GBT25887-2010奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法.pdf 7页

'lCS65．020．30B43a雪中华人民共和国国家标准GB／T25887—2010奶牛脊椎畸形综合征检测PCR．砌几P法M[ethodofPCR_I江LPfbrdetectingo叩1pl旺触bralmalf0朋mati∞in蜘cattle2011—0卜10发布2011—06—01实施宰瞀嬲紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖舌本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录c为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军。GB／T25887—2010 www.bzfxw.com奶牛脊椎畸形综合征检测PCR_RFLP法1范围本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的PcR-RFLP检测技术。本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断。2规范性引用文件GB／T25887—2010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓勋根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1奶牛脊椎畸形综合征c咖pl既vertebralmalformatj蚰indairycattle；cVM奶牛的一种常染色体隐性遗传病，主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡，患病犊牛主要症状表现为：颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。3．2SLC35A3基因SLC35A3辨ne定位于牛第3号染色体上，在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为AYl60683，全长14901bp，mRNA为981bp，由7个外显子和6个内含子组成，该基因编码核糖转运蛋白，与脊柱发育有关，是奶牛脊椎畸形综合征的致病基因。3．3限制性片段长度多态性r姻tricti蚰fra蛐蜘tlengthpoIymorphism，RFLP检测DNA用限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。4原理sLc35A3基因第四外显子中第559位碱基由G突变为T时，其对应编码的氨基酸由缬氨酸改变为苯丙氨酸，导致奶牛脊椎畸形综合征的发生。采用PcR-RFLP技术检测牛样本基因组DNA变异，即采用PcR技术扩增sLc35A3基因片段。限制性内切酶消化PcR扩增产物，电泳检测酶切产物，对sLc35A3基因进行分型，根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因。5扩增sLc35A3基因片段的引入酶切位点PcR引物5’CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA3’57GCTCTCCTCTGTAATCCCCA3’预期扩增长度为225bp。1 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25887—20106试剂和仪器6．1主要试剂水应符合GB／T6682的灭菌双蒸水。TkqDNA聚合酶及PcR缓冲液、RsnI限制内切酶及10×酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标记购自试剂公司。TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、PBs缓冲液、加样缓冲液、10％过硫酸铵、30％丙烯酰胺、10％聚丙烯酰胺、溴化乙锭、10％sDs、1m01／LTri}Hcl、o．5m01／LEDTA(pH8．o)、三氯甲烷／异戊醇(24：1)、3mol／L乙酸钠、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。6．2主要仪器冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度PcR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。7检测步骤7．1牛基因组DNA制备采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组DNA。4℃冰箱中保存备用。7．2PCR扩增及其产物检测20pLPcR反应体系：o．4pmol／L引物、o．2mmol／LdNTP、待测DNA85ng～100ng、1uT4口DNA聚合酶、10×PcR缓冲液，加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。PcR反应条件：94℃变性3min，35个循环(94℃30s，65℃30s，72℃30s)，72℃延伸10min，4℃保温2min～10min。取2“LPcR产物，2％～3％琼脂糖凝胶电泳(3v／cm～5V／cm，电泳20min～30min)，溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带。PcR扩增结果示意图见附录B中的图＆1。7．3酶切及其产物检测取16pLPcR扩增产物，加入5u限制内切酶RmI和2pL10×酶切缓冲液，加水至20pL，反应条件参见产品说明书。10％～12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(3V／cm～5V／cm，电泳3h～4h)，银染(染色方法参见附录c)。酶切图谱见附录B中的图B．2。7．4结果判定由于24bp的条带太小，以致在10％～12％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时显示不出来，但可根据225bp、201bp条带进行样本基因型判定。健康奶牛：基因型为GG型，即出现201bp一条电泳带；隐性携带者：基因型为GT型，即出现225bp、201bp两条电泳带；CVM患者：基因型为TT型，即出现225bp一条电泳带。 www.bzfxw.com附录A(资料性附录)主要试剂及配制方法表A．1主要试嗣及配制方法GB／T25887—2010试剂配制方法TE缓冲液10mmol／LTris_HCl(pH8．0)，1mmol／LEDTA(pH8．O)242gTris碱，57mL冰乙酸，100mLo．5m01／LEDTA(pH8．o)，加双蒸水定容至50×TAE缓冲液1000mL，使用时50倍稀释10％过硫酸铵称取1g过硫酸铵溶于8mL双蒸水，定容至10mL54．ogTris碱，27．5g硼酸，20mLO．5mmol／LEDTA(pH8．O)，加双蒸水定容至5×TBE缓冲液1000mL，使用时5倍稀释30％丙烯酰胺(丙烯酰胺：甲叉300mL双蒸水中溶解145g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水定容至双丙烯酰胺=29t1)500mL量取9．3mL30％丙烯酰胺，18．5mL双蒸水，7mL5×TBE，o．23mLlo％过硫酸10％聚丙烯酰胺铵，O．02mLTEMED加样缓冲液o．25％溴酚蓝(质量浓度)，40“蔗糖(质量浓度)100mL双蒸水中加人o．1gEB(10mg／mL)，搅拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，溴化乙锭(EB)锡箔包裹氯化钠8g。磷酸氢二钠1．44g，氯化钾o．2g，磷酸二氢钾o．24g加双蒸水定容至PBS缓冲液1000mL，调pH值至7．o，高压灭菌，室温保存10％sDs称取50gSDs加热溶于400mL双蒸水中，定容至500mL，高压灭菌，室温保存称取121．4gⅡs碱溶于800nlL双蒸水中，加浓盐酸调至pH8．o，定容到1ooon1L，1m01／LTris_HCl高压灭菌，室温保存称取186．1g二水乙二胺四乙酸二钠溶于800mL双蒸水中，加入氢氧化钠(约O．5mol／LEDTA(pH8．O)20g)调至pH8．0，定容到1000mL，高压灭菌，室温保存三氯甲烷／异戊醇(24：1)量取480mL三氧甲烷，加人20mL异戊醇，混匀称取408．1g三水乙酸钠溶于800mL双蒸水中，用乙酸调至pH5．2，加水定容至3m01／L乙酸钠1000mL，高压灭菌，室温保存固定液450mL双蒸水中加入50mL乙醇脱色液49z．5mL双蒸水中加入7．5mL浓硝酸染色液500mL双蒸水中溶解1g硝酸银，置棕色瓶中保存500mL双蒸水中溶解15g无水碳酸钠，加人1．32mL甲醛(o．046％)，用双蒸水定显影液容至1000mL停显液485mL双蒸水中加人15mL冰乙酸3 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载 www.bzfxw.com附录C(资料性附录)凝胶染色方法GB／T25887—2010c．1电泳完毕，取下玻璃板，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来，放人双蒸水中漂洗一次，然后浸入10％乙醇溶液固定5min～10min。c．2用1％硝酸脱色3min～8min，然后双蒸水迅速漂洗～次。c．3o．2％硝酸银晃动闭光染胶15min～25min；染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次los)，洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。c．4在染胶盒中倒人含3％碳酸钠和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。c．5注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3％的乙酸溶液，浸泡10min停显。'