GBT25876-2010牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法.pdf 6页

'ICS65．020．30B43a亘中华人民共和国国家标准GB／T25876—2010牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法MethodofnestedPCRforsexidentificati帆ofearlycattleembryo2011—01-10发布2011-06一01实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置本标准的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠。GB／T25876—2010 www.bzfxw.com1范围牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式PcR方法。本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定。2规范性引用文件GB／T25876—2010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1巢式PcRn幅tedpolymera鸵chainn扯tion利用两套PcR引物(巢式PcR引物对)进行两轮PcR扩增反应，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下，作为DNA模板，进行第二轮扩增。3．2职Y基因舰yg∞e哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。3．3珊B基因日BBgene卢珠蛋白基因，位于常染色体上。4原理利用巢式PcR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的sRy基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PcR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。5引物SRyl5’CTACTCCCCAACCGTCAGAAC375’AGCCCAAACCCATCAACCTA3’SRY25’CCAGGGAACTGCTTGGGTA3’5’TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3’HBB5’TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25876—20105’GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA36试剂和仪器6．1主要试剂水应符合GB／T668z中灭菌双蒸水的要求。n口DNA聚合酶及PcR缓冲液、100bp梯度DNA标记物。TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、溴化乙锭等。具体制备方法参见附录A。6．2主要仪器冷冻离心机、梯度PcR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。7检测方法7．1试样的制备与保存从待检胚胎中分离4个(或4个以上)细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放人o．5mLPcR管中，加入10pL无菌超纯水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷却后4℃离心(8228g)5min，取上清液保存于4℃冰箱中备用。7．2鼹y基因片段PcR扩增第一次扩增体系为20pL：o．8mmol／L的dNTP、2u的T丑qDNA聚合酶、o．2pmol／L的sRy基因外引物sRyl和内参照引物HBB、10×PcR缓冲液、2．5mm01／L的氯化镁，加适量双蒸水；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环结束后，72℃再延伸10min，4℃保温2min～10min。取第一次PcR扩增产物8pL，作为第二次扩增模板，同时加入10×PcR缓冲液、2．5mmol／L的氯化镁、o．8mmol／L的dNTP1．6pL，2u的T4口DNA聚合酶、o．2pm01／L的sRy基因内引物sRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20pL；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃再延伸10min，4℃保温2min～10min。7．3结果判定取5pLPcR扩增产物，1．o％～1．5％琼脂糖凝胶电泳(3V／cm～5V／cm，电泳20min～30min)，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B．1。电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物)和219bp(sRy扩增产物)条带，判定为雄性胚胎；电泳图谱中只出现558bp条带，判定为雌性胚胎。 www.bzfxw.com附录A(资料性附录)试剂和材料表A．1试剂和材料GB／T25876—2010试剂配方TE缓冲液10mmol／LTris-HCl(pH8．O)，1mmol／LEcrrA(pH8．o)10×PcR缓冲液200mInol／L1Hs—Hcl(pH8．4)，200mmol／L氯化钾，100Ⅱ脚l／L硫酸铵t15mm01／L氯化镁242．28gT^s碱，57．1mL冰乙酸，100mLO．5mol／LEDTA(pH8．o)，加双蒸水定容至琼脂糖电泳缓冲液1000mL，使用时50倍稀释加样缓冲液o．25％澳酚蓝C质量浓度)，40％蔗糖(质量浓度)。溴化乙锭100mL双蒸水中加入o．1g溴化乙锭，搅拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶，锡箔包裹、备用 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载附录B(规范性附录)sRy基因和内参基因巢式PcR产物电泳图谱与结果判断示意国M*100bp#&DNA标{己∞．Rml～4目自*性肛∞#$，＆m；58bp*镕．镕道j～8日*$性胚胎#$一检自558bP自219bpM个§*。图B1sRy基因和内参基因巢式PcR产物电泳图谱与结果判读示意图'