL乙醇中，然后缓慢加人浓盐酸20ml,.5.4.4使用方法用固体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士1)0C18-24h培养，必要时延长培养至3d.5.4.5结果观察培养物中加人柯凡克试剂者，在两种溶液交界处呈红色为阳性;加人欧一波试剂者，在两种溶液交界处呈玫瑰红色为阳性。对弱阳性者可先在培养物中加人少量二甲苯，充分混匀后再加人靛基质试剂。5.5缓冲葡萄糖蛋白膝水(甲基红和VP试验用)5.5.1成分磷酸氢二钾59多价脉79葡萄糖59蒸馏水1000mL5.5.2制法混合上述成分，加热溶解后调pH7.0，分装小试管，每管1-2mL,115℃灭菌20min，冷却后冷藏备用。5.5.3试剂5.5.3.1甲基红(MR)试剂:10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加人20mL蒸馏水。5.5.3.2V-P试剂:6%a-蔡酚一乙醇溶液;40%氢氧化钾溶液。5.5.4使用方法挑取琼脂培养物或三糖铁或双糖铁培养物接种，(36士1)℃培养1824h.5.5.5结果观察55.5.1甲基红试验:培养物加人甲基红试剂一滴，立即变为鲜红色为阳性，黄色为阴性。5.5.5.2V-P试验:培养物中加人6%n-蔡酚一乙醇溶液。.5mL,40Y.氢氧化钾溶液。.2mL，数分钟内出现红色为阳性，不变色为阴性。5.6尿素培养基5.6.1成分蛋白陈20g。4%酚红溶液3mL氯化钠5g尿素29葡萄糖19蒸馏水1000mL5.6.2制法除指示剂外，用水溶解上述成分，煮沸，用1mol/L氢氧化钠溶液调节，然后加人指示剂，分装小试管，每管1--2mL,115℃灭菌15min，冷却后冷藏备用。也可将除尿素外的其他成分121℃灭菌15min14免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)G11/T14926.43-2001后加人过滤除菌的尿素溶液。5.6.3使用方法用固体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士l0C18-24h培养。5.6.4结果观察培养基由黄变红色为阳性。5.7硝酸盐培养基5.7.1成分硝酸钾。.29蛋白陈59蒸馏水1000mLpH7.45.7.2制法将上述成分溶解混匀，调pH至7.4，分装小试管，每管1^-2mL,121℃灭菌15min备用。5.7.3硝酸盐还原试剂5.7.3.1甲液:将0.8g对氨基苯黄酸溶解于100mL5mol/L乙酸溶液中5.7.3.2乙液:将0.5ga-蔡胺溶解于100mL5mol/L乙酸溶液中。5.7.4使用方法用琼脂培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士1)℃培养18-24ho5.7.5结果观察培养物中先加人甲液数滴，再加人乙液数滴，出现红色为阳性。5.8氧化酶试验5.8.1试剂1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，一周内使用。5.8.2试验方法取滤纸条粘取菌落，加氧化酶试剂一滴,30s内呈现红色至紫红色反应为阳性，于2min内不变色为阴性。注意:不能用接种针挑取菌落，只能用玻棒或竹签;对弱阳性者应同时用绿脓杆菌做阳性对照，用大肠埃希菌做阴性对照。5.9过氧化氢酶试剂5.9.1试剂3%过氧化氢溶液，临用时配制。5.9.2试验方法用接种环挑取菌落于千净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液适量，于30s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。5.10克氏双糖铁(KI)5.10.1成分蛋白膝20g牛肉膏39酵母膏3g乳糖10g葡萄糖lg氯化钠59柠檬酸铁馁0.59硫代硫酸钠。.5915免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001琼脂3g酚红0.025g蒸馏水1000mLpH7.45.10.2制法棍合除琼脂和酚红的上述成分，加热溶解后校正pH。加人琼脂，溶化后再加人。.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀，分装小试管，每管3mL,115℃灭菌20min，趁热放置成高层斜面，凝固后冷藏备用。5.10.3使用方法用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出在斜面上划线，(36士1)℃培养18-24h,5.10.4结果观察斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖和乳糖;高层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5.11三糖铁琼脂培养基(TSD5.11.1成分蛋白陈15g示陈59牛肉膏5.0g醉母膏3.0g乳糖3.0g蔗糖10g葡萄糖10g氯化钠1.0g硫酸亚铁5.0g硫代硫酸钠。.29酚红溶液0.3g0.5%酚红溶液5mL琼脂12g蒸馏水1000mLpH7.45.11.2制法将上述成分(除琼脂和酚红外)混合，加热溶解后校正pH，再加琼脂及酚红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4mL，经115℃灭菌20min，立即置高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。5.11.3使用方法用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出在斜面上划线，(36士1)℃培养18-24h,5.11.4结果观察斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖、蔗糖和乳糖;高层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5.12乙酸铅纸条5.12.1制法将滤纸剪成约。.5cmx10cm的长条，浸泡于3%乙酸铅水溶液中，以吸干水溶液为止。将该纸条置37℃培养箱中烘干，装人试管中，121℃灭菌15min,16免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20015.12.2使用方法悬空置于已接种的双糖铁或三糖铁或SIM培养管中，(36士1)℃培养18--24h。注意:勿使纸条接触培养基，否则因纸条变湿而影响结果观察。5.12.3结果观察纸条变黑者为硫化氢阳性。5.13SIM培养基5.13.1成分胰蛋白陈20g多价陈0.69硫酸铁按。.29硫代硫酸钠0.29琼脂3g蒸馏水1000mL5.13.2制法混匀上述成分，加热溶解，调pH7.2-7.4，分装小试管，每管2-3mL,121℃灭菌15min，放成高层，凝固后冷藏备用。5.13.3使用方法用琼脂培养物穿刺接种，(36士1)℃培养18^-24he5.13.4结果观察沿接种线向周围生长者为动力阳性;培养基沿接种线变黑者为硫化氢阳性;滴加靛基质试剂，在交界处出现红色者为靛基质阳性(参见靛基质试验)。5.14营养明胶5.14.1成分蛋白陈59牛肉膏39明胶120g蒸馏水1000mL5.14.2制法混合上述成分，水浴加热溶解，校正pH7.0-7.2，分装小试管，每管2--3mL,121℃灭菌15min,放成高层，凝固后冷藏备用。5.14.3使用方法挑取琼脂培养物穿刺接种，(36士1)℃培养1824he5.14.4结果观察培养物放4"C冰箱Ih，未见凝固者为明胶液化试验阳性;凝固者为阴性。5.15胆汁一七叶昔培养基5.15.1成分胰蛋白脉1.59七叶昔0.1g琼脂29胆汁2.5mL或胆盐0.3g柠檬酸铁。.2g蒸馏水100mL17免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001pH6.4-6.65.15.2制法上述成分加热溶解，调pH至6.4^6.6，分装试管，121℃灭菌15min，放成斜面备用。5.15.3使用方法用固体培养物沿斜面划线接种，(36士I)℃培养18^-24h,5.15.4结果观察培养基呈黑色者为阳性，不变色者为阴性5.16西蒙氏柠檬酸盐培养基5.16.1成分氯化钠59硫酸镁(MgS0,·7H,O)0.2g磷酸二氢按Ig磷酸氢二钾19柠檬酸钠59琼脂20g蒸馏水1000mLpH6.85.16.2制法先将盐类溶解于水中，再加人琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混匀后分装小试管，每管2.3mL,121℃灭菌15min，趁热放置成斜面，凝固后冷藏备用。5.16.3使用方法用固体培养物沿斜面划线接种，(36士1)℃培养18--24h,5.16.4结果观察培养基由绿变蓝者为阳性，不变色者为阴性。5.17丙二酸钠5.17.1成分酵母浸膏I9硫酸馁29磷酸氢二钾。.69磷酸二氢钾。.49氯化钠29丙二酸钠3g。.2%滇察香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH6.85.17.2制法除指示剂外，用水溶解上述成分，校正pH后再加人指示剂，分装小试管，每管2^-3mL,121℃灭菌15min，趁热放成斜面，凝固后冷藏备用。5.17.3使用方法用固体培养物沿斜面划线接种，(36士1)℃培养18^-24ha5.17.4结果观察培养基由绿变蓝者为阳性，不变色者为阴性。5.18马尿酸钠水解试验培养基is免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-20015.18.1成分马尿酸钠19肉浸液100ml5，18.2制法将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁内划一横线，121℃灭菌20min备用。5.18.3试剂三氯化铁(FeCl,·6H20)12g溶于20o盐酸中，总量为100mL5.18.4使用方法将纯培养物接种于培养基中，于42"C培养48h，取出用蒸馏水补充损失水分至刻度处，1500r/min离心5^-10min后，吸取上清液0.8mL，加人三氯化铁试剂。.2ml-,棍合均匀，静置10.15min，然后观查结果。5.18.5结果观察出现稳定不变的褐色沉淀为阳性。5.19TTC琼脂5.19.1成分胰蛋白陈17g大豆陈39葡萄糖69氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.59琼脂159L-胧氨酸一盐酸。.25g亚硫酸钠。.191%氯化血红素溶液。.5mL1写维生素K,溶液。.1mL2,3,5-氯化三苯四氮哇(TTC)0.4g蒸馏水1000mL5.19.2制法除1%氯化血红素,1%维生素K，和TTC外，混合其他成分，加热溶解。L-胧氨酸先用少量氢氧化钠溶液溶解后加人，校正pH至7.2，然后加人1%抓化血红素,1%维生素K,溶液，摇匀，分装每瓶100mL,121℃灭菌15min，作为基础培养基备用。临用前每100mL中加人TTC40mg，充分摇匀，倾注平皿，凝固后冷藏备用。5.201写甘氨酸培养基5.20.1成分胰蛋白陈10g蛋白陈10g葡萄糖工9酵母浸膏29氯化钠59焦亚硫酸钠。.19硫乙醇酸钠1.59琼脂1.6g甘氨酸10g19免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001蒸馏水1000mL5.20.2制法混合上述成分，加热溶解，调pH6.8-7.2，分装小试管，每管2-3ml,,121℃灭菌15min，放成高层，凝固后冷藏备用。5.20.3使用方法用接种针挑取菌落，穿刺接种，置微氧环境，42℃培养48h.5.20.4结果观察空肠弯曲菌在培养基表面出现云雾状生长。5.21氰化钾培养基5.21.1成分蛋白陈10g氯化钠5g磷酸二氢钾0.225g磷酸氢二钠4.59蒸馏水1000mL5%氰化钾溶液1.5m1.pH7.65.21.2制法将除氰化钾以外的成分混合，溶解后调整pH,121℃灭菌15min。待其充分冷却后每100mL中加人5%氛化钾溶液0.15mL，分装小试管，每管2^-3mL，用灭菌胶塞塞紧。同时分装不加氰化钾的培养基，作为对照。培养基冷藏备用，可使用两个月。5.21.3使用方法将琼脂培养物同时接种于氰化钾培养基和对照培养基，35℃培养2472h.5.21.4结果观察试验管和对照管均生长者为氰化钾试验阳性;对照管生长，而试验管不生长者为阴性。5.22葡萄糖铰培养基5.22.1成分氯化钠5g硫酸镁(MgS0,·7H20)0.2g磷酸二氢按19磷酸氢二钾1g葡萄糖29琼脂20g蒸馏水1000mL。.2%澳康香草酚蓝溶液40mLpH6.85.22.2制法先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化，然后加人指示剂，混合均匀后分装试管，121"C高压灭菌15min，放成斜面。5.22.3试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内作成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20-100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于(36士1)℃培养24h。阳性者葡萄糖铁斜面上有正常大小的菌落生长;阴性者不生长，但在对20免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)GB/T14926.43-2001照培养基上生长良好。如在葡萄糖钱斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注:容器使用前应用清洁液浸泡，再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意有杂质污染时，易造成假阳性结果免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载'