GBT14927.2-2008实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法.pdf 8页

'ICS65．020．30B44@雪中华人民共和国国家标准GB／T14927．2—2008代替GB／T14927．2—2001实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法2008-12-10发布Laboratoryanimal——Immunologicalmarkerofinbredmiceandrats2009-03-01实施宰瞀髁鬻瓣訾糍瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪19 法》。刖菁GB／T14927．2—2008GB／T14927共分2个部分：——第1部分为《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法》；——第2部分为《实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法》。本部分为GB／T14927的第2部分。本部分自实施之日起，代替GB／T14927．22001《实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植检测本部分与GB／T14927．2--2001相比主要技术差异如下：a)修订实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植法部分内容；b)增加小鼠H2单倍型微量细胞毒检测法；c)本部分名称修改为“实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法”。本部分附录A为资料性附录。本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。本部分主要起草人：邢瑞昌、刘双环、马丽颖、岳秉飞、鲍世民。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T14927．21994，GB／T14927．2—2001。 实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法GB／T14927．2—20081范围GB／T14927的本部分规定了近交系小鼠、大鼠皮肤移植术法和近交系小鼠H一2单倍型(Haplo—type)检测方法。本部分近交系小鼠、大鼠皮肤移植术法适用于近交系小鼠和大鼠在培育过程中遗传纯度的检查以及近交系小鼠和大鼠在繁殖饲养过程中的遗传监测。近交系小鼠H一2单倍型(Haplotype)检测方法适用于近交系小鼠培育和繁殖饲养过程中的遗传监测，主要检测H2复合体D区和K区的抗原分型。2近交系小鼠和大鼠皮肤移植术法2．1技术原理移植物在同一近交系中可以被互相接受，即同系移植(isograft)是成功的。移植物在不同近交系中互相排斥，亦即同种移植(allograft)是不成功的。F1代动物可以接受任何一个双亲的组织移植物，双亲则不能接受F1代的移植物。Fl代动物可以接受F2代以后各代动物的移植物。亲本品系可以接受某些F2代以后各代动物的移植物。但是绝大部分被排斥。本部分采用背部皮肤移植法和尾部皮肤移植法。两种方法原理相同，并具有同等标准效力。2．2背部皮肤移植法2．2．t设备和材料2．2．1．1固定板(18cm×12cm)。2．2．1．2戊巴比妥钠(医用)。2．2．1．3医用橡皮膏。2．2．1．4医用凡士林。2．2．1．5粉剂青霉素G钠(80万u，人或兽用)。2．2．1．63％碘酒棉球。2．2．1．775％酒精棉球。2．2．1．8眼科剪刀。2．2．1．9眼科镊子。2．2．1．10一次性注射器(1mL)。2．2．1．11纱布(剪成40mm长，25mm宽若干条；厚2层～3层若干块，其上涂医用凡士林及粉剂青霉素G钠)。2．2．1．12脱脂棉做成的棉球。2．2．1．13将手术器材置于高压锅内121℃、40min高压灭菌。2．2．2操作步骤2．2．2．1随机取同性别4周龄～8周龄的动物10只，动物可来自基础群或血缘扩大群。2．2．2．2每只动物分别编号并称取体重，详细记录品系名称、性别、出生年月日、谱系及其他特征。2．2．2．3用无菌生理盐水配制0．7％戊巴比妥钠溶液。2．2．2．4采用腹腔注射0．7％戊巴比妥钠溶液麻醉动物。小鼠每10g体重注射0．1mL，大鼠每20g1 GB／T14927．2—2008体重注射0．1mL。因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同，注射量可适当增减(手术时室温应控制在25℃～28℃之间)。2．2．2．5待动物麻醉失去知觉后，将其背部朝上放在固定板上，固定动物，剪去被毛，并用3％碘酒棉球和75％酒精棉球消毒。2．2．2．6在背部剪下直径5mm～10mm的皮肤左右各一块(其中一块用做自体移植，另一块用做异体移植)。2．2．2．7将剪好的皮片翻转过来放人带少量生理盐水的双碟(直径为6cm)中，用眼科剪刀，轻轻地切去皮下组织至真皮，然后放在无菌生理盐水中冲洗一下。2．2．2．8两只动物的皮片，除左侧皮片做自体移植外，右侧皮片循环交换，逆毛方向移植并使之吻合。2．2．2．9覆盖涂过凡士林和青霉素G钠的纱布块，3层～4层，用1cm宽橡皮膏固定，松紧适度。2．2．2．10手术结束待动物苏醒后，把动物放入鼠盒内，并挂上标记卡片，10d后拆除包扎。2．2．3结果观察2．2．3．1拆包后，发现皮片干瘪、脱落则为技术失败。如皮片脱痂，手术部位平整、一周后有新毛长出则为手术成功。对照自体移植，技术失败率不得大于10％。2．2．3．2如果皮片在2周～3周内脱落，则为急性排斥。遗传污染通常引起急性排斥。2．2．3．3如果皮片在3周脱落，则为慢性排斥。移植物有否慢性排斥至少观察100d，遗传突变通常引起慢性排斥。2．2．3．4如果对结果怀疑，则要进行重新移植，可以使用一批新的动物，也可以使用已做过移植但对结果产生怀疑的动物。如果是后者，则排斥更迅速、更典型。2．3尾部皮肤移植法2．3．1设备和材料2．3．1．111号手术刀柄。2．3．1．21l号手术尖刀片。2．3．1．3玻璃套管(直径8rflrfl，大鼠可适当大些)。2．3．1．4其他材料见2．2．1。2．3．2操作步骤2．3．2．1随机取同性别4周龄--8周龄的动物10只，动物可来自于基础群、血缘扩大群或生产群。2．3．2．2每只动物分别编号并称取体重，详细记录品系名称、性别、出生年月日、谱系及其他特征。2．3．2．3用无菌生理盐水配制0．7％戊巴比妥钠溶液。2．3．2．4采用腹腔注射麻醉0．7％戊巴比妥钠溶液动物，小鼠每10g体重注射o．1mL，大鼠每20g体重注射0．1mL。因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同，注射量可适当增减(手术时室温应控制在25℃～28℃之间)。2．3．2．5待动物麻醉失去知觉后，将5只一组按顺序采取仰卧式放在一块滤纸上，并用3％碘酒棉球和75％酒精棉球消毒鼠尾。2．3．2．6用左手食指按住动物尾根，左手拇指按住尾尖，固定鼠尾并使其微微伸展，然后右手持解剖刀，刃面朝上，与尾部皮肤成20。～30。夹角，在尾静脉上部或两条尾静脉之间，在离尾部5mm处削下一片宽约2mm～3mm，长约7mm～8mm的皮肤，其厚度前者以没有严重出血，后者能足以暴露出白色的肌腱但又不割伤血管为宜。2．3．2．7右手将刀片逆时针方向交给左手，附着在刀片上的皮片相应转180。，将皮片用眼科镊子取下贴在原创面上，并尽量使其吻合，用一小片滤纸覆盖，再轻轻按压一下，然后取掉滤纸片，该移植作为自体移植对照。2．3．2．8按照2．3．2．6和2．3．2．7步骤，完成另4只动物的自体移植对照。2．3．2．9按照2．3．2．6和2．3．2．7步骤，参照皮肤移植相互循环系统图示，进行循环皮肤移植。亦即2 前边鼠的第三片皮和后边相邻鼠的第二片皮进行相互交换植皮，具体操作见图1。．ZGB／T14927．2—2008注：A表示自体移植对照；圆圈中的阿拉伯数字表示编号小鼠供体的皮片。图1皮肤移植相互循环系统2．3．2．10取五支玻璃套管，分别轻轻套入动物尾巴至根部3mm处，用医用胶布在尾巴远端靠近套管处将尾巴粘住，胶布往返粘贴2圈～3圈，使套管可做轻微上下活动但不脱落。2．3．2．11套好玻璃管后，用落地手术灯照射动物大约15min～30rain。然后将动物仰躺着放入鼠盒中挂上标记卡片。2．3．2．1224h后取下套管，此时可看到皮片已粘在创面上。2．3．3结果观察2．3．3．1皮片在第一周内苍白、干瘪、脱落，则为技术失败。对照自体移植，技术失败率不得大于10％。2．3．3．2皮片在第2周至第3周内发炎、水肿、坏死、结痂直至脱落，则为急性排斥。遗传污染通常引起急性排斥。2．3．3．3皮片在第3周至第9周内逆毛逐渐脱落，直至无毛；或者因排斥留下凹陷疤痕，都为慢性排斥。遗传突变通常引起慢性排斥。2．3．3．4皮片在100d的观察期内，始终有逆毛，则为永久接受的标志。2．3．3．5如果对结果有怀疑，则要进行重新移植，以得出明确结果。3近交系小鼠H-2单倍型检测方法——微量细胞毒法3．1技术原理在免疫遗传学中，能引起强烈移植排斥反应的抗原系统称为主要组织相容性抗原系统。小鼠的主要组织相容性原系统称为H一2复合体(majorhistoc。mpatibilitycomplex，H一2complex)，是定位于第17号染色体上的一个区段。不同品系的近交系小鼠，其H一2复合体组成不同，表现在H一2单倍型的不同。H之单倍型可以通过抗原抗体反应进行判别。单克隆抗体能够特异性地与抗原进行反应，具有专一性，能够识别出对应的抗原物。利用H2复合体D区和K区所对应的单抗，通过微量细胞毒法可以判定D区和K区的类型。3．2设备与材料3．2．1单克隆抗体纯化非标记的单克隆抗体H一2Db(27—1卜13)、H一2Dd(34—58S)、H一2Dk(15-5—5．3)、H一2Kk(16+3．22．4)。3．2．2小牛血清。3．2．3补体制备2周龄～3周龄新西兰仔兔，取动脉血，4℃冰箱静置12h，3000r／min离心15min分离血清，筛选不致小鼠脾细胞死亡的兔血清，分装，70℃低温冰箱保存。3／ GB／T14927．2—20083．2．4PBSpH7．2NazHP04·12H20KH：P04NaCI蒸馏水3．2．5Hank’s液NaClMgSO。·7H20KClKH2P04NaHC03葡萄糖蒸馏水3．2．6伊红染色液(6％)曙红B(水溶性)EosinB蒸馏水3．2．7甲醛溶液(10％)1．27g0．21g3．40g至500mL8．00g0．41g0．40g0．10g1．27g2．00g至100mL0．6g至10mL甲醛1mL蒸馏水至10mL3．2．8离心机：500r／min～4000r／rain离心机。3．2．9倒置显微镜：低倍。3．2．1037℃恒温水浴箱。3．3操作3．3．1脾细胞的制备3．3．1．1取待检小鼠脾剥去脂肪等附着物。3。3．1．2置于盛有1mL10％小牛血清(9mLPBS，1mL小牛血清)的平皿中，用小镊子撕碎。3．3．1．3将此混合物转移至离心管中，再用1mL10M小牛血清清洗平皿转移至同一离心管中，静置15rain。3．3．1．4吸上清于另一离心管中，弃去沉淀。3．3．1．5离心上清液，3000r／min离心5rain。3．3．1．6弃掉上清液，保留沉淀。在沉淀中加入4．5mL蒸馏水用吸管充分吸打搅匀，从加入蒸馏水时严格计时，40s后加入0．5mLHank’S液，用吸管充分吸打搅匀，静置10rain。3．3．1．7吸上清于另一离心管中，弃掉下部沉淀团块，离-t=_,ak清液，3000r／rain离心5min。3．3．1．8弃掉上清液，保留沉淀。在沉淀中加入0．5mL20％小牛血清(8mLPBS，2mL小牛血清)。3．3．1．9细胞记数，使细胞终浓度为1x106／mL～5×106／mL。3．3．2细胞反应程序3．3．2．1采用2．0mL离心管，每一动物品系均设立空白对照和补体对照。3．3．2．2每管中加入20pL充分摇匀的细胞悬液，然后加入20pL抗体(对照管中只加20N小牛血清)充分摇匀，37℃水浴中保温15min。3．3．2．3每管加30pL补体(用20Nd、牛血清2倍稀释)，空白对照只加20％小牛血清，37℃水浴中反应30min～40rain。3．3．2．4每管中加入20pLEosin(伊红)染色液(6％Eosin用20％小牛血清等倍稀释)37℃保温10rain。 GB／T14927．2—20083．3．2．5加入20pL10％甲醛(固定液)以提高实验结果的稳定性。3．3．2．6摇匀，从每管中取细胞悬液10pL加在细胞板上，在倒置显微镜下观察结果。3．4实验结果评定3．4．1细胞形态判别阳性细胞(死亡细胞)体积较大，伊红着色后失去折光性，阴性细胞(仍存活细胞)不着色，体积较小而有折光性。3．4．2计算公式细胞死亡率死细胞数全部细胞数细胞毒指数一塞堂堂噬雎等烈羲鼍毫彝S翁赢基嚣笔禹嚣藩訾掣囊罢梁孕圭空i塑⋯⋯cz，3．4．3判别标准H一2单抗的细胞毒指数大于0．70，判为同一单倍型。常用近交系小鼠的H一2单倍型参见附录A。 GB／T14927．2—2008附录A(资料性附录)近交系小鼠}I-2单倍型常用近交系小鼠H一2单倍型见表A．1。表A．1常用近交系小鼠H-2单倍型品系H一2DH一2KH一2单倍型129b615kC3HkC57BL／6bC57BL／10bFⅦbTAlbTA2bT739bBALB／cdDBA／2dScUdd6'