GBT27825-2011化学品皮肤吸收体内试验方法.pdf 9页

'ICS13．300：11．100A80a亘中华人民共和国国家标准GB／T27825—201化学口日口皮肤吸收体内试验方法Chemicals--Testmethodforskinabsorption--Invivo2011—12—30发布2012-08-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借焘中国国家标准化管理委员会厘11’ 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖肓GB／T27825--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No．427(2004)《皮肤吸收：体内试验方法》(英文版)技术性内容一致。本标准作了下列结构和编辑性修改：——增加了范围一章；一一将OECD427原文中的“引言”和“初始考虑”部分作为本标准的“引言”；——将OECD427原文中的“附录”部分作为本标准的“2术语和定义”的内容；～一计量单位统一改为我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(sAc／TC251)提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中国化工经济技术发展中心。本标准主要起草人：刘清君、李朝林、林铮、曾宪东、杨挺、张剑峰、郭明星，陈建军、赵晖、冯汉利、王振华。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27825--2011引言本标准技术性内容主要参照了经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法指南No．427(2004)，该指南提供了一套化学品皮肤吸收测试的体内试验方法。人体接触化学品主要是经由皮肤途径，而目前多数毒理学研究采用的是实验动物经口染毒方式。该指南描述的经皮吸收体内试验方法为从经口试验外推化学品经皮暴露的安全性评估提供了必然联系。化学物质需穿透多层皮肤细胞才可到达循环系统。对多数物质而言，死细胞构成的皮肤角质层决定了其穿透皮肤的速率。化学物质对皮肤的渗透性同时取决于化学品本身的亲脂性、表皮外层的厚度以及物质的相对分子质量、浓度等因索。一般而言，大鼠和兔子皮肤比人体皮肤的通透性更好，而豚鼠、猪和猴子的皮肤渗透性更类似于人类。测试化学品经皮吸收的方法包括体内、体外两种。体内试验法可提供不同物种实验动物经皮吸收的良好信息。近年来，体外试验方法也取得了进展。体外试验法中化学物质主要是透过完整或部分厚度的动物或人体皮肤到达预定的液体储存空间。体外试验法OECD试验方法指南01中另有单独描述。特定情况下，OECD皮肤吸收研究指南01可作为选择适当试验方法的参考，该文件提供了更多有关体内和体外试验方法适用性的细节。该指南描述的体内试验方法可对受试物通过皮肤进入全身各部位的穿透性进行测定，该方法已广泛应用了多年口‘7]。虽然许多情况下体外经皮吸收研究均可适用，但某些情况下只有通过体内试验研究才可提供必要的数据。体内试验方法的优点在于它采用生理和代谢完整的系统，使用多种毒性研究中普遍适用的实验动物种属，并且适当修改也可适用于其他种属。当然，该方法也存在其缺点：使用活动物，需使用同位素标记材料来获得可靠结果，难以确定皮肤吸收的早期阶段以及首选物种(大鼠)与人体皮肤渗透性存在差异。一般而言，动物皮肤透性更好，因此试验可能高估人体的经皮吸收“4⋯。此外，酸碱等腐蚀性物质也不宜进行活动物实验。Ⅱ 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围化学品皮肤吸收体内试验方法GB／T27825--2011本标准规定了化学品皮肤吸收体内试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于化学品经皮吸收的体内试验。2术语和定义下述术语和定义适用于本文件。2．1未吸收剂量unabsorbeddose染毒后，从皮肤表面淋洗下来的以及在遮盖装置上受试物的量，包括染毒过程中从皮肤表面挥发的量。2．2吸收剂量(体内)absorbeddose(invivo)去除受试部位皮肤的受试物后，包括尿液、饲养笼冲洗液、粪便、呼出气(若有测试)、血液、组织(若有收集)以及保留在尸体中受试物的量。2．3可吸收剂量absorbabledose冲洗后，留在皮肤表面或皮肤组织内受试物的量。3试验原则受试物(最好用同位素标记)施用于动物的去毛皮肤，试验设定具有代表性的一个或多个适当的剂量组。在预定的染毒时间内，适当的(非闭合、半闭合或闭合的)遮盖装置覆盖下，皮肤接触受试制备物。染毒前、染毒期间及染毒后，试验动物均在单独的代谢笼中饲养，并收集动物排泄物及呼出气；染毒期结束时，去除遮盖装置并用适当的清洁剂洗净皮肤，保留遮盖装置及清洗液以便进行分析。通常，每个剂量组内设定为几个动物组：一组在染毒期结束即处死，其他组依次在预定时间间隔后处死[2]，取样结束时处死其余动物组，收集血液、取下受试部位皮肤进行分析，并分析尸体以确定未排泄的受试物的量。采集的样品以适当的方法进行分析并对受试物的经皮吸收程度进行评估““‘9]。4试验方法4．1动物选择大鼠是最常用的种属，也可使用皮肤吸收速率与人类更相似的无毛系列品系‰”]。一般选用实验室常用品系雄性健康的成年动物。试验开始时，动物体重差别不超过平均体重的q-20％，例如，雄性大鼠的合适体重为200g～250g，尤其是在此范围的上半部分。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27825--2014．2动物数量和性别通常，由单一性别的至少四只动物构成一个试验组。试验中的每个预定时间点处死一组动物，如在染毒结束时间点(一般6h或24h)以及随后的时间点(例如48h、72h)。若已有数据表明雄性和雌性动物的经皮毒性有显著差异，则应选择更为敏感的性别，否则可任选一种性别。4．3饲养环境动物实验室的室温应为22℃士3℃，相对湿度一般为50％～60％，至少为30％，最好不超过70H(清洁期间除外)。采用人工光源，12h光照／黑暗交替。选用常规饲料进行喂养，供应充足，自由饮水。试验中(包括试验之前的适应期)，动物应在各自的代谢笼中单独饲养，尽量避免食物和水溢出容器影响试验结果。4．4动物准备试验开始前，每只动物应做好标记加以区别，并在各自的笼中饲养至少5d以适应实验室环境。然后，在染毒前约24h，将每只动物的肩和背部一定区域去毛，并用丙酮轻轻擦拭去毛皮肤表面以去除油脂。肥皂残留物有可能促进受试物的吸收，故不推荐用肥皂水洗。破损皮肤与完整皮肤的渗透性不同，应小心避免损伤皮肤。试验面积应足够大以确保能够可靠地计算每平方厘米皮肤吸收量，最好不小于10cm2，此面积对体重200g～250g的大鼠是合适的。准备好的动物再放回饲养笼备用。4．5受试物受试物是指被用来研究其渗透特性的物质。受试物最好作放射性标记。4．6受试物制备受试制备物(包括纯品、经稀释的或直接施用于皮肤的包含受试物的制备物等)应与人体或其他潜在目标种属可能的暴露一致(或者是理想的替代物)。制备过程中产生的差异应进行合理校正。必要时，受试物可溶解或悬浮于适当的赋形剂中，对于非水赋形剂，应了解其吸收特性及其与受试物的潜在反应性。4．7皮肤染毒在皮肤表面确定特定面积的受试部位，将已知量的受试制备物均匀地施用于该部位。用量一般采用人体可能的接触量，固体受试物多为1mg／cm2～5mg／cm2，液体受试物最多可达10pL／cm2。可根据预期的使用情况、研究目的或受试制备物的物理特性采用其他用量，但应有适当理由。在染毒后，受试部位应避免触碰。通常，受试部位应采用非闭合的遮盖装置覆盖(例如，通透性的尼龙纱布罩)，典型装置的示例如图1所示。某些特定情况下，受试部位应采取闭合性保护。若半挥发性物质的挥发导致受试物的回收率超出可接受的范围(另见4．10)，应在受试装置上覆盖活性炭过滤器捕获挥发的受试物(见图1)。任何装置均不得损伤皮肤，也不能吸收或与受试制备物反应。染毒后，动物被放回单独的代谢笼中以便收集排泄物。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载活性炭过滤器或纱布覆盖物螺纹帽螺纹底座氟基丙烯酸盐粘合剂胶皮肤GB／T27825--201I图1一种用于覆盖和保护受试部位皮肤的典型遮盖装置设计示例图4．8染毒时间和取样染毒期是指在皮肤开始接触受试物，至清洗去除受试物之间的时间间隔，所采用的染毒时间(一般为6h或24h)应与通常人体可能的接触时间相对应。染毒后，动物在代谢笼中保留直至预定的处死时间点。染毒结束时，对受试皮肤进行观察并记录任何可见的刺激症状。在整个研究过程中，代谢笼应可分别收集尿液和粪便，并可在“c标记的二氧化碳和挥发性的14C化合物(大于5％)产生时进行收集和定量分析。尿液、粪便和捕获液(例如，14c标记的二氧化碳和挥发性的“c化合物)应在每个取样时间点从每组中单独收集。若有足够的信息证明很少或几乎不产生放射性代谢物，则可采用开放式笼子。整个试验期间，应定期观察动物的毒性或异常反应。染毒期，从开始皮肤接触后至24h以及随后的每天，均应收集排泄物直至试验结束。一般而言，三个排泄物收集间隔即可，但某些受试制备物的特征或者现有的动力学数据可能要求更多的收集时间点。染毒结束时，从每只动物身上移去遮盖装置并单独保留以便试验分析。所有动物的受试部位皮肤应用拭子蘸取清洗剂清洗至少3次，注意避免污染其他部位，清洗剂应为肥皂水等有代表性的常用卫生清洁剂。最后，擦干皮肤，用新的干净遮盖装置覆盖受试部位皮肤，将这些动物放回单独的代谢笼，组成后面时间点的试验动物组。所有的擦洗拭子和洗液应予保留用于分析。4．9动物安乐处死各试验组的每只动物均应在规定的时间点安乐处死，收集血样，移去保护性的装置或覆盖物并进行分析。剪下每只动物的受试部位皮肤以及对应的空白对照部位皮肤，分别进行分析试验。受试部位皮肤可分层，将角质层与底下的真皮层分离，可提供受试物分布的更多信息。在染毒之后的这一时段受试物分布的试验分析，将提供其在角质层中转运的某些指征。最后清洗皮肤并安乐处死动物后，应移去保护性的覆盖物，以便于皮肤分层处理。从受试大鼠身体上环状切下受试部位的皮肤并钉在板上，将黏附性胶条贴于皮肤表面，轻压，胶条将部分角质层黏附下来。继续用胶条重复粘贴，直到胶条不再粘附于皮肤表面，表明角质层已被全部去除。将同一只动物的所有胶条合并至一个单独的容器中，加入组织消化液溶解角质层。3 GB／T27825--2011保留每只动物的尸体以便试验分析。在对动物尸体进行吸收剂量试验前，每个可能的靶组织均可被分离单独进行试验。一般而言，仅对尸体的总含量进行分析即可，若有其他研究提示，也可将靶组织分离进行单独试验。动物安乐处死时，膀胱中的尿液应合并到之前收集的尿液中。此外，收集了代谢笼中的粪便后，笼子和捕获装置均应采用合适的溶剂冲洗并收集，其他潜在的受污染仪器也应该进行类似的处理。4．10分析所有试验均应达到足够的回收率(例如，平均100％士10％的放射性)，超出回收率范围的应说明理由。每个样品所使用的剂量应采用适宜、有效的方法进行分析。统计分析应考虑测定每个剂量组的平行样之间的偏差。5试验数据和报告5．1试验数据应对每一只动物在每一取样时间点的受试物和(或)代谢物进行以下测定(除单个动物的数据外)以便计算吸收剂量、未吸收剂量和可吸收剂量，且不同取样时间点的数据均应按组报告其平均值：——保护用具上的量；——从皮肤上清除下来的量；——在皮肤上／内、不能从皮肤上洗下的量；——血样中的量；——粪便和呼出气中的量(如适用)；——保留在尸体和取下单独试验的器官上的量。在粪便、呼气、血样和尸体中的受试物和(或)代谢物的量，用于确定每个时间点的吸收总量，从而计算出染毒后每平方厘米皮肤吸收受试物的量。5．2试验报告试验报告应符合试验方案所规定的要求，包括所用试验系统合理性，具体有以下几方面：a)受试物：——识别数据[例如，化学文摘服务杜(ChemicalAbstractsService，cAs)编号、来源、纯度(放射化学纯度)、已知的杂质、货号]；——物理性质，理化性质(例如，pH值、挥发性、可溶性、稳定性、分子质量和lgP。。)。b)受试物的制备：——配方和使用的理由；——受试物制备详细过程、使用的量、达到的浓度、赋形剂、稳定性和均一性。c)受试动物：——使用的种属／系；——动物的数量、年龄和性别；——动物的来源、饲养环境、饲料等；——试验开始时每只动物的体重。d)试验条件：4 GBIT27825--2011——染毒的详细过程(受试部位、分析方法、闭合／非闭合、体积、提取、检测)——食物和水质的详细说明。e)试验结果：——任何毒性症状；——吸收数据列表(以速率、数量和百分比表示)}——试验的总体回收率；——结果的解释，与该受试物经皮吸收的已有数据进行比较。f)结果的讨论。g)结论。 GB／T27825--201参考文献[1]OECD(2004)．TestGuideline428：Skinabsorption：invivoMethod．OECD，Paris[23OECD(2004)．GuidanceDocumentfortheConductofSkinAbsorptionStudies．OECD，Paris[3]ECETOC(1993)．PercutaneousAbsorption．EuropeanCentreforEcotoxicologyandToxi—cologyofChemicals，MonographNo．20[4]ZendzianRP(1989)．SkinPenetrationMethodsuggestedforEnvironmentalProtectionAgencyRequirements．J．Am．Coll．Toxic01．，829—835[5]KemppainenBW，ReifenrathWG(1990)．Methodsforskinabsorption．CRCPressBocaRaton．FL．USA[6]EPA(1992)．DermalExposureAssessment：PrinciplesandApplications．ExposureAssess—meritGroup，OfficeofHealthandEnvironmentalAssessmentE73EPA(1998)．HeahhEffectsTestGuidelines，0PPTs870-7600，DermalPenetration．C)ffieeofPrevention，Pesticides，andToxicSubstances[83BronaughRL，WesterRC，BucksD，MaibachHIandSarasonR(1990)．Invivopercutaneousabsorptionoffragranceingredientsinrhesusmonkeysandhumans．Fd．Chem．Toxic．28：369—373Eg]FeldmanRJandMaibachHI(1970)．Absorptionofsomeorganiccompoundsthroughtheskininman．J．Invest．Dermat01．54：399—4046'