GBT25878-2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法.pdf 8页

'ICS65．020．30B41蝠雪中华人民共和国国家标准GB／T25878—2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法Polymerasechainreaction(PCR)methodforinfectioushypodermalandha哪atopoieticnecrosisvirus(IHHNV)2011-0卜10发布2011-06—01实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖『吾GB／T25878—2010本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本标准主要起草人；黄健、杨冰、朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍、刘莉。 www.bzfxw.com对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法GB／T25878—2010警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PcR)检测方法的原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。sc／T7202．1—2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法sc／T7202．2—2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分：PcR检测法3原理3．1对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectioushypodermalandhaematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)粒子大小为20nm～22nm，是无囊膜二十面体，在氯化铯中的浮力密度为1．40g／mL，含线状单链DNA，长度为4．1kb，衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD、39kD、37．5kD的多肽组成。IHHNV可感染世界各地的养殖对虾，其感染细角滨对虾(Lito户en口e”s观mronr曲)会引起急性传染病和高死亡率(90％)，稚虾受到的危害最严重。IHHNv感染凡纳滨对虾(n￡o声en口e“sⅦnn口m“)会引起慢性“矮小残缺综合症”(RDs)，主要影响是患病对虾生长缓慢，畸形，受感染存活对虾终生带毒，通过垂直和水平传播。3．2技术原理IHHNV的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PcR)是以IHHNV的一段389个碱基(b)长度的特异性DNA序列作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用，经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而揭示微量IHHNVDNA的存在。4试剂和材料4．1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外，按照sc／T7202．2—2007中第5章的规定。4．2100ng／肚L引物F：5’一cGpAAC．AcA-AcC_cGA—cTT-TA_3’，一20℃保存。4．3100ng／弘L引物R：5LGGc_cAA-GAc_cAA—AAT-Ac昏AA．3’，一20℃保存。4．4阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板，一20℃保存。1 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25878—20104．5阴性对照为已知IHHNV阴性的组织样品的DNA模板，一20℃保存。4．6空白对照以无菌双蒸水为模板。5仪器和设备所需仪器设备按照sc／T7202．2—2007中第6章的规定。6操作步骤6．1反应体系的准备6．1．1PcR反应体系的准备应在洁净区完成。6．1．2PcR反应可选择25pL、50pL或100pL反应体系进行。6．1．3在PcR前区按表1的要求，加入除T叫酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。保存于一20℃。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加人相应体积的Tkq酶，混匀，即成完全的反应预混物。按1份／支分装到o．2mLPcR管中。如果PcR仪不具备热盖功能，再向各管内加入50”L液体石蜡。暂存于4℃。表1100份PcR反应预混物所需试剂组成试剂25正体系50“L体系100“L体系试剂终浓度10×PcR缓冲液(无M92+)250uL500uL1000uL1×氯化镁(25mm01／L)200uL400uL800uL2．Ommol／LdNTP(10mmol／L)100uL200“L400uL400umol／L100ng／“L引物F75uL150uL300uL3ng／止100ng／“L引物R75uL150uL300uL3ng／pL灭菌双蒸水1725uL3450uL6900uL丁hgDNA聚合酶(5u／pL)25uL50uL100uLO．05U／uL100份反应总体积2450ⅡL4900uL9800uL注1：25pL体系模板量o．5pL／反应管。注2：50pL体系模板量1pL／反应管。注3：100pL体系模板量2pL／反应管。6．2样品准备6．2．1样品的处理应在样品区完成。6．2．2样品采集的要求按sc／T7202．1—2007中附录B的规定执行。6．2．3活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg～100mg(去掉稚虾眼)。活体或冰冻的虾鳃、胃、游泳足或步足样品约5mg～100mg。活体或冰冻饵料生物样品约5mg～100mg。池底表土样品约500mg。将上述待检样品放人灭菌1．5mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的有效氯含量为3．o×101的含氯消毒剂中5min，经无PcR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品。6．3DNA的提取按照SC／T7202．2—2007中7．1．3的规定执行。6．4PcR扩增6．4．1在PcR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PcR管内加入相应体积的各样品DNA提取液，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。6．4．2将上述加有样品模板的PcR管带入PcR后区，置于PcR仪中按以下程序进行扩增：95℃2 www.bzfxw.comGB／T25878—20105min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃延伸7min，最后4℃保温。准备进行产物的电泳。6．5PcR产物电泳按照sc／T7202．2—2007中7．1．5～7．1．8的规定执行。7结果判定7．1阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现；阴性对照和阴性样品在389bp处应无条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在389bp处无特定条带出现或阴性对照在389bp处有条带出现都表明PcR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PcR检测产物序列参见附录A。7．2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。7．3阳性结果表明被检样品中存在IHHNVDNA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受IHHNV感染；对冰鲜或冰冻对虾而言，提示曾受到IHHNV感染。7．4电泳结果的分析和问题排除方法参见附录B。 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25878—20104附录A(资料性附录)对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNv)聚合酶链式反应(PcR)检测产物序列GG呲ACAACCCGACTTTATTGAAGGGACTCCCAACGGACF61CGGACGAAATGGACGGAAGGCGACTGGAAGAGAGTGAGATTGATAAACAA121CAACATGGTACACCTTCGTCATCAGAGAAAAAOCACAACCAAGAAGACTC181CGCCAAACTTCACCATTACAGATCATGGTGACCACTGGCACATCACATAC241CAACCUTAAGACCAGACATAGAGcTACAATCCTCGCCTATTT(；GGAGTT301CCAGAGCCGAAGCTGAAGCGACTACGGTACTTGrTAGAAATATCAAGAGA36lATCTTATCAGATACGGTATTGAACGGC哪CGrATTTTGGTCTTGGCCACR图A．1对虾IHHNVPCR检测产物序列ACGTATACTCTGACTAC0CTATATAGTG0TA∞∞∞∞阢∞GTATO www.bzfxw.com附录B(资料性附录)对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(ⅡⅢM，)聚合酶链式反应(P‘m)检测电渌结果分析和问题排除方法袭B．1对虾IHHNvPcR检测电泳结果分析和问题排除方法GB／T25878—2010试验结果结果判读及原因分析问题排除对虾样品阳性对照和阳性样品在389bp处有条带，阴性对1_PCR反应正常，结果有效照和空白对照无389bp条带阳性对照有条带，但分1．分子质量标准失效或加样量更换分子质量标准或增加其加样量子质量标准没有影像太少检查并更换PcR反应所用试剂以及PcR程序分子质量标准有影像，1．PcR反应失败是否正确但阳性对照无条带2．阳性对照失效更换阳性对照，重新实验清洗微量移液器，只能用PcR后区的微量移液1．微量移液器污染器取反应产物2．试剂枵染更换试剂阴性对照或空白对照清洁实验室及所用仪器设备，见sc／T7202．2—在389bp处有条带出现3．环境污染2007中的附录B禁止从PcR后区到PcR前区的交流，加强操4．操作污染作隔离阳性对照和阴性对照1．DNA提取失败或降解检查提取DNA所用试剂情况，重新试验，确认组正常，但已知带毒样品无样品新鲜程度条带2．DNA浓度过高将样品稀释10倍以上3．PCR抑制物介入稀释样品10倍以上，或重新提取DNA1-未注意热启动操作，使PcR做好热启动操作。样品先要加到PcR管盏上，分子质量标准正常，但出现非特异性扩增反应预混物预热后，短暂离心(1s～2s)以混人样阳性对照、阴性对照和样品品，迅速放回预热PcR仪中出现较多杂带或明显的弥2．酶活性、dNTP浓度或Mg件确认预混物翩备的准确性、试剂质量，对不同散区浓度差异批欢的奠重新测定最佳Mr+离子浓度3．温度控制异常检查pcR仪是否复性温度过低1．紫外观察仪故障检查紫外观察仪凝胶上无任何影像，包减少漠化乙健(髓)‘用量·将琼脂糖凝胶置于括DNA分子质量标准2．背景发红太亮清水中30min后再观察结果5 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25878—2010表B．1(续)试验结果结果判读及原因分析i习题排除3．凝胶太厚重新制作琼脂糖凝胶片凝胶上无任何影像，包括DNA分子质量标准4．电极颠倒或电泳时间过长改正电报方向，熏新加样电泳5．溴化乙锭(EB)分解失效重新配制溴化乙锭(EB)4演化乙锭(EB)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按sc／T7202．2—2007中附录B的规定执行。6'