GBT27830-2011化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法.pdf 9页

'ICS13．300；11．100A80@亘中华人民共T-n国国家标准GB／T27830—2011化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法Chemicals--Testmethodofinvitroskincorrosion--Humanskinmodeltest2011—12-30发布2012-08-01实施宰瞀徽鬻瓣訾辫瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚罱GB／T27830--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织OECD化学品测试指南No．431(2004年)《体外皮肤腐蚀：人体皮肤模型试验》(英文版)技术性内容一致。本标准作了下列结构和编辑性修改：——增加了范围一章；——将OECD431原文中的“介绍”和“初步考虑”的内容作为本标准的引言；一将OECD431原文附录中的“定义”作为本标准的“2术语和定义”；——将OECD431原文中的表2作为本标准的“附录A(资料性附录)”；一计量单位改成我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC／TC251)提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中国化工经济技术发展中心。本标准主要起草人：刘清君、王晓兵、慈颖、程树军、杨挺、许崇辉、焦红。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27830--2011引言皮肤腐蚀性是指皮肤接触受试物后导致的不可逆的组织损伤(根据GHS定义o]，本标准提供了一种无需活体动物或动物组织进行皮肤腐蚀性评价的方法。皮肤腐蚀性评价通常需要使用实验动物”]。考虑到实验中动物遭受的痛苦和伤害，2002年，OECD试验指南《化学品急性皮肤刺激性和腐蚀性}(TG404)的修订版和附件中提出允许使用体外替代方法测试皮肤腐蚀性，以避免动物遭受痛苦和伤害。我国GB／T21604--2008等同采用了该方法。完全代替指南404(或GB／T21604--2008)体内皮肤腐蚀性试验的主要困难是缺少正式的、独立的和经过验证的体外试验方法。某项替代方法能够按照法规的目的用于皮肤腐蚀替代试验，第一步需要进行前验证研究啪，接下来是进行评价体外皮肤腐蚀试验方法“‘51的正式验证研究“”。根据这些研究的结果和其他出版的文献o]，推荐使用以下试验来进行体内皮肤腐蚀性的评估：人体皮肤模型试验(见本标准)和经皮电阻试验(见TG430)[10la]。验证研究表明使用人体皮肤模型试验能很好地区分已知的皮肤腐蚀物和非皮肤腐蚀物o‘5Ⅲ。还可为区分严重和次严重皮肤腐蚀性提供信息。本标准描述的试验方法能鉴定腐蚀性化学物质和混合物。结合其他已有的信息(如pH、结构活性关系、人体和／或动物资料)”2’13。“]，通过证据权重分析，本标准还可以进一步鉴定非腐蚀性物质和混合物。本标准通常不能提供受试物皮肤刺激性的足够信息，也不能按照GHS系统对腐蚀性物质进行进一步分类”2’13。“]。为了全面评价单次皮肤暴露后的局部皮肤反应。建议按照GB／T21604200801和GHS提供的序列试验策略方案“3进行实验。序列试验策略包括在考虑进行活体动物试验前，先进行体外皮肤腐蚀(如本标准)和皮肤刺激试验。Ⅱ 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法GB／T27830--2011本标准规定了化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法和数据与报告。本标准适用于化学品皮肤腐蚀的筛选和检测，可作为化学品皮肤腐蚀动物试验的替代方法之一。还可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于化学物质毒性的整体评价。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2．1体内皮肤腐蚀skincorrosioninvivo皮肤接触受试物4h后产生的不可逆损伤，即从表皮到真皮出现了可见性坏死。腐蚀性作用的特征有：溃疡、出血、血性结痂，14d后表现为皮肤萎缩褪色、局部斑秃和结痂等改变。对于可疑的皮肤损伤要进行组织病理学检查。2．2细胞活性cellviability测定细胞群总体活力的指标[如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝(3一(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑溴盐，MTT)(CASNo．298—93—1)的能力]，指标的测定取决于试验终点和所用的设计方案，并与细胞总数和／或活性细胞数量相关。3试验原理受试物局部作用于一个三维人体皮肤模型，所用模型至少是一个包含功能性角质层的重建表皮。根据在特定作用时间内，受试物使细胞活性(如MTT还原法测定)‘“1降低到设定的阈值水平来识别腐蚀性物质。人体皮肤模型试验的原理是建立在腐蚀性化学物质暴露皮肤后通过扩散作用或腐蚀作用穿透角质层，对其下面的细胞层产生细胞毒性作用的这一假设基础上。4试验方法4．1人体皮肤模型人体皮肤模型可以自己构建或通过商业途径获得[t6-tg]或由实验室开发制备[2“2“。人体皮肤的使用应满足本国和国际伦理道德的要求。任何新的皮肤模型都应经过验证(至少达到4．3的要求)。本试验所用的人体皮肤模型应满足4．2和4．3所列的条件。4．2皮肤模型的一般条件4．2．1应使用人体角质形成细胞构建皮肤模型的上皮，功能性的角质层下面应含有多层有活性上皮细】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27830--2011胞。皮肤模型可以具有一个基质层。角质层应是含有必需脂质成分的多层结构，以形成功能性屏障抵抗细胞毒性物质的快速渗透。4．2．2模型的封闭特性应可以阻止角质层周围的物质进入蓟活性组织内部。理想的皮肤模型其角质层周围应不存在受试物进入活性组织的通道，否则无法模拟皮肤暴露的实际情况。4．2．3皮肤模型应避免被细菌(包括支原体)和真菌污染。4．3皮肤模型的功能性条件4．3．1细胞活性范围可用MTT或其他代谢转换有关的活体染料进行定量测定。试验中，从阴性对照的皮肤组织提取或溶解的染料的光密度(D)值至少应是单独使用溶剂提取的D值的20倍o“。阴性对照的皮肤组织应能在测试期间保持稳定培养(组织活性保持稳定)。4．3．2角质层应能充分阻止某些细胞毒性化学物(如1％TritonX-100)的快速渗透。该性能可以通过使细胞活性降低50％(ETs。)的暴露时间来评估。4．3．3皮肤模型组织最好在不同实验室间、长时间内显示出良好的重复性。而且，根据所选的试验方案，该皮肤组织可预测附录A的表A．1所列参考化学品的腐蚀性。4．4受试物处理4．4．1每个处理组(包括对照组)使用两个相同的皮肤组织，对于液体受试物，液体用量应足以完全覆盖皮肤表面，最小用量为25pL／cm2。对于固体受试物，用量应足以均匀覆盖皮肤表面，可用去离子水或蒸馏水溶解以保证与皮肤良好暴露。条件允许的情况下，固体受试物应研磨成粉末后使用。处理的方式应适合于该受试物。处理结束后，使用适当的缓冲液或0．9％NaCl溶液小心地洗去皮肤表面的受试物。4．4．2每次试验均需同时设阳性和阴性对照试验，以确保试验模型的正常运行。推荐使用冰醋酸或8mol／L氢氧化钾(KOH)作为阳性对照物。阴性对照物为0．9％NaCl溶液或水。4．5细胞活性检测4．5．1只有定量有效的检测方法才能被用于测定细胞活性，而且，细胞活性的检测方法应与三维组织构建时的检测方法一致。非特异性染料的结合不能干扰细胞活性的检测。能与蛋白结合的染料和那些不能被代谢转化的染料(如中性红)不适用于本试验。最常用的方法是MTT还原法。MTT还原法结果精确并具有可重现性，也可选用其他方法。4．5．2将皮肤样品置于适当浓度(如0．3mg／mL～1mg／mL)的MTT溶液中，在适当温度下温育3h，然后用溶剂(异丙醇)提取蓝色甲瓒还原产物，通过在波长540nm～595nm范围内测定D值来确定甲瓒的浓度。4．5．3如果受试样品通过清洗没有完全从皮肤表面除去时，受试物与活性染料发生化学作用可能会模拟细胞代谢的情形，进而导致对细胞活性的错误判断。如果受试物直接作用于活体染料，则应另设对照组来检测和校正受试物对细胞活性测定结果的干扰。4．6结果解释4．6．1阴性对照组的细胞相对活性设定为100％，每一个试验样品得到一个OD值，用该值与阴性对照相比得出的百分比表示细胞相对活性。应明确记录用于区别腐蚀物与非腐蚀物(或区别不同程度的腐蚀物)的细胞活性的临界百分率，或用于评价结果及鉴别腐蚀物的统计程序，并且其合理性需得到确认。通常，这些临界值是在试验方法优化期间建立，前验证阶段测试和正式验证研究中得到确认。4．6．2如采用了相关商业化模型，其进行腐蚀性预测的结果解释参照该商业化模型的使用说明书。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载5数据与报告GB／T27830--2015．1数据每个组织的所有数据结果都应以表格形式记录，如：D值和计算得到的受试物、阳性对照和阴性对照的细胞活性百分率，包括重复试验的数据、平均值和单个数值。5．2试验报告试验报告内容应包括：a)受试物和对照组：——一化学名称，如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)命名或化学文摘(CAS)名称和CAS索引号(如已知)；～化学物质或制剂的纯度和组成(质量分数)；一理化性质，如与本研究内容相关的物理状态、pH值、稳定性、水溶性；一一试验开始之前对受试物／对照物的适当处理(如加热、研磨)；——稳定性(如已知)。b)说明所用皮肤模型和实验方法的理由。c)测试条件：——所用的细胞系统；——测定细胞活性所用仪器(如分光光度计)的校准信息；——包括验证在内的试验所用皮肤模型的全部支持信息；——试验操作步骤的细节；——受试物使用剂量；——对试验步骤所做的任何修改的说明；——皮肤模型的历史参考资料；——评价标准的描述。d)结果：——每个受试样品的数据表格；——其他观察结果的说明。e)结果讨论。f)结论。 GB／T27830--2011A．1推荐的参考化学物质见表A．1。附录A(资料性附录)参考化学物质表A．1参考化学物质化学物美国化学文摘服务社登记号腐蚀性1，2二氨基丙烷CAS_No．78—90—0强腐蚀性丙烯酸CAS_No．79—10—7强腐蚀性2一叔丁基苯酚CAS_No．88—18—6腐蚀性氢氧化钾(10％)CA导No．1310—58—3腐蚀性硫酸(10％)CAS矗No．7664—93—9腐蚀性正辛酸CA孓No．124—07—02腐蚀性4一氨基一1，2，4三唑CA孓No．584—13-4无腐蚀性丁子香酚CAS-No．97—53—0无腐蚀性苯乙基漠CAS_No．10363—9无腐蚀性四氯乙烯CAS_No．127—18—4无腐蚀性异十八(烷)酸(硬脂酸)CAS_No．30399—84—9无腐蚀性4-(甲硫基)一苯甲醛CA孓No．3446—89—7无腐蚀性注：表中所列大部分化学物质来自欧洲替代方法验证中心(ECVAM)为国际验证研究选择的化学品目录“1。化学物质的选择基于以下标准：a)腐蚀性物质和无腐蚀性物质数量相等。b)涵盖大多数化学品种类，并且可经商业途径获得。c)包括严重腐蚀性和弱腐蚀性两类物质以区分腐蚀强度。d)所选化学品应易于实验室管理，除具腐蚀性外无其他严重危害。4 参考文献GB／T27830--2011E13OECD(2001)HarmonisedIntegratedClassificationSystemforHumanHealthandEnviron—mentalHazardsofChemicalSubstancesandMixtures．OECDSeriesonTestingandAssessmentNum—ber33．ENV／JM／MONO(2001)6，Parishttp：／／www．olis．oecd．org／01is／2001doc．nsf／LinkTo／env-jm-mono，2001，6r21oECD(2002)．OECDGuidelineforTestingofChemicals．No．404：AcuteDermalIrritation，Corrosion，一revisedTestGuidelineasadopted24April2002，7PPplusAnnexes[3]Botham，P．A．，Chamberlain，M．，Barratt，M．D．，Curren，R．D．，Esdaile，D．J．，Gardner，J．R。，Gordon，V．C．，Hildebrand，B．，Lewis，R．W．，Liebsch，M．，Logemann，P．，Osborne，R．，Ponec，M．，Regnier，J．F．，Steiling，W．，Walker，A．P．，andBalls，M．(1995)．Aprevalidationstudyoninvitroskincorrosivitytesting．ThereportandrecommendationsofECVAMWorkshop6．ATLA一23：219—255[43Barratt，M．D．，Brantom，P．G．，Fentem，J．H．，Gerner，I．，walker，A．P．，andWorth，A．P．(1998)．TheECVAMinternationalvalidationstudyoninvitrotestsforskincorrosivity．1．Selectionanddistributionofthetestchemicals．Toxie．inVitro12：471-482[53Fentem，J．H．，Archer，G．E．B．，Balls，M．，Botham，P．A．，Curren，R．D．，Earl，L．K．，Esdaile，D．J．，Hoizhutter，H．一G．，andLiebsch，M．(1998)．TheECVAMinternationalvalidationstudyoninvitrotestsforskincorrosivity．2．ResuhsandevaluationbytheManagementTeam．Toxic．inVitro12：483—524[63oECD(1996)．FinalReportoftheOECDworkshoPonHarmonizationofValidati013．andAcceptanceCriteriaforAlternativeToxieologiealTestMethods，一62pp[73Balls，M．，Blaauboer，B．J．，Fentem．J．H．，Bruner．L．，Combes，R．D．，Ekwall，B．，Fielder．R．J．，Guillouzo，A．，Lewis，R．W．，Lovell，D．P．，Reinhardt，C．A．，Repetto，G．，Sladowski．D．，Spiel—mann，H．，andZucco，F．(1995)．Practicalaspectsofthevalidationoftoxicitytestprocedures．There—portandrecommendationsofECVAMworkshops．ATLA23：129—147[8]ICCVAM(InteragencyCoordinatingCommitteeontheValidationofAlternativeMethods)．(1997)．ValidationandRegulatoryAcceptanceofToxicologicalTestMethods．NIHPublicationNo．97—3981．NationalInstituteofEnvironmentalHeahhSciences。ResearchTrianglePark，NC，USA．http：／／iecvam．niehs．nih．gov／docs／guidelines／validate．pdf[93Liebseh，M．，Traue，D．，Barrabas，C．，Spielmann，H．，Uphill，P．，wilkins，S．，McPherson，J．P．，Wiemann，C．，Kaufmann，T．，Remmele，M．andHolzhiitter，H．一G．(2000)．TheECVAMpreval—idationstudyontheuseofEpiDermforskincorrosivitytesting．ATLA28：371—401r10]ECVAM(1998)．ECVAMNews＆Views．ATLA26；275—280r11]ECVAM(2000)．ECVAMNews＆Views．ATLA28：365—67[12]ICCVAM(InteragencyCoordinatingCommitteeontheVMidafionofAlternativeMethods)．(2002)．ICCVAMevaluationofEpiDermTM，EPISKINTM(EPI-200)，andtheRatSkinTranscutaneousEleetricalResistance(TER)assay：InVitrotestmethodsforassessingdermalcorrosiv—itypotentialofchemicals．NIHPublicationNo．02—4502．NationalToxicologyProgramInteragencyCenterfortheEvaluationofAhernativeToxicologiealMethods．NationalInstituteofEnvironmentalHealthSciences，ResearchTrianglePark，NC，USA．http：／／iccvam．niehs．nih．gov／methods／epiddocs／epis——brd．pdf[13]OECD(2002)ExtendedExpertConsultationMeetingonTheInVitroSkinCorrosionTest5 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