GBT25877-2010淀粉胶电泳同工酶分析.pdf 12页

'ICS65．150B50囝雪中华人民共和国国家标准GB／T25877—20102011—0卜10发布淀粉胶电泳同工酶分析Starchgelelectrophoresisisozymeanalysis2011—06—01实施宰瞀鳃紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌本标准的附录A、附录B、附录c、附录D和附录E均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国海洋大学、黄海水产研究所。本标准主要起草人：高天翔、张岩、韩志强、肖永双、张辉。GB／T25877—2010 www.bzfxw.com1范围淀粉胶电泳同工酶分析GB／T25877—2010本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料、仪器、抽样、分析步骤及结果判定。本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T18654．12008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB／T18654．2—2008养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法3原理利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同经催化、染色，扫描，获得各同工酶谱带、数目及吸收强度等，经比较分析，判定鱼类的遗传特性。4试剂和材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4．1水解马铃薯淀粉。4．2柠檬酸。4．3乳酸。4．4乙二胺四乙酸。4．5乙二胺四乙酸二钠。4．6苹果酸。4．7乳酸锂。4．8磷酸氢二钠。4．9磷酸二氢钠。4．10辅酶I。4．11辅酶Ⅱ。4．12吩嗪甲酯硫酸盐。4．13氯化硝基四氮唑蓝。4．14异柠檬酸三钠。4．156一磷酸葡萄糖酸钠。4．16乙醇。4．17丙酮。4．18口_萘乙酸。4．19r磷酸甘油。4．206一磷酸葡萄糖。4．21山梨糖醇。】 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25877—20104．224．234．244．254．264．274．284．294．304．314．324．334．344．354．364．374．384．39固蓝RR盐。冰乙酸。盐酸。氢氧化钠。肝素。氯化镁。3一氨甲基一吗啡啉。Tc_7．O制胶缓冲液：配制方法见附录A。Tc_8．0制胶缓冲液：配制方法见附录A。cAPM-6．0制胶缓冲液：配制方法见附录A。cAPM一7．0制胶缓冲液：配制方法见附录A。Tc-7．0电泳缓冲液：配制方法见附录B。Tc．8．o电泳缓冲液：配制方法见附录B。cAPM一6．o电泳缓冲液：配制方法见附录B。cAPM一7．o电泳缓冲液：配制方法见附录B。淀粉凝胶：配制方法见附录c。染色缓冲液：配制方法见附录D。染色液：几种常见同工酶染色液配制方法见附录E。5仪器5．1微量匀浆机。5．2高速冷冻离心机(转速12000r／min)。5．3多用电泳仪。5．4真空抽气机(泵)。5．5电炉或微波炉。5．6割胶器。5．7多层滤纸。5．8激光扫描仪。5．9pH计：精度为o．01。5．10制胶模具。5．11染色盒。5．124℃冷藏冰箱。5．13低温冰箱：冰室温度在一20℃以下。5．14恒温培养箱。5．15分析天平：精度为o．0001g。5．16电子天平：精度为o．1g。5．17摄影装置：数码照相机。6抽样6．1样品的抽样按GB／T18654．2—2008的规定执行。6．2取样取样品组织1g～2g试样，于低温冰箱中(一25℃以下)保存；对于血液试样，加肝素抗凝，于4℃2 www.bzfxw.com冰箱中保存，备用。7分析步骤GB／T25877—20107．1分析样品的制备电泳前取o．3g左右样品放人1．5mL离心管，加入等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12000r／min的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。对于血液试样，待分离出血清后上样。7．2凝胶制备凝胶制备见附录c。7．3电泳步骤用手术刀在凝胶距离边缘三分之一(约2．5cm)处切开，用适当大小的滤纸片蘸取7．1制备的样品提取液(或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁)插入切口中。上样完毕后，向电泳槽内加入电泳缓冲液，用滤纸搭盐桥，在4℃条件下以恒定电流(40mA)进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7．4染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1．3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒人染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待显色充分后，用7％的冰乙酸溶液终止反应。各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E。7．5制干胶片取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后编号保存。7．6摄影、扫描用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描。7．7结果分析7．7．1酶位点与等位基因分析根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。7．7．2群体遗传特异性多态位点比例(P)、平均杂合度观察值(H。)、平均杂合度期望值(H。)分别按式(1)、式(2)和式(3)计算：P=Nl^×100％⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)式中：P——多态位点比例；N。——多态位点数；”——检测位点总数。∑(1一∑％)H．=￡L——』l—n式中：H。——平均杂合度观察值；qi——第i个位点上第j个等位基因的纯合基因型的频率；m。——第i个位点上的等位基因总数；n——检测位点总数。 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25877—2010∑(1一∑口；)H．=上L——』生一n式中：H。——平均杂合度期望值；qi——第1个位点上第』个等位基因的纯合基因型的频率m．——第{个位点上的等位基因总数；n——检测位点总数。8结果判定8．1个体测定结果的判定按GB／T18654．1—2008中6．1的规定执行。将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合或接近标准规定的，判定为合格；凡不符合标准，或与标准规定有显著差异的，判定为不合格。8．2样品群体的判定根据8．1的判定结果，计算出被检样品合格品的百分比，用百分数表示。 www.bzfxw.com附录A(规范性附录)制胶缓冲液的配制GB／T25877—2010A．1Tc_7．0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1．09g，用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH7．o，蒸馏水定容至lL。A．2Tc_8．0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1．21g，用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH8．o，蒸馏水定容至1L。A．3cAPM-6．0制胶缓冲液柠檬酸o．42g，用蒸馏水溶解并用3一氨甲基一吗啡啉调至pH6．2，蒸馏水定容至1L。A．4cAPM一7．0制胶缓冲液柠檬酸o．42g，用蒸馏水溶解并用3一氨甲基一吗啡啉调至pH7．o，蒸馏水定容至1L。 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25877—2010附录B(规范性附录)电泳缓冲液配制B．1Tc-7．0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷16．35g，用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH7．o，蒸馏水定容至1L。B．2TC-8．0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷20g，用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至pH8．o，蒸馏水定容至1L。B．3CAPM一6．O电泳缓冲液柠檬酸8．4g，用蒸馏水溶解并用3一氨甲基一吗啡啉调至pH6．2，蒸馏水定容至1L。B．4cAPM一7．0电泳缓冲液柠檬酸8．4g，用蒸馏水溶解并用3一氨甲基一吗啡啉调至pH7．o，蒸馏水定容至1L。 www.bzfxw.com附录c(规范性附录)淀粉凝腔的配制加淀粉30g和制肢缓冲液254mL，在锥形烧瓶内混匀，加水定容至1L，加热至沸腾、完全溶解，抽气后注人制腔模具(见图c1)中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。囤c1制腔模具示意圉 www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25877—2Q10附录D(规范性附录)染色缓冲液配制D．10．2mol／LTris_HCl，pH8．0三羟甲基氨基甲烷24．22g，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8．o，蒸馏水稀释至1L。D．20．2mol／LTris-HCl，pH8．5三羟甲基氨基甲烷24．22g，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH8．5，蒸馏水稀释至1L。D．30．2mol／LTris．HCl，pH9．5三羟甲基氨基甲烷24．22g，用蒸馏水溶解并用盐酸调至pH9．5，蒸馏水稀释至1L。D．40．1mol／L磷酸缓冲液，p町．0磷酸氢二钠17．91g和磷酸二氢钠8．05g，蒸馏水溶解定容至1L。 www.bzfxw.com附录E(规范性附录)常见同工酶的染色液配制方法常见同工酶的染色液配制方法见表E．1。表E．1常见同工酶的染色液GB／T25877—2010同工酶英文名和缩写试剂浓度用量乙醇(99“)99％1mL～2mL乙醇脱alcoholdehydroena5。；T^s_HCl0．2mol／L，pH8．525mL氢酶ADHNAD基本保存溶液0．25％25mLPMs基本保存溶液0．5％0．5mL口-甘油磷酸200mg甘油醛一3一glyceraldehyde_3一ph05phateTri}HCl0．2m01／L，pH8．525mL磷酸脱dehydrogena5e；氢酶G3PDHNAD基本保存溶液0．25％25mLPMs基本保存溶液O．5％0．5mL苹果酸250mg苹果酸脱mal剖№dehyd!口冒enat。；Tr沁HCl0．2mol／L，pH9．525mL氢酶MDHNAD基本保存溶液0．25％25mLPMs基本保存溶液O．5％0．5mL乳酸锂0．6mg乳酸脱lactatedehydrogenas8；Tds-HCl0．2mol／L，pH8．525mL氢酶LDHNAD基本保存溶液O．25％25mLPMs基本保存溶液0．5％0．5mL异柠檬酸三钠25mgTris_HClO．2mol／L，pH8．025mL异柠檬酸isocitratedehydrogenase；NADP基本保存溶液O．25％25mL脱氢酶IDHP氯化镁1mol／L1．2mLPMs基本保存溶液0．5％0．5mL氧化硝基四氮唑蓝10mg乙二胺四乙酸二钠盐100mg超氧化物supero】亡idedismutas。；Tds—HClO．2mol／L，pH9．525mL歧化酶SoD乙醇2．5mLPMs基本保存溶液O．5％O．5mL蒸馏水20mL6一磷酸葡萄糖酸钠50mg磷酸葡萄phosphoglucomutas8；Tr涪HClO．2m01／L，pH8．O25mL糖变位酶PGM氯化镁1mol／L0．4mL www.bzfxw.com标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T25877—2010表E．1(续)同工酶英文名和缩写试剂浓度用量NADP基本保存溶液O．25％25mL磷酸葡萄phosphoglucomutase；糖变位酶PGM葡萄糖一6一磷酸脱氢酶25UPMs基本保存溶液0．5％O．5mL丙酮1mL固牢RR盐32mg酯酶磷酸缓冲液O．1mol／L，pH7．O20mLEST乙醇2mLr萘乙酸1％20mL苹果酸250mgTds_HClO．2mol／L，pH8．525mLmalice眦ym。}苹果酸酶氯化镁1m01／LlmLMENADP基本保存溶液0．25％25mLPMs基本保存溶液0．5％O．5mL山梨糖醇125mg山梨醇sorbit01dehydrogenase；Tds_HClO．2mol／L，pH8．025mL脱氢酶SDHNAD基本保存溶液0．25％25mLPMs基本保存溶液O．5％O．5mL葡萄糖一6一磷酸25mg6一磷酸glucose-6一phosphateTds-HClO．2mol／L，pH8．025mL葡萄糖dehydrogems8；脱氢酶G6PDH氯化镁1m01／LO．6mLPMs基本保存溶液O．5％O．5mLlO'